分布

In vitroにおいて，[¹⁴

C]-Org 25969

の血漿タンパク及び赤血球結合，並びに

Org 25969

が[³

H]-ロ

クロニウムの血漿タンパク及び赤血球結合に及ぼす影響を検討した．さらに，Wistar 白色ラット

（組織分布），

Lister Hooded

有色ラット（組織分布），妊娠

Sprague Dawley

ラット（胎盤通過），及 び妊娠

NZW

ウサギ（胎盤通過）を用いて，

[

¹⁴

C]-Org 25969

の分布を検討した．若齢成熟ラット及 び妊娠ラット，並びに妊娠ウサギにおいて，

Org 25969

が[³

H]-ロクロニウムの組織分布に及ぼす影

響をin vivoで検討した．さらに，ラットを用いて，[¹⁴

C]-Org 25969

の骨及び歯への結合特性を定

量的に評価する試験及びロクロニウムが[¹⁴

C]-Org 25969

の骨及び歯への結合率に及ぼす影響を検 討した．

2.6.4.4.1

In vitro分布試験

2.6.4.4.1.1 ラット，ウサギ，ネコ，イヌ及びヒトにおける

in vitro での血漿タンパク結合

【NL0046285，4.2.2.3.1】

In vitroにおいて，[¹⁴

C]-Org 25969

のラット，ウサギ，ネコ，イヌ及びヒトの血漿タンパクへの

結合率を検討した．さらに，本試験では共存する

Org 25969

が[³

H]-ロクロニウムの結合率に及ぼ

す影響も評価した．いずれの動物種でも雄性／男性から採取した試料を用いた．

試験方法：[¹⁴

C]-Org 25969

のタンパク結合

Org 25969

を添加した血漿サンプル（薬物濃度：0～125 µM，臨床濃度域であるおよそ

0～

250 µg/mL

に相当）を，等濃度の

Org 25969／[

¹⁴

C]-Org 25969

を含む

pH 7.4

のリン酸緩衝液に対し て

37℃で 3

時間平衡透析を行い，

[

¹⁴

C]-Org 25969

の血漿タンパク結合率を測定したⁱⁱ．また，

1.25 µM

の

Org 25969

と約

185 kBq/mL

（27.6 µMに相当）の[¹⁴

C]-Org 25969

を含むヒト血漿

1.0 mL

を

HPLC

分析することにより，結合タンパク画分を評価した．

試験方法：[³

H]-ロクロニウムのタンパク結合

ウサギ血漿を用いて，平衡透析法により[³

H]-ロクロニウムの血漿タンパク結合率を測定した（他

の動物種に関するロクロニウムのタンパク結合率は別試験で測定した）．ロクロニウム（0～

11.1 µM，臨床濃度域であるおよそ 0～5.9 µg/mL

に相当）と

1.85 kBq/mL

の[³

H]-ロクロニウムを添

加した血漿サンプルを，等濃度の[³

H]-ロクロニウムを含む pH 7.4

のリン酸緩衝液に対して

37℃で 3

時間透析した．

試験方法：Org 25969存在下での[³

H]-ロクロニウムのタンパク結合

ラット，ウサギ，ネコ，イヌ及びヒト血漿を用いて，平衡透析法により

Org 25969

存在下にお

ける[³

H]-ロクロニウムの血漿タンパク結合率を測定した．[

³

H]-ロクロニウム（0.24～11.1 μM／

ii 被験物質をバッファー側に添加して血漿側と平衡化させる方法では平衡に達するまで長時間（6時間以上）を 要したため，このような試験方法とした．平衡に達するまでに時間がかかったのは，Org 25969のタンパク結合 率がきわめて低く，また比較的大きい分子量のために半透膜透過が遅いためと考えられる．

1.85 kBq/mL，およそ 0.13～5.9 µg/mL

に相当）と

Org 25969

（濃度域：

0～12.5 µM，およそ 0～25 µg/mL

に相当）を添加した血漿サンプルを，等濃度の[³

H]-ロクロニウムと Org 25969

を含むリン酸緩衝 液に対して

37℃で 3

時間透析した．

結果

ラット，ウサギ，ネコ，イヌ及びヒト血漿を[¹⁴

C]-Org 25969

とインキュベートすると，3 時間 後に血漿サンプルと[¹⁴

C]-Org 25969

を添加した緩衝液サンプルが平衡に達した．ラット血漿／緩 衝液との

3

時間のインキュベーション後，

[

¹⁴

C]-Org 25969

の放射化学的純度は≧99%から≧84%に 減少した．[¹⁴

C]-Org 25969

はラット，ウサギ，ネコ，イヌ及びヒト血漿タンパクに結合しなかっ た．

[

¹⁴

C]-Org 25969

を添加したヒト血漿の

HPLC

分析では，

Org 25969

はタンパク質と同時に溶出 せず，そのため

Org 25969

とヒト血漿タンパクとの特異的結合はないことがわかった．[³

H]-ロク

ロニウムのウサギ血漿タンパクへの結合率は，薬物濃度に依存しなかった（33.8±4.4%，平均±

標準偏差）．Org 25969存在下で[³

H]-ロクロニウムはラット，ウサギ，ネコ，イヌ及びヒト血漿タ

ンパクに結合するが，試験したすべての動物種において，Org 25969 の濃度を増加させると[³

H]-ロクロニウムの血漿タンパク結合率は低下した（表 2.6.4-19及び図 2.6.4-5）．ロクロニウムと

Org 25969

の濃度がほぼ等モルとなったときに，[³

H]-ロクロニウムの結合率は 0%となった．した

がって，Org 25969／ロクロニウム包接体も血漿タンパクに結合しないと考えられた．

表 2.6.4-19 ロクロニウム／Org 25969比

0～1.1

で

Org 25969

が存在するときの ロクロニウムの血漿タンパク結合率

動物種 Org 25969／ロクロニウム比 タンパク結合率 (%) ^a) ラット 0 ～ 1.1 38.2 ～ 0

ウサギ 0 ～ 1.1 29.6 ～ 0

ネコ 0 ～ 1.1 43.1 ～ 0

イヌ 0 ～ 1.1 27.4 ～ 0

ヒト 0 ～ 1.1 37.4 ～ 0

a) 計算結果が負の値となった場合は，結合率をゼロとした．

0 10 20 30 40

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

ratio Org 25969 / Org 9426

% Protein binding [3H]-Org 9426

Org 25969／ロクロニウム 比 [3H]-ロクロニウムのタンパク結合率（%）

0 10 20 30 40

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

ratio Org 25969 / Org 9426

% Protein binding [3H]-Org 9426

Org 25969／ロクロニウム 比 [3H]-ロクロニウムのタンパク結合率（%）

2.6.4.4.1.2 ラット，ウサギ，ネコ，イヌ及びヒトにおける

in vitroでの赤血球結合

【NL0047787，4.2.2.3.2】

赤血球結合試験では，in vitroにおいて[¹⁴

C]-Org 25969

のラット，ウサギ，ネコ，イヌ及びヒト 赤血球結合率を測定した．さらに，[³

H]-ロクロニウムの結合率，及び

in vitroにおいて

Org 25969

が[³

H]-ロクロニウムのヒト赤血球結合率に及ぼす影響も検討した．いずれの動物種でも雄性／男

性から採取した試料を用いた．

ラット，ウサギ，ネコ，イヌ及びヒト血液サンプルに，薬物濃度が

0～250 µM（想定される臨

床濃度域であるおよそ

500 µg/mL

に相当）となるように[¹⁴

C]-Org 25969（2.9～3.3 kBq/mL）を添

加し，[¹⁴

C]-Org 25969

の赤血球結合率を測定した．また，ヒト血液を

3.1 µM

の [³

H]-ロクロニウ

ム（3.9 kBq/mL）とインキュベートし，ヒト赤血球へのロクロニウムの結合率を測定した．さら に，0.8～12.4 µMの

Org 25969

が [³

H]-ロクロニウム（3.1 µM，4.1 kBq/mL）のヒト赤血球結合率

に及ぼす影響を検討した（濃度は代表的臨床濃度域である）．インキュベーションは

37℃で 60

分 行い，インキュベーション前後にはヘマトクリット値を測定して赤血球のインテグリテリィを検 査した．

試験結果【表

2.6.5.6.B】から，以下の結論を得た．In vitro

において，Org 25969は薬物濃度及 びインキュベーション時間によらずラット，ウサギ，ネコ，イヌ及びヒト赤血球に結合しなかっ た．ロクロニウムは，インキュベーション時間によらずヒト赤血球に結合せず，種々の濃度の

Org 25969

共存下でも同様にロクロニウムの赤血球への結合は認められなかった．なお，試験した

濃度範囲で（Org 25969，ロクロニウム，及び

Org 25969／ロクロニウム包接体で，それぞれ 250 µM，

3.1 µM

及び

12.1 µM：3.1 µM

まで）溶血は認められなかった．

2.6.4.4.1.3

In vitroにおけるラット肝細胞への取り込み【NL0053972，4.2.2.3.3】

In vitroにおいて，3時間のインキュベーション中に[¹⁴

C]-Org 25969

のラット肝細胞取り込みを

検討した【表

2.6.5.6.C】．

95%O

₂／5% CO₂の条件下，

0.1%ウシ血清アルブミン添加 Williams E

培地で懸濁した用時採取雄 性ラット肝細胞約

6

又は

100 µM

（12又は

200 µg/mL

に相当）の[¹⁴

C]-Org 25969

（39 MBq/L）と

4℃

又は

37℃で 3

時間インキュベートした．

0～180

分までの様々な時点で，細胞の放射能取り込み及 び生存能を検討した．また，放射性標識化物質の安定性及び薬物に曝露しないときの肝細胞の生 存能も検討した．

4℃及び 37℃において，[

¹⁴

C]-Org 25969

とのインキュベーション開始後

1

時間はラット肝細胞

の生存率が一定であり（約

76%），その後，生存率は 4℃では 2

時間及び

3

時間のインキュベーシ ョンでそれぞれ

75.5%及び 74.9%へわずかに低下し， 37℃ではそれぞれ 73.1%及び 72.3%へ非常に

緩徐に低下した．インキュベーション開始後

1

時間は肝細胞の生存能力が一定であるため，

Org 25969

取り込みが十分測定できる．Org 25969 は

100 µM

まで細胞毒性を示さなかった．

[

¹⁴

C]-Org 25969

の放射化学的純度はすべての対照反応混合物中で

90～95%であり，いずれの反応

条件でも

180

分間安定していた．さらに，ラット肝細胞との

3

時間のインキュベートにおいて代 謝物は生成されなかった．

最高

2.4%の細胞外 Org 25969

がラット肝細胞に取り込まれていることから，細胞外

Org 25969

の量が

Org 25969

取り込み能及び速度を制限しているわけではない．6及び

100 µM

の

Org 25969

と雄性ラット肝細胞を

4℃で 3

時間インキュベートしたところ，それぞれ

13

及び

83 pmol/mg

protein

の

Org 25969

がラット肝細胞に取り込まれた．37℃でインキュベートした場合の雄性ラッ

ト肝細胞による

Org 25969

取り込み量は，6及び

100 µM

でそれぞれ

20

及び

95 pmol/mg protein

で あった．4℃及び

37℃におけるラット肝細胞への Org 25969（6

及び

100 µM）の取り込み量の経時

変化を図 2.6.4-6に示す．

0 30 60 90 120

0 30 60 90 120 150 180

Time (minutes)

Uptake (pmol/mg protein)

(4°C, 6 µmol/L)) (37°C, 6 µmol/L) (4°C, 100 µmol/L) (37°C, 100 µmol/L)

時間（分）

取り込み量（pmol/mgprotein）

4℃，6 µM

4℃，100 µM 37℃，100 µM

37℃，6 µM

0 30 60 90 120

0 30 60 90 120 150 180

Time (minutes)

Uptake (pmol/mg protein)

(4°C, 6 µmol/L)) (37°C, 6 µmol/L) (4°C, 100 µmol/L) (37°C, 100 µmol/L)

時間（分）

取り込み量（pmol/mgprotein）

4℃，6 µM

4℃，100 µM 37℃，100 µM

37℃，6 µM

図 2.6.4-6

4℃及び 37℃におけるラット肝細胞への 6

及び

100 µM

の

Org 25969

の取り込み

100

及び

6 µM

の

Org 25969

の取り込み量には，それぞれ約

15

分又は

30

分まで直線性が認めら

れた．4℃及び

37℃における Org 25969

（6及び

100 µM）のラット肝細胞への 1

時間あたりの取り 込み速度を曲線の直線部から求めた．

以上より，次の結論を得た．Org 25969のラット肝細胞への取り込みは比較的少なかった．

37℃

における

6

及び

100 µM

の

Org 25969

の直線部での取り込み速度は，それぞれ

22.15

及び

235.62 pmol/mg protein/h

であった．反応温度を

4℃に低下させると直線部での Org 25969

の取り込 み速度が

6

及び

100 µM

でそれぞれ

5.87

及び

166.14 pmol/mg protein/h

に低下したことから，取り 込みは少なくとも部分的な受動輸送によることがわかった．

2.6.4.4.2

In vivo分布試験

2.6.4.4.2.1 ラット組織分布【NL0056358，4.2.2.5.1】

Wistar

白色ラット及び

Lister Hooded

有色ラット（いずれも雄性及び雌性）において，

[

¹⁴

C]-Org 25969

又は[³

H]-ロクロニウム単独静脈内投与後，あるいは[

³

H]-ロクロニウム静脈内投与

後

5

分又は

15

分に

Org 25969

を静脈内投与したときの組織分布を検討した．

Org 25969

の組織分布（[¹⁴

C]-Org 25969

単独投与）

結果を表 2.6.4-20（雄性白色ラット），表 2.6.4-21（雌性白色ラット）及び表 2.6.4-22（有色ラ ット）に示す．白色ラットに[¹⁴

C]-Org 25969

を投与すると，放射能は体内の広範囲へ急速に分布 した．最も高濃度に分布した組織は大腿骨関節ⁱⁱⁱ及び大腿骨であり，次いで腎臓，膀胱，前立腺（雄）

及び腟（雌）であった（2.6.4.4.2.2及び2.6.4.4.2.3も参照）．腎臓及び膀胱への高濃度の分布は，放 射能が投与後長時間わたり尿中に排泄されることと一致している．放射能は投与

168

時間後もほ とんどの組織で測定可能であった．消化管の内容物及び壁，特に盲腸内容物及び小腸内容物にも 顕著な量の放射能が分布した．血液－脳関門の通過はほとんど認められなかった．有色ラットの 眼における放射能濃度は白色ラットと同程度であり，

Org 25969

の眼メラニン結合性は低いことが 示唆された．

表 2.6.4-20 雄性白色ラットに

8 mg/kg

の[¹⁴

C]-Org 25969

を単回静脈内投与したときの組織分布

組織中濃度（µg eq/g）

組織 25分 1時間 5時間 24時間 168時間

血漿 6.450 ± 0.786 1.000 ± 0.269 0.052 ± 0.002 0.021 ± 0.002 0.002 ± 0.000 血液（全血） 3.983 ± 0.582 0.629 ± 0.158 0.035 ± 0.001 0.017 ± 0.001 NC 血球 0.589 ± 0.053 0.114 ± 0.034 0.009 ± 0.001 0.007 ± 0.001 NC 大動脈 4.775 ± 1.868 0.887 ± 0.246 0.512 ± 0.397 0.149 ± 0.055 0.044 ± 0.014 小脳 0.386 ± 0.213 0.064 ± 0.023 0.054 ± 0.019 0.020 ± 0.007 0.013 ± 0.011 脳（小脳以外） 0.211 ± 0.034 0.064 ± 0.030 0.028 ± 0.006 0.014 ± 0.009 0.005 ± 0.001 脊髄 0.642 ± 0.180 0.372 ± 0.193 0.160 ± 0.029 0.131 ± 0.032 0.157 ± 0.039 眼 1.250 ± 0.113 0.424 ± 0.080 0.102 ± 0.016 0.069 ± 0.036 0.033 ± 0.005 心臓 1.742 ± 0.258 0.315 ± 0.069 0.070 ± 0.006 0.064 ± 0.006 0.032 ± 0.004 腎臓 17.13 ± 2.791 7.230 ± 0.691 6.362 ± 1.588 7.345 ± 0.276 1.464 ± 0.251 膀胱 16.51 ± 7.111 3.967 ± 0.700 1.530 ± 1.138 0.542 ± 0.075 0.098 ± 0.006 肝臓 1.355 ± 0.073 0.721 ± 0.064 0.572 ± 0.039 0.435 ± 0.022 0.136 ± 0.024 肺 2.448 ± 0.281 0.505 ± 0.133 0.244 ± 0.142 0.133 ± 0.009 0.056 ± 0.005 喉頭 2.602 ± 0.630 0.732 ± 0.037 0.350 ± 0.058 0.232 ± 0.019 0.095 ± 0.006 膵臓 1.492 ± 0.461 0.881 ± 0.601 0.155 ± 0.014 0.137 ± 0.006 0.058 ± 0.007 脾臓 0.858 ± 0.126 0.419 ± 0.138 0.154 ± 0.011 0.164 ± 0.006 0.109 ± 0.019 副腎 1.199 ± 0.251 1.666 ± 2.198 0.109 ± 0.015 0.091 ± 0.006 0.043 ± 0.003 ハーダー腺 1.294 ± 0.389 0.388 ± 0.097 0.230 ± 0.035 0.209 ± 0.018 0.073 ± 0.018 リンパ節（腸間膜） 1.795 ± 0.160 0.809 ± 0.097 0.309 ± 0.155 0.340 ± 0.059 0.093 ± 0.041

下垂体 1.297 ± 0.546 0.947 ± 0.874 0.127 ± 0.027 NC NC 顎下腺 1.467 ± 0.214 0.374 ± 0.096 0.173 ± 0.008 0.142 ± 0.010 0.068 ± 0.007

胸腺 0.755 ± 0.115 0.188 ± 0.039 0.067 ± 0.005 0.060 ± 0.005 0.026 ± 0.004 甲状腺 2.162 ± 0.471 1.238 ± 0.651 0.390 ± 0.096 0.180 ± 0.011 0.031 ± 0.027 精巣上体 2.960 ± 0.407 1.101 ± 0.190 0.586 ± 0.677 0.162 ± 0.008 0.071 ± 0.011 前立腺 18.58 ± 5.283 16.82 ± 16.60 1.949 ± 1.777 0.158 ± 0.028 0.042 ± 0.007 精嚢 2.060 ± 0.516 1.165 ± 0.841 4.351 ± 5.542 0.118 ± 0.013 0.035 ± 0.001 精巣 1.414 ± 0.181 0.390 ± 0.039 0.224 ± 0.179 0.083 ± 0.014 0.044 ± 0.010

卵巣 － － － － －

子宮 － － － － －

腟 － － － － －

骨（大腿骨） 18.84 ± 0.442 20.19 ± 2.423 20.65 ± 1.273 27.05 ± 0.220 20.65 ± 2.565 骨髄（大腿骨） 0.744 ± 0.016 0.693 ± 0.357 1.115 ± 0.555 1.454 ± 0.817 0.607 ± 0.187 褐色脂肪 1.388 ± 0.274 0.293 ± 0.082 0.126 ± 0.030 0.131 ± 0.045 0.048 ± 0.004 腎傍脂肪 1.713 ± 1.730 0.455 ± 0.376 0.099 ± 0.018 0.074 ± 0.017 0.037 ± 0.008 骨格筋 0.861 ± 0.114 0.175 ± 0.047 0.067 ± 0.022 0.057 ± 0.004 0.025 ± 0.003 皮膚（非有色） 3.950 ± 0.473 0.808 ± 0.310 0.255 ± 0.023 0.281 ± 0.027 0.119 ± 0.013

皮膚（有色） － － － － －

胃 0.966 ± 0.105 1.285 ± 0.710 1.632 ± 0.509 0.805 ± 0.146 0.019 ± 0.003 小腸 0.975 ± 0.130 1.601 ± 1.065 2.077 ± 0.635 0.837 ± 0.234 0.014 ± 0.001 盲腸 0.534 ± 0.086 0.482 ± 0.302 4.450 ± 0.318 1.280 ± 0.165 0.018 ± 0.004 大腸 0.903 ± 0.215 0.870 ± 0.640 3.497 ± 1.486 1.651 ± 0.514 0.020 ± 0.003 関節（大腿骨） 27.96 ± 2.125 30.17 ± 5.964 31.18 ± 3.704 34.83 ± 6.804 13.63 ± 1.560

組織中放射能（% of dose/組織）

胃内容物 0.2015 ± 0.0418 0.3566 ± 0.3053 0.3386 ± 0.0837 0.2091 ± 0.0816 NC 小腸内容物 0.2671 ± 0.0494 0.5428 ± 0.4996 0.8089 ± 0.2203 0.3038 ± 0.0950 0.0058 ± 0.0013 盲腸内容物 0.1728 ± 0.0059 0.1894 ± 0.1227 2.886 ± 0.5917 1.138 ± 0.6003 0.0075 ± 0.0006 大腸内容物 0.0729 ± 0.0247 0.1010 ± 0.0900 0.6095 ± 0.3009 0.6320 ± 0.2574 0.0048 ± 0.0029 平均値±標準偏差（n = 3）

－：該当せず

NC：2匹以上の動物で定量下限以下であったため算出せず．

ドキュメント内 Microsoft Word - m2-6-4-pharmacokinetics-written-summary_ver 1.9_類縁物質おきかえ-1… (ページ 41-63)