産業微生物由来のアスパラギン酸：アラニン交換輸送体

産業微生物において膜を介した物質輸送（基質や前駆 体の菌体内へ取り込み，または代謝産物の菌体外へ排 出）は，膜輸送体〔取り込み輸送体（インポーター）， 排出輸送体（エクスポーター），交換輸送体（アンチ ポーター）〕が担っている．基質および代謝産物の輸送 は，菌体内の代謝反応の速度を左右することから，膜輸 送体は物質生産の効率に関わる重要な因子である．醤油

乳酸菌 から単離されたアス

パラギン酸：アラニン交換輸送体 （AspT） は，菌体外 のアスパラギン酸を取り込み，アスパラギン酸の脱炭酸 反応によって生じたアラニンを菌体外に排出する^（1）．

 AspTをコードする遺伝子 （ ） とアス パラギン酸-4-脱炭酸酵素 （AspD） をコードする遺伝子 

（ ） は， → の順で1つのオペロン（ オ ペロン）を構成している^（1）．アスパラギン酸/アラニン 交換とアスパラギン酸の脱炭酸により，細胞内のアルカ リ化と細胞膜を介して細胞内負（細胞外正）の膜電位の 形成が起こり，形成されたproton motive force （pmf） 

を細胞膜に存在するF1Fo-ATPaseがATPに変換するこ とでエネルギーが生成する^（2）．

このように，エネルギー生成と物質生産を両立させる 輸送体として見いだされたAspTは，後に，米国カリ フォルニア大サンディエゴ校のMilton H. Saier, Jr.らの グ ル ー プ が 構 築 し たTransporter Classification data- base （TCBD, http://www.tcdb.org/）において，Aspar-

tate : Alanine Exchanger （AAEx） Family （TC# 2.A.81） 

と し て 登 録 さ れ た．近 年，

のAAExファミリーに属する輸送体（SucE1）が，

コハク酸醗酵においてコハク酸の排出を担うことが明ら かにされ^（3），AAExファミリー輸送体の基質はアスパラ ギン酸やアラニンに留まらないことがわかってきた．今 回は，SucE1の発見から機能解析に至るまでの研究と，

 AspTの構造と基質認識に関わる最近の 研究を紹介し，AAExファミリーに属する輸送体の基質 の多様性と産業応用へ向けた可能性を展望する．

由来コハク酸排出 輸送体 （SucE1） の発見

コハク酸は植物性プラスチックの原料として注目され ており，現在，様々な微生物を用いたコハク酸醗酵に関 する研究が行なわれている．コハク酸は，

（4）, 

（5）,  ^（6）と い っ た バ クテリアや遺伝子改良が施された ^（7）な どによってTCAサイクルの還元的反応を利用して生産 される．^l-グルタミン酸生産菌として単離され^（8），様々 なアミノ酸や核酸の工業生産に用いられている^（9, 10） 

は通性嫌気性細菌であり，酸素が十分存在 せず他の電子受容体も利用できないような環境下では，

糖から還元的TCAサイクルを経てコハク酸を生産する

セミナー室

産業微生物の細胞膜を介した物質輸送研究の最前線――物質生産の効率化に向けた新たな挑戦-2

産業微生物由来のアスパラギン酸：アラニン交換輸送体

（AAEx） ファミリーに属する膜輸送体の機能と産業応用

福井啓太 *

¹

_{，七谷　圭} *

²

_{，阿部敬悦} *

^{3, 4}

*¹味の素（株）バイオファイン研究所，*²東北大学大学院工学研究科，*³同大学大学院農学研究科，*⁴同大学未来科学技術共同研究センター

ことが知られている^{（11, 12）}．

を用いたコハク酸生産プロセスに関し ては，通性嫌気性細菌であることを利用して，好気条件 での菌の増殖と嫌気条件でのコハク酸醗酵を分けた2段 階の醗酵プロセスが有効である（図1_{）．本醗酵プロセ} スでは，まず好気条件下で菌を増殖させ，その後，嫌気 条件に曝すことで菌の増殖を停止させ，還元的TCAサ イクルを利用することによって糖から乳酸やコハク酸な どの有機酸を生産することができる．しかし，筆者らの 研究の結果，好気条件下で培養した菌をそのまま嫌気条 件で培養してもコハク酸は生成せず，コハク酸生成能を 付与するためには酸素濃度計では検出できないくらいの 微量の酸素が存在するような条件，すなわち微好気条件 下に曝す必要があることがわかった（図1）．菌はこの 微好気条件で，コハク酸生産に必要なシステムを発現誘 導しているものと思われる．

一方， におけるコハク酸の主要生合成 経路についてはすでに明らかとなっていたが^（11），菌体 内で生合成されたコハク酸を菌体外に排出する輸送体，

すなわち排出輸送体については未知であった．そこで，

筆者らは新規コハク酸排出輸送体の探索を行なった．そ の探索から機能解析および排出輸送体が代謝に及ぼす影 響について以下に解説する．

1.  コハク酸排出輸送体遺伝子 （ ） の探索 先ほど述べた通り，本菌は好気条件で増殖させた菌体

を嫌気条件（または微好気条件）に曝露したとき，糖か ら主に乳酸やコハク酸，酢酸などの有機酸を生成する．

また，^l-乳酸生成酵素である^l-乳酸デヒドロゲナーゼ 

（ ） を欠損させると，乳酸を生成せずコハク酸が主 要生成物となることがすでに知られている．したがっ て，コハク酸排出輸送体遺伝子の発現レベルは野生株よ りも 欠損株のほうが高いと考え， 欠損株を用 いてコハク酸排出輸送体の探索を行なった．

筆者らは，微好気条件でコハク酸排出輸送体が発現さ れていると推定し，好気条件下（コハク酸非生成条件）

と微好気条件（コハク酸生成条件）にてトランスクリプ トーム解析を行ない，膜タンパク質をコードしているこ とが予測され，かつ好気条件に比べて微好気条件で2倍 以上発現量が上昇している遺伝子を抽出した（図1）． 抽出された遺伝子の増幅株，破壊株を作製し，コハク酸 生産培養試験を行ない，コハク酸生産への影響を調べ た．その中で， 遺伝子は，発現量が好気条件に比 べて微好気条件で約3倍上昇しており，またコハク酸生 産培養の結果，増幅株ではコハク酸蓄積量が約1.5倍増 加し，破壊株は糖消費速度やコハク酸生成速度が顕著に 低下していた．したがって， 遺伝子は，微好気条 件下でその発現が誘導され，コハク酸生産に非常に重要 な遺伝子であることが示された．また，アミノ酸配列解 析の結果，SucE1タンパク質は9 〜 10回膜貫通領域を もち，その間にTrkA-Cドメインが保存されている典型 的なAAExファミリーに属する膜タンパク質であるこ 図1■コリネ型細菌を用いたコハク 酸発酵プロセスとコハク酸排出担体 の探索

コリネ型細菌を用いたコハク酸発酵 プロセスは，好気，微好気，嫌気の プロセスからなり，好気条件で菌体 を増殖した後，微好気条件に曝すこ とでコハク酸生成能を付与し，嫌気 条件でコハク酸を生産する．

とが予想された（次章1項を参照）．

2.  SucE1の機能解析

SucE1は，膜タンパク質をコードしている可能性が高 く， 遺伝子の破壊によりコハク酸生産能が低下す る．加えて，菌体内コハク酸濃度は約1.7倍上昇する

（次項3参照）．この結果より，SucE1がコハク酸排出輸 送体であると推定し，本タンパク質の機能解析を行なっ た．まず，SucE1のC末端にHis-tagを付与したSucE1-

（His）6タンパク質の精製を行なった．一般的に，膜タン パク質の機能を保持したまま精製することは難しいとい われているが，その理由としては，①膜タンパク質の発 現量が非常に低いこと，②His-tagなどのtagを付与し た場合，膜にうまく埋め込まれず本来の活性を失ってし まう可能性があること，③水溶性と脂溶性領域が存在す るため，その構造を保持したまま可溶化するためには界 面活性剤の添加が必須となるが，その界面活性剤が膜タ ンパク質によって異なること，④精製時には様々なノウ ハウが必要となること，などが挙げられる．

そこでまず， の発現量を上げるために，内在性 高発現プロモーターで プロモーターを置換し，

pVK9ベクターに挿入したpVK9 : : Ptuf- を作製し 高発現化した．次に，SucE1の活性を保持したままHis- tagを挿入すべく，SucE1の様々な場所にHis-tagを挿入 したプラスミドを作製した．それらの中でコハク酸生産 能が低下したΔ Δ 株を形質転換し，コハク酸 生産培養実験を行なった．その結果，C末端にHis-tag を付与したpVK9 : : Ptuf- -（His）6で形質転換した株 のみコハク酸生産能が回復していることを確認した．こ の形質転換体を培養，破砕した後，超遠心分離によって 膜画分を分離し，界面活性剤には -dodecyl-

β

-^d-malto- side （DDM） を用いて膜画分を可溶化した．TALON-

spin^TM columnsを用いてSucE1-（His）6の精製を行なっ た結果，膜画分から単一のバンドを精製することに成功 した．このことから，SucE1タンパク質は膜タンパク質 であることを確認した．

次に，本精製タンパク質と 由来リン脂質を用 いてSucE1-（His）6をリポソームに再構成し，プロテオ リポソームを作製した．再構成されたSucE1-（His）6が コハク酸トランスポーターかどうかを解析するために，

コハク酸のカウンターフローアッセイを行なった．カウ ンターフローアッセイでは，高濃度コハク酸を封入した 再構成膜に対して外液に低濃度のRIラベルコハク酸を 添加し，RIの取り込みを測定する（図2_{-A）．SucE1が} コハク酸トランスポーターの場合，コハク酸の自己交換 反 応 に よ り 経 時 的 にRIの 取 り 込 み 量 が 増 加 す る．

SucE1のコハク酸カウンターフローアッセイの結果，

SucE1-（His）6を再構成した膜でのみ典型的なコハク酸依 存 的 な 輸 送 が 確 認 さ れ た（図2-B）．こ の こ と か ら，

SucE1-（His）6が活性を有したままプロテオリポソームに 再構成されたことが示され，SucE1がコハク酸のトラン スポーターであることが証明された．

カウンターフローアッセイにおけるSucE1のコハク 酸輸送速度は約2.4 nmol min⁻¹ mg protein⁻¹であり，こ の値は，AAEx family輸送体のプロトタイプとして知 られる 由来AspTのアスパラギン酸カウ ンターフロー時の値と比較して約1/400と非常に小さ い^（13）．こ の 速 度 の 違 い に 関 し て，一 つ はSucE1と AspTの m値の違いが考えられる．AspTのアスパラ ギン酸に対する m値は350 

μ

^mである^（14）のに対して，

一般的にエクスポーターの m値は数十m^mと高いこと が知られている^{（15〜17）}．今回のカウンターフロー実験で は，再構成膜内外のコハク酸濃度はそれぞれ100 

μ

^m

（外）と100 m^m（内）で行なっており，上で述べたよう

図2^■精 製SucE1を 用 い た カ ウ ン ターフロー実験と実験原理 まず精製SucE1を 脂質に再構 成し，（A） のような人工膜小胞を作 製する．カウンターフロー実験では，

高濃度コハク酸を封入した再構成膜 に対して外液に低濃度のラベルコハ ク酸を添加し，ラベルの取り込みを 測定する．SucE1がコハク酸トラン スポーターの場合，コハク酸の自己 交換反応によりラベルを取り込み，

（B） のグラフが得られる．*_ラベル体 であることを意味する．

な一般的なエクスポーター特有の高い m値を考慮する と，再構成膜外側のコハク酸濃度 （100 

μ

m） はSucE1の コハク酸に対する推定 m値よりもかなり低いことが予 想される．その結果，外側から内側へのコハク酸の輸送 が律速となり，このような低い速度となったのではない かと考えられる．実際，外側のコハク酸濃度を1 m^mに してみると，コハク酸輸送速度は顕著に増大したこと も，この仮説を支持している．

3.  SucE1欠損株のメタボローム解析

これまで， はコハク酸排出輸送体遺伝子であ り，微好気条件下で誘導され，本遺伝子を増幅するとコ ハク酸生成量が増大し，欠損すると糖消費速度やコハク 酸生成量が低下するというコハク酸生産に非常に重要な 遺伝子であることを述べてきた．

そこで， を欠損することによって糖消費速度が 低下する原因を解明することを目的として，微好気条件 下 に お け る 対 照 株（Δ 株 ） と 欠 損 株 （Δ Δ ） のメタボローム解析を行なった．その結果，

欠損により，フルクトース-1,6-ビスリン酸 （FBP） 

より上流のEmbden-Meyerhof pathwayのメタボライト が有意に増加し，グルコース-6-リン酸，フルクトース-6- リ ン 酸，そ し てFBPの 菌 体 内 濃 度 が，対 照 で あ る  Δ 株よりもそれぞれ約1.8倍，1.7倍，1.6倍上昇して いた（図3_）．一方，コハク酸を除く，TCAサイクルの メタボライトの多くは減少しており，コハク酸は1.7倍 上昇するが，2-オキソグルタル酸やリンゴ酸は約30％，

クエン酸は約50％減少していた．これらの結果は，

SucE1のコハク酸排出機能を欠失させることにより，菌 体内コハク酸や糖代謝を阻害するような解糖系上流のメ タボライトが蓄積したことを示唆している．

FBPより上流のメタボライトの濃度増加と糖消費速 度低下の関連性は，これから明らかにしていく必要があ るが， 由来のグリセルアルデヒド-3-リン 酸デヒドロゲナーゼ活性が高NADH濃度下で阻害され ることを考えると^（18），コハク酸排出機能を欠損させた ことにより菌体内のNADH/NAD^＋バランスが崩れ，そ の結果FBPより上流のメタボライトが増加した可能性 も考えられる．また，SucE1に存在するTrcA-Cドメイ ンには何らかのリガンドが結合し，基質の輸送活性を制 御 し て い る と 考 え ら れ て い る が（次 章1項 参 照 ）， NAD^＋やNADHが 結 合 す る 可 能 性 も 示 唆 さ れ て い る^（19）．これらを併せて考えると，SucE1によるコハク 酸排出は細胞内のNADH/NAD^＋を反映して活性を制御 している可能性なども考えられる．さらに，AspTの特

徴であるエネルギー生成がSucE1でも見られるか否か，

興味深いところであり，これらを明らかにしていくこと が今後の課題である．本結果と本遺伝子を増強すること によりコハク酸生産能が向上することから，コハク酸排 出輸送体SucE1はコハク酸醗酵の効率を左右する非常 に重要な因子であることがわかる．

4.  SucE1のアミノ酸配列解析

を 用 い た コ ハ ク 酸 生 産 に お い て，

SucE1は重要な因子であるが， 以外に

や ,  などもコ

ハク酸を生産する菌として知られている．そこで，これ らのバクテリアにもSucE1のホモログが存在するか否 かを調べるために，SucE1のアミノ酸配列を用いて BLASTサ ー チ を 行 な い，そ れ ら とAspTに つ い て Clustal Wを用いて系統樹を作製した（図4_{）．すると}

を含むコリネ型細菌のみならず，今回解析 を行なった他のすべてのコハク酸生産バクテリアも 図3^■ 欠損株のメタボローム解析

欠損によるメタボライトの変化を，対照株とのメタボライ ト濃度の比 （Δ /control） で表わす． 欠損により，コ ハク酸とFBPより上流の化合物の濃度が上昇し，コハク酸以外の TCA化合物の多くが減少している．

SucE1ホモログを保持していた．

由来MS0288とMS0289を除いては，9 〜 12回膜貫通領 域と中央に繰り返しTrkA-Cドメインを含む親水性領域 を有しており，典型的なAAEx familyの構造であった

（次 章1項 参 照 ）．  MS0288とMS  0289に関しては，AAEx familyのN末端領域，C末端 領域のみをそれぞれ有しており，5 〜6回膜貫通領域と TrkA-Cドメインを各1つずつ有していた．

また，これらのホモログは，系統樹上4つのクラス ターに分類された．クラスター IとIIには，コリネ型細 菌のSucE1ホモログが含まれ，SucE1はクラスター Iに 分 類 さ れ た．ク ラ ス タ ー IIIに は , 

,  由来のホモログが含まれ，

クラスター IVにはAspTが分類された．また，クラス ター IIIのコハク酸生産バクテリアのSucE1ホモログは SucE1との相同性が70％以上と高く，また系統樹上 AspTとは遠い位置に分類されていた．これらから，

SucE1はコハク酸生産菌全般に存在し，一般的にコハク 酸生産に重要な役割を担っている可能性が考えられる．

AAExファミリーの分子構造と基質認識

AAExファミリー輸送体のプロトタイプである  AspTのドメイン構造をNCBIのConserved  Domain Architecture Retrieval Tool （CDART, http://

www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/lexington/lexington.

cgi）  を 用 い て 解 析 す る と，Asp-Al̲Exド メ イ ン 

（PF06826） とTrkA-Cドメイン （PF02080） の2種類の ドメイン構造が保存されていることがわかる（図5_-A）． 同様の構造をもつタンパク質は，2011年8月現在でバク テリア由来の812シークエンス登録されており，これら がAAExファミリーに属するトランスポーターである．

Asp-Al̲ExドメインとTrkA-Cドメインの機能は明らか にされておらず，Asp-Al̲Exドメインは膜貫通領域を 形成することから基質輸送に関与し，TrkA-Cドメイン は何らかのリガンドが結合し基質の輸送活性を制御して いると考えられている．

1.   AspTの分子構造

筆者らは，  AspTの分子構造を生化学 的 手 法（Cysteine-scanning法 ） を 用 い て 解 析 し た．

Cysteine-scanning法は部位特異的変異導入と部位特異 図4^■AspTホモログとコハク酸生産菌由来SucE1ホモログの系統樹解析

配列データは，以下のaccession numberを用いてGenBank databaseから入手した．（ ） 内の値は，  SucE1との相同性を表 わ す．   sucE1 : NP̲601414,    NCgl0565 : NP̲599826,    CE2102 : NP̲738712,    CE0595 : NP̲737205,    DIP0570 : NP̲938946,    DIP0830 : NP̲939194,    b3685 : NP̲418140,    b0847 : NP̲415368,    MS0289 : YP̲087481,    MS0288 : YP̲087480,    Asuc̲0023 : YP̲001343340,   AspT, aspartate : alanine antiporter : BAB92081,   AspT,  aspartate : alanine antiporter : BAC65228,  , AspT, putative aspartate : alanine antiporter : YP̲726110,    AspT. putative aspartate : alanine antiporter : CAJ48975

的化学修飾を融合した手法であり，親水的環境にあるシ ステイン残基のみがSH基修飾試薬と効率的に反応する ことを利用した構造と機能の解析手法である．任意のア ミノ酸残基を1残基ずつシステイン残基に置換したsin- gle cysteine置換体を大腸菌を宿主として発現させ，膜 不透過性蛍光SH基修飾試薬Oregon Green 488 male- imideおよび，膜不透過性SH基修飾試薬［2-（trimethyl- ammonium）ethyl］methanethiosulfonate bromide を作用 させることで，導入したシステイン残基の細胞膜におけ る位置を解析しAspTのトポロジーを決定した^（20） （図 5-B）．各変異体のラベルパターンにより，  

AspTはN末端，C末端をペリプラズム側にもち，10本 の膜貫通 

α

-ヘリックス （TM） を有し，TM 5 -TM 6間 に約180アミノ酸から成る親水性のループ領域を有して いるなど，ユニークな分子構造（5TM‒large loop‒5TM 構 造，図5-B） で あ る こ と が 明 ら か に な っ た^（20）． CDARTドメイン予測から，5TM‒large loop‒5TM構造 はAAExファミリー輸送体に共通の構造であると推定 される．

AspTの10本の膜貫通 

α

-へリックスのうち3番目の膜 貫通 

α

-ヘリックス （TM 3） には，AAExファミリーに 属するトランスポーターで保存されている残基が多数存 在し，さらに疎水性へリックス中に荷電性残基であるア ルギニン残基が存在する．そこで，TM 3の基質輸送へ の関与を推定し，Cysteine-scanning法により解析した．

結果，TM 3が基質である^l-アスパラギン酸との結合に より構造変化を起こし，ペリプラズム側に開口していた

構造が細胞質側に開口した構造に変化することが示唆さ れた^（13）．

Cysteine-scanning法によって得られた   AspTの特徴的な構造は，TM 5 -TM 6間に存在する約 180アミノ酸残基からなる親水性のループ領域である．

この領域には，TrkA-Cドメインが存在する．TrkA-C ドメインは，K^＋の輸送制御を担うタンパク質TrkAに おいて最初に見いだされたドメイン構造であるが，現在 までのところ，その機能は明らかにされておらず，何ら かのリガンドが結合し輸送制御に関わっているのではな いかと推定されている．詳細な構造情報を得るため，北 里大学薬学部梅山英明教授らの協力により，タンパク質 立体構造予測プログラムFull Automatic Modeling Sys- tem （FAMS） を用いて，この親水性ループの三次元構 造をモデリングした．その結果，ループ内には，2つの

α

-

β

 complex structure（図5-C）が存在することがわ かった^（20）．親水性ループの後半部分ドメイン2は，ア ミノ酸配列からTrkA-Cドメインと推定された領域であ るが，前半部分はアミノ酸配列からはTrkA-Cドメイン とは推定されなかったのにもかかわらず，構造的には類 似の構造を保持していた^（20）．

2.   AspTの基質認識

膜輸送体の詳細なキネティクス解析や基質特異性に関 する研究は，膜タンパク質の精製が1つの障壁となり解 析を困難にしている．  AspTに関して，^l- アスパラギン酸と^l-アラニンを輸送することは，未精製

（A） Conserved  Domain  Architec- ture Retrieval ToolによるAspTのド メイン構造．2つのAsp-Ala̲Exドメ インと親水性ループに2つのTrkA-C ドメインをもつ．1,000近い配列が類 似の構造をもつタンパク質として登 録されている（2011.8月現在）．（B） 

生化学的な解析から推定されるAspT の二次構造．N末端，C末端に5つの 膜貫通へリックスをもち，中央に約 180アミノ酸残基からなる親水性の ループ領域が存在する．（C） TrkA-C ドメインのモデリング構造．各ドメ インの立体構造モデルを緑で，テン プレートとして使用したタンパク質 の立体構造を黄色で示した．TrkA- C1とTrkA-C2は，類似の構造を保持 していることが示唆された．

図5■AAExファミリートランスポーターの分子構造

の膜画分を再構成したプロテオリポソームを用いた解析 により明らかにされていた^（1, 2）．しかし，どのようなア ミノ酸，有機酸を基質とするのかは不明であった．そこ で，筆 者 ら は  AspTを 界 面 活 性 剤 -do- decyl-

β

-^d-maltoside （DDM） を用いて可溶化，精製する 系を構築し，  AspTの基質特異性に関す

る詳細な解析を行なった．可溶化，精製の方法について は，SucE1の項（前章2項）で解説した方法を参考にし ていただきたい．

 AspTの基質となる化合物を探索する ため，^l-Asp, ^l-Alaの輸送阻害実験を行なった．精製

 AspTを再構成膜内の^l-Aspまたは^l-Ala濃度 図6^■AspTの基質特異性と基質結合メカニズム

（A） プロテオリポソームを用いた輸送阻害実験から明らかとなったAspTの基質特異性と化合物の構造．基質となる化合物とならない化合 物の構造の比較から，α位もしくはβ位にアミノ基を有することが，基質として認識されることに必要なことが示唆された．また，アスパ ラギン酸結合部位への基質の結合には，β位の極性が関与している可能性がある．（B）阻害実験から推定されたAspTへの基質結合メカニ ズム．アスパラギン酸の輸送とアラニンの輸送は，それぞれ異なる化合物で阻害されたことから，AspTはアスパラギン酸とアラニンの結 合部位を独立に有することが示唆された．

を100 m^mとなるようにプロテオリポソームに再構成し，

さらに外液（それぞれ0.039 mmのラベルl-Aspまたは 2.9 m^mラベル^l-Ala）に15 m^mの各^d, ^l-型アミノ酸を添 加し，^l-Asp, ^l-Alaの取り込み阻害を観察した（図2-A 参照）．その結果，各アミノ酸はそれぞれ異なる阻害作 用を示した．阻害作用を示しAspTの基質となることが 推定された化合物と，阻害作用を示さずAspTの基質に はならないことが示唆された化合物の構造を図6_-Aに示 した．使用した化合物の構造の比較から，AspTの基質 となるには炭素骨格数が3から5で，

α

位もしくは

β

位に アミノ基を有することが必要であることが示唆された．

また，アスパラギン酸結合部位への基質の結合には，

β

位の極性が関与している可能性がある．特に，^l-シス テイン （^l-Cys） は，^l-Aspの取り込み反応を特異的に阻 害し，l-セリン （l-Ser） はl-Alaの取り込みを特異的に 阻害した．さらに，^l-Aspアナログは^l-Cysと同様に

l-Aspの 輸 送 を 特 異 的 に 阻 害 し た．こ の こ と か ら，

AspTはl-Alaの結合サイトとl-Aspの結合サイトを独 立に有しており，^l-Cysや^l-Aspアナログは^l-Asp結合 サイトに特異に結合し，^l-Aspの取り込みを特異的に阻 害している可能性が示唆された^（14） （図6-B）．精製

 AspTを用いた基礎的なキネティクス解析か ら，  AspTの基質選択性に加え，^l-Asp, 

l-Alaの独立した基質結合サイトの存在が見えてきた．

将来的な基質選択性の改変などのデザインへ向けて，さ らなる構造学的，生化学的な解析が必要である．

おわりに

醗酵物質生産における微生物改良の方策は，これまで は細胞内の代謝改変が中心であった．しかし，基質や生 産物は細胞膜を透過しないことが多いため，膜輸送体に よって菌体内と培地の間の基質・生産物の移動がスムー ズに行なわれないと生産効率の低下を招く．加えて，細 胞内の代謝にも影響を与えうることから，醗酵生産の効 率化には輸送体の改良は重要な検討課題である．輸送体 の基質特異性・速度論的性質の解析は，輸送時の細胞内 代謝産物間の競合関係の理解や，醗酵速度を決定・制御 するための重要な基礎データとなる．また，基質輸送の 駆動力となる共役イオンの同定は，生体エネルギー論的 視点から，物質輸送を制御するためには必要不可欠であ る．

輸送体研究には，輸送体タンパク質が高発現しにくい ことや，適切な界面活性剤を選択し，輸送活性を有した まま細胞膜から輸送体タンパク質を可溶化する必要があ

ること，さらには高度な技術を要する輸送体タンパク質 の精製，人工膜小胞への再構成など，様々な輸送体タン パク質取り扱いの困難さがある．しかし，物質生産にお ける輸送体の重要性と将来の産業的利用価値を考える と，これらを克服しながら，優れた輸送体を見いだし，

コレクションしていくことが産業的に重要と考えられ る．AAExファミリー輸送体は，SucE1をはじめ産業的 に有用な排出輸送体も含まれることが明らかとなり，そ の数はバクテリアだけでも800種類以上存在する．ま た，本ファミリーに属する輸送体がエネルギー供給に関 係していることも踏まえると，産業利用価値の高い輸送 体がまだ数多く存在するものと予想される．さらに，本 ファミリーの幅広い基質選択性を考えると，産業利用価 値の高い改変体作製の良い材料としても期待される．

文献

  1）  K. Abe, F. Ohnishi, K. Yagi, T. Nakajima, T. Higuchi, M. 

Sano, M. Machida, R. I. Sarker & P. C. Maloney : , 184, 2906 （2002）.

  2）  K. Abe, H. Hayashi & P. C. Maloney : , 271,  3079 （1996）.

  3）  K. Fukui  : , 154, 25 （2011）.

  4）  P. C. Lee, W. G. Lee, S. Kwon, S. Y. Lee & H. N. Chang :   , 54, 23 （2000）.

  5）  M. V. Guettler, D. Rumler & M. K. Jain : , 49, 207 （1999）.

  6）  P. C. Lee, S. Y. Lee, S. H. Hong & H. N. Chang : , 58, 663 （2002）.

  7）  G. N.  Vemuri,  M. A.  Eiteman  &  E.  Altman : , 68, 1715 （2002）.

  8）  S. Udaka : , 79, 754 （1960）.

  9）  S. Kinoshita, S. Udaka & M. Shimono : , 3, 193 （1957）.

  10）  M.  Shiratsuchi,  H.  Kuronuma,  Y.  Kawahara,  Y.  Yoshi- hara,  H.  Miwa  &  S.  Nakamori :

, 59, 83 （1995）.

  11）  M.  Inui,  S.  Murakami,  S.  Okino,  H.  Kawaguchi,  A. A. 

Vertès  &  H.  Yukawa : , 7, 

182 （2004）.

  12）  S.  Okino,  M.  Inui  &  H.  Yukawa : , 68, 475 （2005）.

  13）  K. Nanatani, P. C. Maloney & K. Abe : , 191,  2122 （2009）.

  14）  A.  Sasahara,  K.  Nanatani,  M.  Enomoto,  S.  Kuwahara  & 

K. Abe : , 286, 29044 （2011）.

  15）  S. Bröer & R. Krämer : , 202, 131 （1991）.

  16）  S. Zittrich & R. Krämer : , 176, 6892 （1994）.

  17）  C.  Trötschel,  D.  Deutenberg,  B.  Bathe,  A.  Burkovski  & 

R. Krämer : , 187, 3786 （2005）.

  18）  H.  Dominguez,  C.  Rollin,  A.  Guyonvarch,  J.  Guerquin- Kern, M. Cocaign-Bousquet & N. D. Lindley :

, 254, 96 （1998）.

  19）  A.  Schlösser,  A.  Hamann,  D.  Bossemeyer,  E.  Schneider 

& E P. Bakker : , 9, 533 （1993）.

  20）  K. Nanatani  : , 189, 7089 （2007）.