酵母菌体のコレステロール低下活性に関する研究

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目次

略 記 一 覧 --- 2 序 論 --- 3 第 1 章 各 種 酵 母 菌 体 の コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 活 性 の 比 較 緒 言 --- 5 材 料 と 方 法 --- 6 結 果 --- --- 8 考 察 --- 10

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略 記一 覧

ANOVA: analysis of variance, 一 元 配 置 分 散 分 析 AOAC: Association of Official Analytical Chemists Apo-A1: apolipoprotein -A1, ア ポ リ ポ タ ン パ ク 質 -A1 Apo-B: apolipoprotein-B, ア ポ リ ポ タ ン パ ク 質 -B BA: baker’s yeast, パ ン 酵 母

BR: brewer’s yeast, ビ ー ル 酵 母

CSH: cell surface hydrophobicity, 細 胞 表 層 疎 水 性 度 CU: Candida utilis YIT 8204

CYP7A: cholesterol 7-hydroxylase, コ レ ス テ ロ ー ル 7水 酸 化 酵 素 Ex: extract, 抽 出 物

Glc: glucose, グ ル コ ー ス

GOT: glutamic -oxaloacetic transaminase, グ ル タ ミ ン 酸 オキ サ ロ酢 酸 トラ ン スアミ ナ ー ゼ GPT: glutamate pyruvate transaminase, グ ル タ ミ ン 酸 ピ ル ビ ン 酸 ト ラ ン ス ア ミ ナ ー ゼ GRAS: generally recognized as safe

HCD: high cholesterol diet, 高 コ レ ス テ ロ ー ル 食 HDL: high density lipoprotein, 高 比 重 リ ポ タ ン パ ク 質 IDF: insoluble dietary fiber, 不 溶 性 食 物 繊 維

KM: Kluyveromyces marxianus YIT 8292

KM-CW : K. marxianus YIT 8292 crude cell wall, K. marxianus YIT 8292 粗 細 胞 壁 KM-W: K. marxianus YIT 8292 cell wall, K. marxianus YIT 8292 細 胞 壁

LDL: low density lipoprotein, 低 比 重 リ ポ タ ン パ ク 質 Man: Mannose,マ ン ノ ー ス

ND: normal diet, 通 常 食

P product: pronase digestion product of KM -CW

PG product, -glucanase digestion product of the P product PM product, -mannosidase digestion product of the P product

PMG product, -mannosidase/-glucanase digestion product of the P product QPS: qualified presumption of safety

SCFA: short -chain fatty acid, 短 鎖 脂 肪 酸 SD: standard deviation, 標 準 偏 差

SDF: soluble dietary fiber, 水 溶 性 食 物 繊 維 TFA: trifluoroacetic acid, ト リ フ ル オ ロ 酢 酸

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序論

コ レ ス テ ロ ー ル は ス テ ロ イ ド 骨 格 を 持 っ た 脂 質 で あ り 、 哺 乳 類 の 細 胞 膜 成 分 で あ る と 同 時 に 、胆 汁 酸 や ス テ ロ イ ド ホ ル モ ン 、ビ タ ミ ン D 等 の 前 駆 体 と し て も 、生 命 維 持 に 必 要 不 可 欠 で あ る 。 コ レ ス テ ロ ー ル は 主 と し て 肝 臓 に お け る 生 合 成 と 小 腸 か ら の 食 事 性 コ レ ス テ ロ ー ル の 吸 収 に よ っ て 供 給 さ れ る 。 ト リ グ リ セ リ ド と 同 様 、 コ レ ス テ ロ ー ル は 低 比 重 リ ポ タ ン パ ク 質 （ low density lipoprotein, LDL） や 高 比 重 リ ポ タ ン パ ク 質 （ high density lipoprotein, HDL）等 の リ ポ タ ン パ ク 質 に 内 包 さ れ た 状 態 で 血 液 中 を 移 動 し 臓 器 へ 輸 送 さ れ る 。 一 方 、 コ レ ス テ ロ ー ル は 動 脈 硬 化 の 発 症 に も 関 与 し て お り 、 血 中 コ レ ス テ ロ ー ル の 異 常 な 上 昇 は 、 血 管 壁 へ の コ レ ス テ ロ ー ル の 沈 着 を 引 き 起 こ し 、 動 脈 硬 化 性 疾 患 の 発 症 ・ 進 展 を 促 進 す る と 考 え ら れ て い る 。 フ レ ミ ン ガ ム 研 究 を は じ め と す る 数 多 く の 疫 学 調 査 、 臨 床 知 見 の 結 果 か ら 、 高 コ レ ス テ ロ ー ル 血 症 が 冠 動 脈 性 心 疾 患 の 主 要 リ ス ク 因 子 の 一 つ で あ る こ と (1-3)、ま た 、血 中 コ レ ス テ ロ ー ル レ ベ ル を 低 下 さ せ る こ と に よ っ て 心 筋 梗 塞 に よ る 死 亡 率 が 減 少 す る こ と が 示 さ れ て い る (4)。 こ の よ う な 知 見 に 基 づ い て 、 コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 作 用 を 有 す る 薬 剤 や 食 品 素 材 の 開 発 が 盛 ん に 行 わ れ て き た 。 こ れ ま で に 高 コ レ ス テ ロ ー ル 血 症 の 治 療 薬 と し て 、 肝 臓 に お け る コ レ ス テ ロ ー ル 生 合 成 経 路 の 律 速 酵 素 （ 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A 還 元 酵 素 ） の 阻 害 薬 （ ス タ チ ン 系 薬 剤 ） や 小 腸 に お け る コ レ ス テ ロ ー ル ト ラ ン ス ポ ー タ ー （ Niemann-Pick C1-like 1） の 阻 害 薬 （ エ ゼ ミ チ ブ ） 等 が 開 発 ・ 上 市 さ れ て い る 。 し か し 、 そ れ ら の 薬 剤 に は 肝 障 害 や 横 紋 筋 融 解 症 、 便 秘 や 下 痢 、 腹 痛 等 の 消 化 器 症 状 が 副 作 用 と し て 知 ら れ て お り 、軽 度 の 高 コ レ ス テ ロ ー ル 血 症 者 や 境 界 域 者 の た め に は 、 よ り 安 全 性 が 高 く 、 機 能 面 で も 有 益 な 予 防 ・ 改 善 ツ ー ル が 求 め ら れ て い る 。 一 方 、 食 品 素 材 に 関 し て は 、 こ れ ま で に 酵 母 や 水 溶 性 食 物 繊 維 、 植 物 ス テ ロ ー ル 、 ハ ー ブ 等 、 複 数 の 素 材 が コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 作 用 を 有 す る と 報 告 さ れ て い る (5-12)。 し か し 、 ヒ ト に お け る 有 効 性 や 作 用 機 序 が 明 確 と な っ て い る 食 品 素 材 は 少 な い 。 酵 母 は 単 細 胞 の 真 核 微 生 物 で あ り 、 一 般 に 増 殖 速 度 が 速 く 、 多 彩 な 発 酵 特 性 を 有 す る こ と か ら 、 古 く か ら 人 類 は ビ ー ル や パ ン 、 発 酵 乳 等 の 製 造 に 酵 母 を 利 用 し て き た 。 ま た 、そ の 菌 体 自 身 に は ビ タ ミ ン B や 食 物 繊 維 、タ ン パ ク 質 等 が 豊 富 に 含 ま れ る こ と か ら 、 栄 養 供 給 を 目 的 と し て ド ラ イ イ ー ス ト と し て も 摂 取 さ れ て き た 。 ド ラ イ イ ー ス ト と し て 広 く 用 い ら れ て い る 菌 種 は 、 Saccharomyces cerevisiae 、 Candida utilis 、

Kluyveromyces marxianus で あ る (13)。 近 年 、 ド ラ イ イ ー ス ト の 保 健 機 能 に つ い て も 多

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材 料 お よ び 方 法

微 生 物 お よ び 培 養 条 件 パ ン 酵 母 は オ リ エ ン タ ル 酵 母 (株 )製 の 商 品 を 購 入 し て 使 用 し た 。 ビ ー ル 酵 母 は ヤ ク ル ト 薬 品 工 業 (株 )よ り 供 与 さ れ た も の を 用 い た 。他 の 酵 母 は 、(株 )ヤ ク ル ト 本 社 中 央 研 究 所 で 系 統 保 管 さ れ て い る 菌 株 ス ト ッ ク を 培 養 し て 調 製 し た 。培 地 組 成 は 30 g/L グ ル コ ー ス（ glucose, Glc）、10 g/L polypeptone、5 g/L yeast extract、1 g/L KH2PO4、2 g/L K2HPO4

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結 果

試 験 1: 酵 母 81 株 の 10%混 餌 投 与 量 に お け る コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 活 性 の 比 較 高 コ レ ス テ ロ ー ル 負 荷 ラ ッ ト を 用 い て 、 12 回 の 実 験 に 分 け て 酵 母 81 株 の コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 活 性 を 比 較 し た 。 酵 母 は 高 コ レ ス テ ロ ー ル 食 に 10%混 餌 し 、 7 日 間 自 由 摂 取 さ せ て 、 血 漿 総 コ レ ス テ ロ ー ル の 上 昇 抑 制 率 を 求 め た 。 高 コ レ ス テ ロ ー ル 食 の み を 与 え た ラ ッ ト の 摂 餌 量 、 体 重 増 加 量 お よ び 血 漿 総 コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 は 、そ れ ぞ れ 146～ 162 g/7 日 、42.4～ 45.9 g/7 日 お よ び 224～ 259 mg/dL で あ っ た 。 ま た 、 通 常 食 を 与 え た ラ ッ ト の 摂 餌 量 、 体 重 増 加 量 お よ び 血 漿 総 コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 は 、そ れ ぞ れ 148～ 166 g/7 日 、41.6～ 46.0 g/7 日 お よ び 53.9～ 67.2 mg/dL で あ っ た 。 Table 3 に 示 す よ う に 、血 漿 総 コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 の 上 昇 抑 制 率 は 、混 餌 投 与 し た 酵 母 の 菌 株 に よ っ て 大 き く 異 な っ た 。血 漿 総 コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 は 43 株 の 酵 母 の 投 与 に よ っ て 有 意 に 低 下 し た が 、 ビ ー ル 酵 母 や パ ン 酵 母 、 C. utilis 等 を 投 与 し た 場 合 に は 変 化 が 認 め ら れ な か っ た 。 試 験 に 供 し た K. marxianus 5 株 、 Candida kefyr 3 株 、 お よ び

Candida gropengiesseri 2 株 は 、す べ て 血 漿 総 コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 を 有 意 に 低 下 さ せ た 。

ま た 、 Pichia anomala は 4 株中 3 株、Saccharomyces bayanus は 4 株中 2 株、Torulaspora

delbrueckii は 6 株中 2 株が血漿総コレステロール濃度を低下させたが、Zygosaccharomyces rouxii 2 株 と Yarrowia lipolytica 2 株 は い ず れ も コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 活 性 を 示 さ な か っ た 。

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考 察

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Table 1. Composition of the Normal Diet, High Cholesterol Diet and Diets of Experiment 3

Ingredients ND HCD 1.0% KM 3.0% KM 10% KM 10% BR 10% BA 10% CU (g/kg of diet) Casein 223.0 223.0 218.4 209.1 176.7 173.5 174.5 175.6 Sucrose 565.5 558.0 556.2 552.6 539.9 540.4 541.0 539.8 Mineral mix a 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 Vitamin mix a 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 Soy oil 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 Lard 100.0 100.0 99.7 99.1 97.1 95.1 94.5 97.1 Choline bitartrate 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 Cholesterol 0.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 Sodium cholate 0.0 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 Cellulose 50.0 50.0 46.7 40.2 17.3 22.0 21.0 18.5 KM 0.0 0.0 10.0 30.0 100.0 0.0 0.0 0.0 BR 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0 0.0 0.0 BA 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0 0.0 CU 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0 a

The vitamin and mineral mixtures were those of AIN -76.

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Table 2. Compositions of the Yeast Strains

KM BR BA CU (g/kg) Crude protein a 463 495 485 474 Crude fat a 29 49 55 29 Dietary fiber a 327 280 290 315 Ash a 52 47 48 53 Moisture a 79 81 81 83 Carbohydrate b 50 48 41 46 a

Analysis was carried out according to the Association of Official Analytical Chemists. 2 1 ) Each result is expressed as the mean value of three replicates.

b

Components excluding protein, fat, dietary fiber, ash, and moisture were regarded as carbohydrate.

KM, Kluyveromyces marxianus YIT 8292; BR, brewer ’s yeast; BA, baker ’s yeast; CU,

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Table 3. Hypocholesterolemic Activities of 81 Yeast Strains in Rats Fed a High C holesterol

Diet (Experiments 1 and 2)

Strain

Lowering ratio of plasma total cholesterol [%] a Experiment 1

(10% in an HCD for 7 d)

Experiment 2 (5% in an HCD for 14 d)

Kluyveromyces marxianus YIT 8292 70±11** 59±17* *

Kluyveromyces marxianus YIT 8263 69±15** 51±9* *

Kluyveromyces marxianus YIT 8261 66±15** 33±26* *

Hanseniaspora uvarum YIT 8164 65±12** 42±12* *

Pichia guilliermondii YIT 8301 65±13** 35±13* *

Kluyveromyces marxianus YIT 8293 62±19** 40±11* *

Candida kefir YIT 8237 61±12** 49±23* *

Candida etchellsii YIT 8278 60±18** 39±19* *

Candida kefir YIT 8208 59±12** 41±15* *

Issatchenkia orientalis YIT 8266 59±12** 41±17* *

Schizosaccharomyces pombe YIT 8167 59±8** 30±23*

Pichia farinosa YIT 8058 54±27** 41±13* *

Kloeckera Africana YIT 8165 52±21** 33±18* *

Candida kefir YIT 8268 50±11** 27±16

Saccharomyces exiguus YIT 8109 49±11** 35±18* *

Torulaspora delbrueckii YIT 8114 49±13** 40±18* *

Torulaspora delbrueckii YIT 8313 49±11** 30±15*

Kluyveromyces marxianus YIT 8104 48±18** 30±12*

Saccharomyces dairensis YIT 8191 48±15** 19±21

Candida glabrate YIT 8280 47±9** 30±14*

Saccharomyces bayanus YIT 8113 47±21** 31±14* *

Saccharomycodes ludwigii YIT 8310 47±22** 30±17*

Candida molischiana YIT 8284 46±9** 31±21*

Debariomyces hansenii YIT 8026 45±16** 35±14* *

Hyphopichia burtonii YIT 8299 45±14** 21±18

Pichia anomala YIT 8298 44±17** 32±16* *

Pichia anomala YIT 8296 44±18** 27±19* *

Saccharomyces unisporus YIT 8226 44±18** 27±20*

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Zygosaccharomyces bailii YIT 8122 43±10** 25±16

Pichia anomala YIT 8297 43±11** 9±25

Saccharomyces bayanus YIT 8128 42±7** Nd

Candida gropengiesseri YIT 8281 41±11** Nd

Kluyveromyces thermotolerans YIT 8294 41±17** Nd

Metshnikowia pulcherrima YIT 8295 41±22** Nd

Pichia etchellsii YIT 8300 41±15** Nd

Candida magnoliae YIT 8159 40±8** Nd

Issatchenkia terricola YIT 8291 40±15* Nd

Pichia capsulata YIT 8247 40±5** Nd

Pichia subpelliculosa YIT 8303 40±10** Nd

Candida diversa YIT 8277 39±14* Nd

Candida gropengiesseri YIT 8223 39±27** Nd

Candida parapsilosis YIT 8006 39±22* Nd

Candida guilliermondii YIT 8282 38±21* Nd

Candida stellata YIT 8285 38±16 Nd

Candida valida YIT 8241 38±23* Nd

Zygosaccharomyces bisporus YIT 8316 37±17* Nd

Torulaspora delbrueckii YIT 8133 36±17 Nd

Yarrowia lipolytica YIT 8314 36±13* Nd

Pichia membranaefaciens YIT 8302 33±17* Nd

Saccharomycopsis fibuligera YIT 8311 32±14 Nd

Torulaspora delbrueckii YIT 8110 32±20 Nd

Wiliopsis calfornica YIT 8034 32±27 Nd

Candida versatilis YIT 8287 31±28 Nd

Saccharomyces bayanus YIT 8127 31±39 Nd

Torulaspora delbrueckii YIT 8107 31±17 Nd

Backers yeast 30±10 Nd

Candida vini YIT 8288 29±10 Nd

Saccharomyces unisporus YIT 8138 28±17 Nd

Zygosaccharomyces bisporus YIT 8100 28±18 Nd

Candida solani YIT 8023 27±5 Nd

Pichia anomala YIT 8033 27±19 Nd

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Yarrowia lipolytica YIT 8012 25±26 Nd

Zygosaccharomyces rouxii YIT 8317 24±10 Nd

Crytocooccus aldidus YIT 8289 20±18 Nd

Pichia holstii YIT 8038 20±11 Nd

Candida cylindracea YIT 8276 19±32 Nd

Rhodotorula minuta YIT 8181 18±26 Nd

Saccharomycopsis malanga YIT 8312 18±23 Nd

Candida tropicalis YIT 8286 17±28 Nd

Rhodotorula glutinis YIT 8304 15±23 Nd

Saccharomyces bayanus YIT 8126 15±39 Nd

Brewer’s yeast 15±24 Nd

Candida maltosa YIT 8283 8±39 Nd

Pachyticospora transvaalensis YIT 8120 1±14 Nd

Candida famata YIT 8279 -1±20 Nd

Zygosaccharomyces rouxii YIT 8129 -5±34 Nd

Candida utilis YIT 8204 -13±37 Nd

Torulaspora delbrueckii YIT 8117 -21±39 Nd

Zygosaccharomyces bailii YIT 8315 -40±44 Nd

a

Values are presented as mean±SD (n = 8). HCD, high cholesterol diet; Nd: not determined.

In the column corresponding to experiment 1, strains are arranged in descending order of the lowering ratio of plasma total cholesterol.

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Table 4. Food Intake, Body Weight Gain, and Liver Weight (Experiment 3)

Diet Food intake (g/14 d)

Body weight gain (g/14 d)

Liver fresh weight (g) ND 210±0 53.2±7.0 9.7±0.2 c HCD 210±0 51.6±2.6 12.4±0.5 a 1% KM 210±0 52.1±4.0 12.6±0.4 a 3% KM 210±0 49.9±4.3 12.2±0.6 a b 10% KM 210±0 53.0±3.9 11.5±0.4 b 10% BR 210±0 52.7±5.3 12.6±0.5 a 10% BA 210±0 52.5±4.9 12.5±0.5 a 10% CU 210±0 51.9±6.2 12.4±0.3 a

Values are presented as mean ±SD (n = 8). Mean values within a column not sharing a common letter are significantly different (p < 0.05).

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Table 5. Triglyceride and Phospholipid in Plasma and Liver (Experiment 3)

Diet

Plasma Liver

Triglyceride Phospholipid Triglyceride Phospholipid

[mg/dL] [mg/Liver] ND 89.7±18.6 105±15 b 197±7 e 149±26 d HCD 75.6±23.1 170±28 a 272±26 b c 516±74 a b 1% KM 79.3±25.2 175±20 a 277±17 b c 563±87 a 3% KM 107.8±27.3 174±34 a 257±23 cd 413±56 b c 10% KM 95.7±32.6 152±21 a b 236±13 d 355±61 c 10% BR 73.8±12.5 185±24 a 318±31 a 576±84 a 10% BA 96.3±30.5 176±21 a 299±32 a b 534±74 a 10% CU 82.8±34.0 166±48 a 270±25 b c d 549±62 a Values are presented as mean ±SD (n = 8). Mean values within a column not sharing a common letter are significantly different (p < 0.05).

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Fig. 1. Effects of K. marxianus YIT 8292 (KM), Brewer ’s Yeast (BR), Baker ’s Yeast (BA) ,

and C. utilis YIT 8204 (CU) on Plasma Total Cholesterol (A), HDL -Cholesterol (B), and Content of Total Cholesterol in the Liver (C) in Rats Fed a High Cholesterol Diet

(Experiment 3).

Each value is the mean ±SD (n = 8). Values with different letters are significantly different (p < 0.05). ND, normal diet; HCD, high cholesterol diet .

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第 2 章 K. marxianus YIT 8292 の活性成分と作用メ カニズ ム

緒 言

先 行 研 究 に お い て 、ビ ー ル 酵 母 あ る い は パ ン 酵 母 の 細 胞 壁 画 分 や β-グ ル カ ン が 血 中 コ レ ス テ ロ ー ル レ ベ ル を 低 下 さ せ る こ と が 確 認 さ れ て い る (8, 9, 31)。 酵 母 細 胞 壁 の 主 要 構 成 成 分 は 、β-グ ル カ ン や α-マ ン ナ ン 等 の 食 物 繊 維 で あ る (16, 32)。水 溶 性 食 物 繊 維 や キ ト サ ン 等 の 食 物 繊 維 は コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 活 性 を 有 す る (24-30)。そ れ ら の 作 用 機 序 は 完 全 に は 明 ら か で な い も の の 、 幾 つ か の 機 序 が 提 唱 さ れ て い る (5, 27)。 代 表 的 な 機 序 と し て 、 コ レ ス テ ロ ー ル 吸 収 の 抑 制 、 お よ び 、 コ レ ス テ ロ ー ル の 主 要 な 異 化 産 物 で あ る 胆 汁 酸 の 排 泄 促 進 が あ る 。 も う 一 つ の 機 序 と し て は 、 短 鎖 脂 肪 酸 を 介 し た コ レ ス テ ロ ー ル 代 謝 へ の 作 用 が 挙 げ ら れ る 。 短 鎖 脂 肪 酸 は 、 下 部 消 化 管 に お い て 食 物 繊 維 の 腸 内 細 菌 に よ る 発 酵 に よ っ て 生 じ る 代 謝 産 物 で あ る 。 あ る 種 の 食 物 繊 維 の コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 活 性 に は 、 少 な く と も 一 部 は 短 鎖 脂 肪 酸 に よ る コ レ ス テ ロ ー ル 生 合 成 の 阻 害 が 関 与 す る と 考 え ら れ て い る (27,34-38)。 本 章 で は 、K. marxianus YIT 8292 の 活 性 成 分 を 明 ら か に す る た め に 、菌 体 を 分 画 し 、 コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 活 性 の 局 在 を 調 べ た 。ま ず 、菌 体 を 熱 水 抽 出 し て 粗 細 胞 壁 画 分（ K.

marxianus YIT 8292 crude cell wall, KM-CW） と 水 溶 性 抽 出 物 -1 に 分 け た 。 KM-CW は

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材 料 お よ び 方 法

微 生 物 お よ び 培 養 条 件

(株 )ヤ ク ル ト 本 社 中 央 研 究 所 で 系 統 保 管 さ れ て い る K. marxianus YIT 8292 お よ び

Arthrobacter GJM-1（ ATCC 33522） を 用 い た 。

K. marxianus YIT 8292 の 培 地 組 成 は 、30 g/L Glc、10 g/L polypeptone、5 g/L yeast extract、

1 g/L KH2PO4、 2 g/L K2HPO4お よ び 0.5 g/L MgSO4·7H2O と し 、 10L ジ ャ ー フ ァ メ ン タ ー を 用 い て 、 培 養 温 度 28°C、 通 気 速 度 0.5 vvm、 攪 拌 速 度 800 rpm、 培 養 時 間 は 24 時 間 と し た 。 培 養 期 間 中 、 pH は 5N NaOH 溶 液 を 用 い て 6.0 に 下 限 制 御 し た 。 酵 母 は 培 養 液 か ら 3,000×g で 10 分 間 遠 心 分 離 し て 回 収 し た 。酵 母 を 蒸 留 水 で 2 回 洗 浄 し て 115°C で 10 分 間 加 熱 し た 後 、 凍 結 乾 燥 し て 粉 末 化 し た 。 Arthrobacter GJM-1 は Jones ら の 方 法 (39)に 従 っ て 、パ ン 酵 母 由 来 の α-マ ン ナ ン を 唯 一 の 炭 素 源 と す る 培 地 を 用 い て 、10L ジ ャ ー フ ァ メ ン タ ー で 通 気 条 件 下（ 通 気 速 度 0.5 vvm、攪 拌 速 度 700 rpm）、30°C、24 時 間 培 養 し た 。パ ン 酵 母 か ら の α-マ ン ナ ン の 調 製 は 、 Ballou ら の 方 法 (40)に 従 っ て 行 っ た 。 K. marxianus YIT 8292 の 菌 体 の 分 画

Fig. 2 の ス キ ー ム に 従 っ て 2 段 階 の 工 程 に よ っ て 、 K. marxianus YIT 8292 の 菌 体 か ら 4 種 類 の 画 分 を 分 画 し た 。最 初 の 工 程 で は 、生 菌 体 を 蒸 留 水 に 懸 濁 し て 115°C で 10 分 間 加 熱 し た 後 、 3,000×g で 10 分 間 遠 心 し て 細 胞 壁 を 含 む 沈 殿 と 上 清 と に 分 離 し た 。 沈 殿 は 蒸 留 水 で 7 回 洗 浄 し 、粗 細 胞 壁 画 分（ KM-CW）と し た 。上 清 と 洗 液 は 混 合 し て 凍 結 乾 燥 し 、 抽 出 物 -1 と し た 。

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プ ロ テ ア ー ゼ 活 性 は な く 、-(1,3)お よ び-(1,6)-グ ル カ ン な ら び に キ チ ン に 対 す る 分 解 活 性 も 検 出 さ れ な か っ た 。

KM-CW の 酵 素 的 分 解

KM-CW を 10 mM リ ン 酸 緩 衝 液 （ 0.3 mM CaCl2を 含 む ， pH 6.8） に 懸 濁 し 、 プ ロ ナ

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結 果

試 験 1: K. marxianus YIT 8292 の 粗 細 胞 壁 画 分 と 抽 出 物 -1 が 血 漿 お よ び 肝 臓 脂 質 に 及 ぼ す 影 響

28 繊 維 は 、 高 い コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 活 性 を 有 し 、 高 コ レ ス テ ロ ー ル 負 荷 ラ ッ ト に お い て 3～ 10%の 混 餌 投 与 量 で 有 効 性 を 示 す (27-30)。K. marxianus YIT 8292 の 細 胞 壁 多 糖 は 不 溶 性 食 物 繊 維 で あ る が 、 水 溶 性 食 物 繊 維 と 同 等 の 混 餌 投 与 量 に お い て 高 い コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 活 性 を 示 し た 。 水 溶 性 食 物 繊 維 は 粘 性 を 有 し 、 低 濃 度 で も 水 溶 液 中 で ゲ ル 様 の 塊 を 形 成 す る た め 、 そ の 食 品 へ の 利 用 は ゼ リ ー 等 の 特 定 の 形 態 に 限 定 さ れ る 。 K. marxianus YIT 8292 の 細 胞 壁 は 粘 性 が 低 く 、 不 溶 性 で あ り ゲ ル を 形 成 し な い た め 、 食 品 素 材 と し て 優 れ た 特 性 を 持 つ も の と 考 え ら れ た 。 本 章 で は 、 K. marxianus YIT 8292 の 細 胞 壁 の コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 活 性 に 関 わ る 作 用 メ カ ニ ズ ム に つ い て も 解 析 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 KM-CW お よ び KM-W は 、 コ レ ス テ ロ ー ル と そ の 腸 内 代 謝 産 物 で あ る コ プ ロ ス タ ノ ー ル 、 コ プ ロ ス タ ノ ン か ら 成 る 中 性 ス テ ロ ー ル の 糞 便 排 泄 量 を 有 意 に 増 加 さ せ る こ と が 明 ら か に な っ た 。水 溶 性 食 物 繊 維 は 、 小 腸 か ら の コ レ ス テ ロ ー ル の 吸 収 を 抑 制 し 、 中 性 ス テ ロ ー ル の 糞 便 排 泄 を 促 進 す る こ と が 報 告 さ れ て い る (48,49)。 よ っ て 、 K. marxianus YIT 8292 の 細 胞 壁 も コ レ ス テ ロ ー ル の 吸 収 を 抑 制 す る こ と に よ っ て 、 中 性 ス テ ロ ー ル の 糞 便 排 泄 を 促 進 し た 可 能 性 が 考 え ら れ た 。 ま た 、 KM-CW お よ び KM-W は 、 コ レ ス テ ロ ー ル の 主 要 な 異 化 産 物 で あ る 胆 汁 酸 の 糞 便 排 泄 量 も 有 意 に 増 加 さ せ た 。 胆 汁 酸 は 食 事 由 来 の 脂 質 や 脂 溶 性 ビ タ ミ ン 類 の ミ セ ル 化 と 消 化 ・ 吸 収 に 必 須 な だ け で は な く 、 エ ネ ル ギ ー 代 謝 等 に 関 わ る シ グ ナ ル 分 子 と し て も 重 要 な 役 割 を 担 う 。 生 体 は 主 に 肝 臓 で の コ レ ス テ ロ ー ル か ら の 胆 汁 酸 合 成 を 負 の フ ィ ー ド バ ッ ク 機 構 で 制 御 す る こ と に よ り 、 胆 汁 酸 の プ ー ル サ イ ズ を 一 定 に 保 っ て い る (50-54)。し た が っ て 、胆 汁 酸 排 泄 量 の 増 加 は コ レ ス テ ロ ー ル の 胆 汁 酸 へ の 異 化 を 促 進 す る 可 能 性 が あ る 。 実 際 に 、 コ レ ス テ ロ ー ル か ら の 胆 汁 酸 合 成 の 律 速 酵 素 で あ る コ レ ス テ ロ ー ル 7α-水 酸 化 酵 素 の 活 性 を 調 べ た 結 果 、 KM-CW と KM-W の 投 与 に よ っ て 有 意 な 上 昇 が み ら れ た 。 し た が っ て 、 K. marxianus YIT 8292 の 細 胞 壁 は 胆 汁 酸 の 糞 便 排 泄 量 を 増 加 さ せ る こ と に よ っ て 、 コ レ ス テ ロ ー ル の 胆 汁 酸 へ の 異 化 を 促 進 し た こ と が 示 唆 さ れ た 。 さ ら に 、本 章 で 得 た 結 果 は 、盲 腸 に お け る 短 鎖 脂 肪 酸 産 生 の 増 加 も K. marxianus YIT 8292 の コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 活 性 に 寄 与 す る 可 能 性 を 示 す 。 肝 細 胞 を 用 い た in vitro 実 験 で は 、 短 鎖 脂 肪 酸 、 特 に プ ロ ピ オ ン 酸 が コ レ ス テ ロ ー ル 生 合 成 を 抑 制 す る こ と が 示 さ れ て い る (34,35)。 In vivo に お い て は 矛 盾 し た 結 果 も 報 告 さ れ て い る が (54)、 幾 つ か の 研 究 は 、 あ る 種 の 食 物 繊 維 の コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 活 性 に は 、 少 な く と も 一 部 は 短 鎖 脂 肪 酸 に よ る コ レ ス テ ロ ー ル 生 合 成 の 阻 害 が 関 与 す る こ と を 示 唆 す る (27,34-38)。よ っ て 、 K. marxianus YIT 8292 の 細 胞 壁 多 糖 の 腸 内 発 酵 産 物 で あ る 短 鎖 脂 肪 酸 が コ レ ス テ ロ ー ル 生 合 成 の 抑 制 に 関 与 し た 可 能 性 が 考 え ら れ た 。 第 1 章 で は 、 酵 母 の コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 活 性 が 菌 種 や 菌 株 に よ っ て 顕 著 に 異 な り 、

K. marxianus に 属 す る 菌 株 、 特 に K. marxianus YIT 8292 が パ ン 酵 母 や ビ ー ル 酵 母 に 比

30

Table 6. Composition of the Experimental Diets (g/kg)

Ingredient Control KM Soluble Ex-1 KM-CW or its degradation product Soluble Ex-2 KM-W Casein 223 200 197 202 185 212 Sucrose 558 548 539 554 553 554 Mineral mixturea 40 40 40 40 40 40 Vitamin mixturea 10 10 10 10 10 10 Soy oil 10 10 10 10 10 10 Lard 100 99 98 98 98 98 Choline bitartate 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 Cholesterol 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 Sodium cholate 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 Cellulose 50 34 47 27 45 17 KM 0 50 0 0 0 0 Soluble Ex-1 0 0 50 0 0 0 KM-CW or its degradation product 0 0 0 50 0 0 Soluble Ex-2 0 0 0 0 50 0 KM-W 0 0 0 0 0 50

KM, whole cells of Kluyveromyces marxianus YIT 8292; Ex, extract; KM-CW, crude cell wall of K. marxianus YIT 8292; KM-W, cell wall of K. marxianus YIT 8292

a

31

Table 7. Composition of the Test Samples (%)

KM Soluble Ex-1 KM-CW Soluble Ex-2 KM-W Crude protein a 46.3 52.5 41.5 76.7 21.3 Crude fat a 2.9 5.0 3.8 4.1 3.2 Ash a 5.2 10.1 2.9 3.4 5.4 Moisture a 7.9 9.2 3.8 4.3 1.9 Carbohydrate b 5.0 17.4 2.5 2.0 1.2 Dietary fiber a 32.7 5.8 45.5 9.5 67.0 IDF c 30.3 ND 43.4 ND 64.3 SDF c 2.4 ND 2.1 ND 2.7

Each result is expressed as the mean value of three replicates.

KM, whole cells of Kluyveromyces marxianus YIT 8292; Ex, extract; KM-CW, crude cell wall of K. marxianus YIT 8292; KM-W, cell wall of K. marxianus YIT 8292; ND, not determined; IDF, insoluble dietary fiber; SDF, soluble dietary fiber

a

The analysis was carried out according to the Association of Official Analytical Chemists.2 1 )

b

Components excluding protein, fat, dietary fiber, ash and moisture are regarded as carbohydrate.

c

32

Table 8. Effect of KM, Extract 1, and KM-CW on the Body Weight Gain, Food Intake,

Plasma Lipids, and Liver Lipids in Rats Fed on a High-cholesterol Diet (Experiment 1)

Control KM Soluble

Ex-1 KM-CW Body weight gain (g/14 d) 95.7±3.6 94.7±5.3 95.5±2.9 93.8±8.0 Food intake (g/14 d) 245±14 243±10 231±11 233±11 Plasma lipids (mg/dL) Total cholesterol 287±58a 186±33b 295±49a 173±21b HDL-cholesterol 22.9±4.1 24.0±2.9 22.4±3.0 24.5±2.1 Triglyceride 158±47 159±57 166±84 146±83 Phospholipid 184±24 168±24 187±21 165±19 Liver fresh weight (g) 13.6±1.3 13.0±1.0 13.0±1.0 13.0±1.0 Liver lipids (mg/ g of liver)

33

Table 9. Effect of KM-CW, Extract 2, and KM-W on the Body Weight Gain, Food Intake,

Plasma Lipids, and Liver Lipids in Rats Fed on a High-cholesterol Diet (Experiment 2)

Control KM-CW Soluble

Ex-2 KM-W

Body weight gain (g/14 d) 95.9±4.0 93.6±11.9 86.5±6.8 90.8±9.7 Food intake (g/14 d) 236±9 230±9 225±10 228±10 Plasma lipids (mg/dL) Total cholesterol 254±40a 170±13b 237±32a 151±16b HDL-cholesterol 21.8±3.2 23.1±3.0 23.6±2.5 25.2±1.9 Triglyceride 144±36 161±61 169±78 140±71 Phospholipid 179±26 159±23 179±19 158±16

Liver fresh weight (g) 12.3±1.0a 11.2±0.7b 11.6±0.7a b 10.9±0.6b Liver lipids (mg/ g of liver)

Total cholesterol 50.2±3.4a 39.7±3.3b 50.2±4.6a 37.1±2.7b Triglyceride 58.1±9.4 57.7±7.6 59.6±2.9 58.3±3.1 Phospholipid 28.9±1.5 28.6±1.8 30.7±1.3 27.7±1.7

34

Table 10. Effect of KM-CW, Extract 2, and KM-W on the Fecal Excretion of Sterols, Hepatic

Cholesterol 7-Hydroxylase Activity, and Cecal Short-Chain Fatty Acids in Rats Fed on a High-cholesterol Diet (Experiment 2)

Control KM-CW

Soluble

Ex-2 KM-W Fecal sterol excretion (mol/3 d)

Neutral sterols 89±18a 171±10b 111±17a 194±18c Bile acids 154±27a 188±17b 162±28a b 191±26b Total sterols 243±42a 359±21b 273±41a 385±39b Hepatic CYP7A activity

(pmol/min/mg of protein). 25±9

a

40±10b 31±11a b 44±12b

Cecal content (g) 2.7±0.6a 3.4±0.8a b 3.0±0.6a b 3.8±0.6b SCFA (mol/g of cecal content)

Acetate 27±8 31±5 28±6 33±7

Propionate 7±2a 14±5b 10±2a b 13±5b

Butyrate 2.2±1.4 2.1±0.7 2.0±0.9 2.2±0.7

Total SCFA 36±10a 47±4b 40±7a b 48±10b

Each value is the mean ± SD (n = 8).

35

Fig. 2. Procedure for Fractionating Kluyveromyces marxianus YIT 8292.

Kluyveromyces marxianus YIT 8292

Autoclaving (115

°C

, 10 min)

Centrifugation (3000g, 10 min)

Supernatant

Precipitate

Extract 1

Crude cell wall

(KM-CW)

Mechanical disruption

Centrifugation (5000g, 20 min)

Supernatant

Precipitate

Extract 2

Cell wall

36

Fig. 3. Insoluble and Soluble Dietary Fiber Contents of KM -CW and Its Degradation

Products.

Each result is expressed as the mean value of three replicates. KM -CW, crude cell wall of

Kluyveromyces marxianus YIT 8292; P product, pronase digestion product of KM-CW; PM

product, -mannosidase digestion product of the P product; PG product, β-glucanase digestion product of the P product; PMG product, -mannosidase/β-glucanase digestion product of the P product.

37

Fig. 4. Effect of KM-CW and Its Degradation Products on Plasma Total Cholesterol in Rats

Fed on a High -cholesterol Diet (Experiment 3) .

Each value is the mean ±SD (n = 8). Values with different letters are significantly different (p < 0.05). KM-CW, crude cell wall of Kluyveromyces marxianus YIT 8292; P product, pronase digestion product of KM -CW; PM product, -mannosidase digestion product of the P product; PG product, -glucanase digestion product of the P product; PMG product, -mannosidase/-glucanase digestion product of the P product.

38

Fig. 5. Effect of KM-CW and Its Degradation Products on Liver Total Cholesterol in Rats

Fed on a High -cholesterol Diet (Experiment 3).

39

第 3 章 酵母細胞壁の表層多糖構造とコレステロール低下活性との相関

緒 言

酵 母 細 胞 壁 は 、β-(1,3)-グ ル カ ン 、β-(1,6)-グ ル カ ン お よ び 少 量 の キ チ ン か ら 成 る 内 層 と そ の 表 面 を 覆 うα-マ ン ナ ン を 豊 富 に 含 む マ ン ノ プ ロ テ イ ン か ら 成 る 外 層 に 大 別 さ れ る (32)。 細 胞 壁 に 占 め る β-グ ル カ ン と α-マ ン ナ ン の 割 合 と そ れ ら 多 糖 の 構 造 は 、 菌 株 に よ っ て 異 な る と 言 わ れ て い る が (55-59)、中 で も α-マ ン ナ ン の N 結 合 型 糖 鎖 の 側 鎖 構 造 に は 顕 著 な 違 い が あ り 、 酵 母 の 血 清 学 的 分 類 に 利 用 さ れ て い る 。

こ れ ま で に S. cerevisiae、Saccharomyces italicus、Candida albicans、Candida kefyr お よ び Kluyveromyces lactis 等 で α-マ ン ナ ン の 構 造 が 決 定 さ れ て い る (40,56)。N-結 合 型 糖 鎖 の 主 鎖 は 、マ ン ノ ー ス（ Mannose, Man）が α-(1,6)-結 合 で 直 鎖 状 に 伸 長 し た 構 造 で あ り 、 菌 種 ・ 菌 株 間 で 共 通 す る 構 造 と 考 え ら れ て い る 。 主 鎖 か ら は α-(1,2)-結 合 で Man が 分 岐 し 、さ ら に 属 あ る い は 種 特 異 的 な 結 合 様 式 で 伸 長 し て 側 鎖 を 形 成 す る 。K. lactis は S. cerevisiae と 類 似 し た 側 鎖 構 造 を 有 す る が 、 リ ン 酸 基 を 介 し た 分 岐 構 造 を 欠 き 、 ま た 一 部 の 側 鎖 末 端 が N-ア セ チ ル グ ル コ サ ミ ン に 置 換 さ れ て い る 点 が 異 な る (56,57)。 Ballou は Kluyveromyces 属 の K. marxianus や K. dobzhanskii も K. lactis と 同 様 の 側 鎖 構 造 を 有 す る と 報 告 し て い る (56)。一 方 、Kobayashi ら は 、K. marxianus の 不 完 全 世 代 と 考 え ら れ て い る C. kefyr の IFO 0586 株 に 関 し て 、α-マ ン ナ ン は α-(1,6)-結 合 の 主 鎖 と 短 い α-(1,2)-結 合 の 側 鎖 か ら 成 り 、 S. cerevisiae や K. lactis の 糖 鎖 構 造 と は 異 な り 、 リ ン 酸 基 と 側 鎖 末 端 の α-(1,3)-結 合 の Man 残 基 を 欠 く と 報 告 し て い る (58,59)。 Ballou ら は α-マ ン ナ ン の 側 鎖 の 合 成 メ カ ニ ズ ム を 解 析 す る た め に 、 S. cerevisiae X2180-1A か ら そ の 合 成 経 路 に 欠 損 を 持 つ 種 々 の 変 異 株 を 単 離 し 、 そ れ ぞ れ の α-マ ン ナ ン の 側 鎖 構 造 を 明 ら か に し て い る (40,56,60)。 mnn4 変 異 株 は リ ン 酸 基 を 介 し た 分 岐 構 造 、 mnn1 変 異 株 は 側 鎖 末 端 の α-(1,3)-結 合 の Man 残 基 を 欠 く 。 ま た 、 mnn5 変 異 株 は 側 鎖 へ の 2 番 目 の α-(1,2)-結 合 に よ る Man の 伸 長 が 欠 損 し て お り 、C. kefyr IFO 0586 の 側 鎖 と 同 様 な 構 造 を 有 す る 。こ れ ら の 変 異 株 は α-マ ン ナ ン の 構 造 活 性 相 関 の 解 析 に 利 用 可 能 で あ る 。

本 章 で は 、高 い コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 活 性 を 有 す る K. marxianus YIT 8292 の α-マ ン ナ ン の 側 鎖 構 造 を 解 析 し 、 そ の 構 造 的 特 徴 と コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 活 性 と の 関 係 を S.

40

材 料 お よ び 方 法

微 生 物 お よ び 培 養 条 件

S. cerevisiae X2180-1A（ MATα SUC2 mal mel gal2 CUP1 ）、 お よ び そ の 変 異 株 で あ る mnn4（ LB6-5D MATα mnn4-1 SUC2 mal CUP1）、mnn1 mnn4（ LB 97 -3C MATα mnn1 mnn4）、 mnn5（ LB65-5D MATα mnn5） は 、 American Type Culture Collection か ら 入 手 し た 。 他

の 菌 株 は 、 (株 )ヤ ク ル ト 本 社 中 央 研 究 所 で 系 統 保 管 さ れ て い る 菌 株 ス ト ッ ク を 培 養 し て 菌 体 を 調 製 し た 。培 地 組 成 は 30 g/L Glc、10 g/L polypeptone、5 g/L yeast extract、2 g/L KH2PO4、5 g/L K2HPO4お よ び 0.5 g/L MgSO4·7H2O と し 、10L ジ ャ ー フ ァ メ ン タ ー を 用 い て 、 培 養 温 度 30°C、 通 気 速 度 0.5 vvm、 攪 拌 速 度 800 rpm、 培 養 時 間 は 24 時 間 と し た 。 培 養 期 間 中 、 5N NaOH 溶 液 を 用 い て pH は 6.0 に 下 限 制 御 し た 。 酵 母 は 培 養 液 か ら 3,000×g で 10 分 間 遠 心 分 離 し て 回 収 し た 。 酵 母 粗 細 胞 壁 画 分 お よ び α-マ ン ナ ン の 調 製 酵 母 の 生 菌 体 を 蒸 留 水 に 懸 濁 し 、115°C で 10 分 間 加 熱 し た 後 、3,000×g で 10 分 間 遠 心 し て 沈 殿 を 分 離 し た 。 沈 殿 は 蒸 留 水 で 7 回 洗 浄 し 、 粗 細 胞 壁 画 分 と し た 。 Ballau ら の 方 法 (40)に 従 っ て 、 α-マ ン ナ ン は 粗 細 胞 壁 画 分 を 0.1M ク エ ン 酸 緩 衝 液 （ pH7.0） 中 で 120°C、 90 分 間 加 熱 抽 出 し た 後 、 さ ら に エ タ ノ ー ル 沈 殿 、 お よ び 、 hexadecyltrimethylammonium bromide （ Cetavlon） と ホ ウ 酸 に よ る 選 択 的 沈 殿 を 行 う こ と に よ っ て 精 製 し た 。

粗 細 胞 壁 画 分 の 栄 養 成 分 の 分 析

粗 タ ン パ ク 、 粗 脂 質 お よ び 総 食 物 繊 維 含 量 は AOAC 法 (21)に よ っ て 測 定 し た 。 水 溶 性 食 物 繊 維 と 不 溶 性 食 物 繊 維 は Prosky 法 (41)に よ っ て 測 定 し た 。

細 胞 表 層 の 疎 水 性 度 (cell curface hydrophobisity, CSH)の 分 析

粗 細 胞 壁 の CSH は 既 報 (61)に 従 い 、疎 水 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ っ て 決 定 し た 。粗 細 胞 壁 を 100 mM 酢 酸 緩 衝 液 （ pH 4.2） で 2 回 洗 浄 し た 後 、 最 終 濃 度 が 15 mg/mL と な る よ う に 同 緩 衝 液 に 再 懸 濁 し た 。GE Healthcare 社 製 の 疎 水 カ ラ ム（ Phenyl Sepharose 6 Fast Flow） を 0.6 cm×3.7 cm の カ ラ ム （ Bio-Rad 社 製 ） に 1.0 mL 充 填 し 、 100 mM 酢 酸 緩 衝 液（ 125 mM NaCl を 含 む , pH 5.0） で 平 衡 化 し た 。 細 胞 壁 の 懸 濁 液 50 μL を カ ラ ム に チ ャ ー ジ し て 、 3mL の 100 mM 酢 酸 緩 衝 液 （ 125 mM NaCl を 含 む , pH 5.0)で 溶 出 し た 。 溶 出 液 の OD6 6 0（ Ae l u en t）、 お よ び 、 細 胞 壁 懸 濁 液 を 溶 出 用 緩 衝 液 3mL で 希 釈 し

た 溶 液 の OD6 6 0（ Aa p p l i e d） を 測 定 し 、 次 式 か ら 疎 水 性 度 を 求 め た 。

42

43

結 果

K. marxianus YIT 8292 の α-マ ン ナ ン の 構 造 解 析

Table 13 に 示 し た よ う に 、 K. marxianus YIT 8292 か ら 単 離 し た α-マ ン ナ ン は 、 大 部 分 が 炭 水 化 物 で あ り 、 そ の 98%を Man が 占 め た 。 ま た 、 リ ン 酸 含 量 は 50 μmol/g で あ っ た 。S. cerevisiae X2180-1A や パ ン 酵 母 で あ る S. cerevisiae YIT 10025 か ら 単 離 し た α-マ ン ナ ン の リ ン 酸 含 量 を 調 べ た と こ ろ 、 そ れ ぞ れ 230 μmol/g、 200 μmol/g で あ っ た 。

K. marxianus YIT 8292 の α-マ ン ナ ン の 1H-NMR、1 3C-NMR DEPT 135、HSQC、HMBC お よ び COSY-NMR ス ペ ク ト ル を Fig. 6 に 示 し た 。1 H-NMR ス ペ ク ト ル で は 5.09 ppm、 5.01 ppm に 2 本 の 強 い ア ノ マ ー シ グ ナ ル が 検 出 さ れ 、 そ れ ぞ れ を H1A お よ び H1B と し た 。 ま た 、1 3 C-NMR DEPT 135 ス ペ ク ト ル に お い て も 98.5 ppm と 102.4 ppm に 主 要 な 2 本 の ア ノ マ ー シ グ ナ ル が 検 出 さ れ 、 そ れ ぞ れ の シ グ ナ ル は 、 HSQC ス ペ ク ト ル に お い て H1A お よ び H1B と の 間 で 交 差 ピ ー ク が 観 察 さ れ た こ と か ら 、 そ れ ら の 水 素 と 直 接 結 合 す る C1A お よ び C1B と し て 帰 属 し た 。 H2A と C2A の 化 学 シ フ ト は 、 COSY-NMR ス ペ ク ト ル に お け る 5.09/4.01 ppm の 交 差 ピ ー ク と HSQC ス ペ ク ト ル に お け る 4.01/78.9 ppm の 交 差 ピ ー ク の 存 在 か ら 、そ れ ぞ れ 4.01 ppm、78.9 ppm と 同 定 し た 。 ま た 、H2B と C2B に つ い て は 、COSY-NMR ス ペ ク ト ル に お け る 5.01/4.05 ppm の 交 差 ピ ー ク と HSQC ス ペ ク ト ル に お け る 4.05/70.3 ppm の 交 差 ピ ー ク の 存 在 か ら 、そ れ ぞ れ 4.05 ppm、 70.3 ppm と 帰 属 し た 。 さ ら に 、 ア ノ マ ー と の グ リ コ シ ル 結 合 を 介 し た ロ ン グ レ ン ジ 結 合 を 検 出 で き る HMBC ス ペ ク ト ル に お い て 、C2A（ 78.9 ppm）は H1B（ 5.01 ppm） と の 間 に 交 差 ピ ー ク が み ら れ た こ と か ら 、 こ れ ら の 間 に は α-グ リ コ シ ル 結 合 が 存 在 し 、本 Man 残 基 の 2 位 は α-(1-2)-結 合 し て い る と 推 察 さ れ た 。1 3 C-NMR DEPT 135 ス ペ ク ト ル か ら は 、 2 つ の メ チ レ ン シ グ ナ ル が 観 察 さ れ 、 高 磁 場 側 の 61.4 ppm の シ グ ナ ル は 遊 離 の 6 位 と 帰 属 さ れ た 。一 方 、低 磁 場 シ フ ト し た 65.9 ppm の メ チ レ ン シ グ ナ ル は 、 HMBC ス ペ ク ト ル に お い て H1A（ 5.09 ppm） と の 間 に 交 差 ピ ー ク が み ら れ た こ と か ら 、主 鎖 の α-(1-6)-結 合 の 存 在 が 示 さ れ た 。以 上 の こ と か ら 、K. marxianus YIT 8292 の α-マ ン ナ ン は Table 14 に 示 す 部 分 構 造 を 有 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。

K. marxianus YIT 8292 の α-マ ン ナ ン を 構 成 す る Man の 結 合 位 置 を メ チ ル 化 分 析 で 調

べ た 結 果 、 主 要 生 成 物 は 2,3,4,6-tetra-O-methyl mannitol と 3,4-di-O-methyl mannitol で あ り 、そ れ ら が 全 体 の 約 70%（ mol/mol）を 占 め た (Table 15)。し た が っ て 、主 鎖 の α-(1-6)-結 合 と そ こ に α-(1-2)-結 合 で Man が 結 合 し た 短 い 側 鎖 が 主 体 の 構 造 と 考 え ら れ た 。

K. marxianus YIT 8292 の α-マ ン ナ ン の α-(1-6)-結 合 を ア セ ト リ シ ス に よ っ て 切 断 し 、

側 鎖 の 鎖 長 を 解 析 し た 結 果 、2 糖 、3 糖 、4 糖 お よ び 5 糖 は そ れ ぞ れ 全 体 の 76.5、11.8、 8.8 お よ び 2.9%（ mol/mol）で あ っ た (Fig.7)。パ ン 酵 母 の S. cerevisiae YIT 10265 と 比 較 す る と 、3 糖 以 上 の 占 め る 割 合 が 著 し く 低 か っ た 。ま た 、2 糖 と 3 糖 を 分 画 し て 、NMR 分 析 を 行 っ た 結 果 、2 糖 の 1

44

標 準 品 の デ ー タ と 完 全 に 一 致 し た 。3 糖 に つ い て は 、HSQC、HMBC お よ び COSY-NMR ス ペ ク ト ル か ら 、Man-α-(1,2)-Man-α-(1,2)-Man と 同 定 さ れ た (Fig. 8、Table 14)。そ れ ぞ れ の 1 H お よ び 1 3C の 化 学 シ フ ト は 、既 報 (59,60)と も 一 致 し た 。こ の 3 糖 の 構 造 は 、メ チ ル 化 分 析 に お い て 3,4,6-tri-O-methyl mannitol が 検 出 さ れ た こ と と 合 致 し た 。 ま た 、 K. marxianus YIT 8292 の α-マ ン ナ ン の HSQC ス ペ ク ト ル に お い て 、 5.26/100.8 ppm に 弱 い 交 差 ピ ー ク が 検 出 さ れ た が 、こ れ は C. kefir IFO 0586 に つ い て の 既 報 NMR デ ー タ (58,59)に お い て 、側 鎖 内 部 の Mal 残 基 に 帰 属 さ れ た 化 学 シ フ ト に 対 応 す る も の と 考 え ら れ た 。 以 上 の 結 果 か ら 、K. marxianus YIT 8292 の α-マ ン ナ ン は 、α-(1,6)-結 合 の 主 鎖 と 大 部 分 が α-(1,2)-結 合 の 短 い 側 鎖 か ら 成 る 、 く し 状 の 構 造 で あ る こ と が 明 ら か に な っ た 。 S. cerevisiae X2180-1A と そ の 変 異 株 の コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 活 性 お よ び 細 胞 表 層 疎 水 性 度 の 比 較

S. cerevisiae X2180-1A、そ の 変 異 株 で あ る mnn4、mnn1mnn4 お よ び mnn5、K. marxianus YIT 8292 の 粗 細 胞 壁 画 分 を 高 コ レ ス テ ロ ー ル 負 荷 ラ ッ ト に 3.5%混 餌 投 与 し て コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 活 性 を 比 較 検 証 し た 。 S. cerevisiae X2180-1A と 各 種 変 異 株 の N-結 合 α-マ ン ナ ン の 側 鎖 構 造 を Fig.1A に 示 し た 。各 細 胞 壁 画 分 の 食 物 繊 維 含 量 等 に は 差 が ほ と ん ど み ら れ ず (Table 12)、加 水 分 解 物 の Glc と Man の 構 成 比 も す べ て で ほ ぼ 1:1(mol 比 ) で あ っ た 。 摂 餌 量 と 体 重 増 加 量 に は 群 間 で 差 が 認 め ら れ な か っ た (Table 16)。ま た 、血 漿 ト リ グ リ セ リ ド 、リ ン 脂 質 、HDL-コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 に も 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た (Table 16)。 肝 乾 燥 重 量 は S. cerevisiae の mnn4、 mnn1mnn4 お よ び mnn5 変 異 株 の 粗 細 胞 壁 の 投 与 で 低 下 し た が 、 野 生 株 の 粗 細 胞 壁 を 与 え た 場 合 に は 変 化 が み ら れ な か っ た 。 血 漿 総 コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 は 、の 粗 細 胞 壁 の 投 与 で Control 群 に 比 べ て 有 意 に 低 下 し た が 、 野 生 株 の 粗 細 胞 壁 を 与 え た 群 で は 有 意 な 変 化 が み ら れ な か っ た (Fig.9)。 ま た 、 血 漿 総 コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 は 、 側 鎖 長 が 短 く な る に つ れ て 顕 著 に 低 下 す る 傾 向 が み ら れ た 。 最 も 側 鎖 長 の 短 い mnn5 変 異 株 の コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 活 性 は 野 生 株 よ り も 有 意 に 高 く 、 K. marxianus YIT 8292 と ほ ぼ 同 等 で あ っ た 。 S. cerevisiae X2180-1A の 野 生 株 と mnn4、 mnn1mnn4 お よ び mnn5 変 異 株 の 粗 細 胞 壁

45

考 察

K. marxianus YIT 8292 か ら 単 離 し た α-マ ン ナ ン の 構 造 を 解 析 し た 結 果 、 糖 質 の 約

98%が Man か ら 成 る こ と 、そ の リ ン 酸 基 の 含 有 量 は S. cerevisiae X2180-1A や パ ン 酵 母 と 比 較 す る と 1/4 以 下 で あ り 、明 ら か に 低 い こ と が 分 か っ た 。1

H-NMR、1 3C-NMR DEPT 135、HSQC、HMBC お よ び COSY-NMR ス ペ ク ト ル か ら は 、K. marxianus YIT 8292 の α-マ ン ナ ン に α-(1-6)-結 合 と α-(1-2)-結 合 の 存 在 が 示 さ れ た 。ま た 、メ チ ル 化 分 析 に お い て 、 主 要 産 物 と し て 2,3,4,6-tetra-O-methyl mannitol と 3,4-di-O-methyl mannitol が 生 成 し 、そ れ ら が 全 体 の 約 70%（ mol/mol）を 占 め た 。よ っ て 、K. marxianus YIT 8292 の α-マ ン ナ ン はα-(1-6)-結 合 の 主 鎖 と そ こ に α-(1-2)-結 合 で Man が 結 合 し た 短 い 側 鎖 が 主 体 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 さ ら に 、 主 鎖 の α-(1-6)-結 合 を ア セ ト リ シ ス に よ っ て 切 断 し た と こ ろ 、K. marxianus YIT 8292 の α-マ ン ナ ン か ら 生 成 し た 2 糖 は 76.5%を 占 め 、3 糖 と 4 糖 は そ れ ぞ れ 11.8%お よ び 10%未 満 で あ っ た 。 パ ン 酵 母 と 比 較 す る と 2 糖 の 側 鎖 が 占 め る 割 合 が 著 し く 高 か っ た 。各 種 NMR 分 析 の 結 果 か ら 、K. marxianus YIT 8292 の α-マ ン ナ ン か ら ア セ ト リ シ ス で 生 成 し た 2 糖 は Man-α-(1,2)-Man、 ま た 、 3 糖 は Man-α-(1,2)-Man-α-(1,2)-Man と 同 定 さ れ た 。 以 上 の 結 果 か ら 、 K. marxianus YIT 8292 の α-マ ン ナ ン は 、 リ ン 酸 基 含 量 が 少 な く 、 α-(1,6)-結 合 の 主 鎖 と 大 部 分 が α-(1,2)-結 合 の 短 い 側 鎖 か ら 成 る 、 く し 状 の 構 造 で あ る こ と が 分 か っ た 。

K. marxianus YIT 8292 の α-マ ン ナ ン の 構 造 的 特 徴 は 、 K. marxianus の 不 完 全 世 代 で

あ る C. kefir IFO 0586 や S. cerevisiae mnn5 変 異 株 で 報 告 さ れ て い る 構 造 (58-60)と 極 め て 類 似 す る 。 デ ー タ は 省 略 す る が 、 実 際 に S. cerevisiae mnn5 変 異 株 の α-マ ン ナ ン の HSQC お よ び HMBC ス ペ ク ト ル を 測 定 し た と こ ろ 、交 差 ピ ー ク は K. marxianus YIT 8292 の そ れ ら と 一 致 し た 。一 方 、同 じ Kluyveromyces 属 の K. lactis の 側 鎖 構 造 は 、S. cerevisiae と 類 似 す る が 、 リ ン 酸 基 を 介 し た 分 岐 構 造 を 欠 き 、 一 部 の mannnotetrarose の 末 端 に N-ア セ チ ル グ ル コ サ ミ ン が 付 加 さ れ て い る 点 が 異 な る と 報 告 さ れ て い る (55)。 Ballou ら は K. marxianus が K. lactis と 同 様 の 側 鎖 構 造 を 持 つ と 報 告 し て い る が (56)、 K.

47

Table 11. Composition of the Experimental Diets (g/kg)

Ingredient

S. cerevisiae

KM Control Wild type mnn4 mnn1mnn4 mnn5

Casein 223 206 205 206 205 208 Sucrose 578 577 577 577 577 576 Mineral mixturea 40 40 40 40 40 40 Vitamin mixturea 10 10 10 10 10 10 Soy oil 10 10 10 10 10 10 Lard 100 99 99 99 99 99 Choline bitartate 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 Cholesterol 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 Sodium cholate 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 Cellulose 30 15 16 15 16 14

Crude cell wall 0 35 35 35 35 35

Wild type, S. cerevisiae X2180 -1A; KM, K. marxianus YIT 8292

a

48

Table 12. Composition of Crude Cell Wall Fractions Isolated from S. cerevisiae X2180-1A,

Its mnn Mutants, and K. marxianus YIT 8292

S. cerevisiae Wild type mnn4 mnn1 mnn4 mnn5 KM Dietary fiber (%) 44.1 41.4 43.7 41.1 46.6 Crude protein (%) 49.5 52.0 49.7 52.5 44.2 Crude fat (%) 2.82 2.89 2.90 2.82 4.04 Ash (%) 1.69 1.73 1.74 1.69 3.09 Other components a (%) 1.88 1.93 1.94 1.88 2.13 Each result is expressed as the mean value of two replicates.

a

49

Table 13. Composition of K. marxianus YIT 8292 Mannan

K. marxianus YIT 8292

mannan Chemical composition

Total carbohydrate (g/g) 0.73 ± 0.02 Total phosphate ( μmol/g) 50 ± 2 Sugar composition

Mannose (%) 98 ± 1

Glucose (%) 1 ± 0

Glucosamine (%) 0.5 ± 0.0

50

Table 14. 1H and1 3H-NMR Chemical Shifts of Intact Mannan Isolated from K. marxianus YIT 8292 and Its Acetolysis Products

Oligosaccharide Sugar residue Proton Chemical shift (ppm) Carbone Chemical shift (ppm) C B A C B A C B A

51

Table 15. Methylation Analysis of K. marxianus YIT 8292 Mannan

Partially methylated mannitol acetates Linkage Molar ratio

52

Table 16. Effects of Crude Cell Wall Fractions Isolated from S. cerevisiae X2180-1A, Its mnn Mutants, and K. marxianus YIT 8292 on

Body Weight Gain, Food Intake, Plasma Lipids, and Liver Lipids in Rats Fed on a High -Cholesterol Diet

S. cerevisiae

Control Wild type mnn4 mnn1mnn4 mnn5 KM Body weight gain (g/14 days) 94.5 ± 9.2 a 90.1 ± 8.2 a 86.2 ± 9.4 a 91.5 ± 7.2 a 85.0 ± 6.6 a 87.0 ± 6.6 a Food intake (g/14 days) 254 ± 22 a 252 ± 15 a 236 ± 20 a 247 ± 12 a 233 ± 10 a 238 ± 15 a Plasma lipids (mg/d L)

HDL-cholesterol 11.4 ± 1.3 a 16.7 ± 2.3 a 17.6 ± 2.1 a 18.3 ± 2.3 a 17.4 ± 2 a 16.7 ± 1.9 a Triglycerides 136 ± 44 a 191 ± 75 a 228 ± 81 a 150 ± 89 a 153 ± 51 a 162 ± 83 a Phospholipids 156 ± 24 a 159 ± 17 a 164 ± 24 a 137 ± 31 a 148 ± 16 a 145 ± 28 a Liver weight (dry g) 5.9 ± 0.4 a 5.6 ± 0.3 a b 5.3 ± 0.6b c 5.4± 0.3 b c 5.1 ± 0.3 b c 5.0 ± 0.4 c Liver lipids (mg/g)

Triglycerides 160 ± 17 a 169 ± 17 a 163 ± 17 a 158 ± 20 a 153 ± 15 a 150 ± 13 a Phospholipids 126 ± 4 a 124 ± 14 a 118 ± 13 a 123 ± 13 a 117 ± 4.5 a 114 ± 11 a

The rats were given a high -cholesterol diet with or without 3.5% crude cell wall fraction isolated from S. cerevisiae , mnn1, mnn1 mnn4,

mnn5, or K. marxianus YIT 8292 for 14 d ays. Each value is the mean ± SD (n = 8). Mean values within a row not sharing a common letter

53

Fig. 6. 1H-NMR (A), 1 3C-NMR DEPT 135 (B), HSQC (C), HMBC (D), and COSY (E) spectra of intact K. marxianus YIT 8292 mannan.

54

Fig. 7. HPLC chromatogram of pyridylamino derivatives of acetolysis products of K.

marxianus YIT 8292 mannan (A) and baker 's yeast (S. cerevisiae YIT 10265) mannan (B).

Retention time (min)

55

Fig. 8. 1H-NMR (A), 1 3C-NMR (B), HMQC (C), HMBC (D), and COSY (E) spectra of triose obtained from acetolysis product of K. marxianus YIT 8292 mannan.

56

Fig.9. Effects of crude cell wall fractions isolated from S. cerevisiae X2180 -1A, its mannan

mutants, and K. marxianus YIT 8292 on total cholesterol levels in plasma (B) and liver (C). Each value is the mean ± SD (n = 8). Values not sharing a common letter are significantly different (p < 0.05, Tukey test).

Wild type, S. cerevisiae X2180 -1; KM, K. marxianus YIT 8292.

mnn5 6 1

M

2 1

M

2 1

M

6 1

M

2 1

M

6 1

M

2 1

M

2 1

M

6 1

M

2 1

M

2 1

M

6 1

M

2 1

M

2 1

M

6 1

M

2 1

M

2 1

M

3 1

M

6 1

M

2 1

M

2 1

M

3 1

M

6 1

M

2 1

M

2 1

M

6 1

M

2 1

M

6 1

M

2 1

M

2 1

M

mnn 4 mnn1, mnn4 6 1

M

2 1

M

6 1

M

2 1

M

6 1

M

2 1

M

6 1

M

2 1

M

6 1

M

2 1

M

mnn 5

A

Wild type (S. cerevisiae X2180-1 A)

57

Fig. 10. Cell surface hydrophobicity of S. cerevisiae X2180 -1A and its mannan mutants.

Each value is the mean ± SD (n = 3). Values not sharing a common letter are significantly different (p < 0.05, Tukey test).

60 被 験 者 は (株 )ヤ ク ル ト 本 社 中 央 研 究 所 の 従 業 員 を 対 象 に 募 集 し 、 試 験 1 と 2 で は 、 血 清 総 コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 が 200 mg/dL 以 上 で 、 か つ 血 清 コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 を 低 下 さ せ る 薬 剤 を 服 用 し て い な い 臨 床 的 に 健 康 な 日 常 生 活 を 営 む 成 人 、そ れ ぞ れ 31 名 お よ び 20 名 を 登 録 し た 。 試 験 3 で は 血 清 総 コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 が 150～ 310 mg/dL の 範 囲 の 健 常 域 者 ま た は 軽 度 高 コ レ ス テ ロ ー ル 血 症 者 で 、 血 清 コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 を 低 下 さ せ る 薬 剤 を 服 用 し て い な い 臨 床 的 に 健 康 な 日 常 生 活 を 営 む 成 人 、 48 名 を 登 録 し た 。 試 験 デ ザ イ ン 試 験 1 と 試 験 2 の 被 験 者 は と も に 無 作 為 に 2 群 に 分 け 、 試 験 1 で は KM-CW の 摂 取 量 が 8.0 g/日 お よ び 4.0 g/日 の グ ル ー プ に 、 試 験 2 で は KM-CW の 摂 取 量 が 2.0 g/日 お よ び 1.0 g/日 の グ ル ー プ に 割 付 け た 。試 験 1 の 8.0 g/日 お よ び 4.0 g/日 の グ ル ー プ に は 、 1 日 3 回 毎 食 後 に T1 を そ れ ぞ れ 10 錠 ま た は 5 錠 ず つ 4 週 間 摂 取 し て も ら っ た 。ま た 、 試 験 2 の 2.0 g/日 お よ び 1.0 g/日 の グ ル ー プ に は 、1 日 3 回 毎 食 後 に T2a ま た は T2b を 3 錠 ず つ 4 週 間 摂 取 し て も ら っ た 。 試 験 試 料 の 摂 取 開 始 前 と 摂 取 期 終 了 後 に 空 腹 時 採 血 を 行 い 、 脂 質 濃 度 を 分 析 し た 。 試 験 3 の 被 験 者 は 、 無 作 為 に 3 群 に 割 付 け 、 KM-CW の 含 有 量 の 異 な る ヨ ー グ ル ト の い ず れ か 、 ま た は プ ラ セ ボ ヨ ー グ ル ト を 1 日 1 カ ッ プ （ 90 g） ず つ 、 8 週 間 摂 取 し て も ら っ た 。 試 験 試 料 の 摂 取 中 止 後 の 経 過 を 観 察 す る た め に 、 摂 取 期 終 了 後 に 4 週 間 の 後 観 察 期 を 設 け た 。 試 験 試 料 の 摂 取 開 始 前 （ 0 週 ）、 摂 取 期 4 週 目 （ 4 週 ） お よ び 8 週 目（ 8 週 ）、な ら び に 、後 観 察 期 4 週 目（ 12 週 ）に 空 腹 時 採 血 を 行 い 、脂 質 と ア ポ リ ポ タ ン パ ク 質 濃 度 の 測 定（ 全 ポ イ ン ト ）、お よ び 、生 化 学・ 血 液 学 的 検 査（ 0 週 と 8 週 の み ） を 実 施 し た 。 血 液 分 析 採 血 は 早 朝 に 10 時 間 以 上 の 絶 食 下 で 行 い 、血 清 を 遠 心 分 離 に よ っ て 分 離 し た 。血 清 中 の 脂 質 濃 度 （ 総 コ レ ス テ ロ ー ル 、 LDL-コ レ ス テ ロ ー ル 、 HDL-コ レ ス テ ロ ー ル 、 ト リ グ リ セ リ ド ）、 ア ポ リ ポ タ ン パ ク 質 A1 （ apolipoprotein-A1, Apo-A1 ） お よ び B （ apolipoprotein-B, Apo-B）、 生 化 学 ・ 血 液 学 的 検 査 （ 総 タ ン パ ク 、 ア ル ブ ミ ン 、 尿 素 窒 素 、 ク レ ア チ ニ ン 、 グ ル タ ミ ン 酸 オ キ サ ロ 酢 酸 ト ラ ン ス ア ミ ナ ー ゼ （glutamic-oxaloacetic transaminase, GOT）、グ ル タ ミ ン 酸 ピ ル ビ ン 酸 ト ラ ン ス ア ミ ナ ー ゼ （ glutamate pyruvate transaminase, GPT ）、 γ- グ ル タ ミ ル ト ラ ン ス ペ プ チ ダ ー ゼ （γ-glutamyltranspeptidase, γ-GTP）、 血 糖 、 白 血 球 数 、 赤 血 球 数 、 ヘ モ グ ロ ビ ン 、 ヘ マ ト ク リ ッ ト 、血 小 板 数 ）は 、(株 )日 本 ノ ー バ メ デ ィ カ ル 研 究 所（ 試 験 1 お よ び 試 験 2）、 ま た は 、(株 ) 昭 和メ デ ィカ ル サイ エン ス （ 試験 3） に 委 託し て 分析 し た 。

67

Table 18. Baseline Characteristics of Subjects

Study 1 Study 2 Study 3

68

Table 19. Effects of KM-CW Administration on Serum Lipids in Mildly Hypercholesterolemic Subjects (Pilot Studies)

Study 1 Study 2

8.0 g/d 4.0 g/d 2.0 g/d 1.0 g/d

Before After Before After Before After Before After

N = 15 N = 16 N = 9 N = 11

69

Table 20. Effects of Yogurt Supplemented with KM-CW on Serum Lipids in All Subjects,

Including Normal and Hypercholesterolemic Adults (Study 3)

Placebo 3.0g/d KM-CW 4.0g/d KM-CW (N = 15) (N = 14) (N = 16) Total cholesterol (mg/dL) Week 0 220 ± 34 222 ± 33 214 ± 35 Week 4 219 ± 31 217 ± 28 200 ± 29* Week 8 233 ± 36 216 ± 19 207 ± 29# Week 12 (post-feeding) 225 ± 37 221 ± 25 223 ± 33 LDL-cholesterol (mg/dL) Week 0 134 ± 30 139 ± 37 134 ± 30 Week 4 129 ± 29 131 ± 29 117 ± 24** Week 8 135 ± 26 127 ± 25* 117 ± 20** Week 12 (post-feeding) 136 ± 33 128 ± 28 131 ± 26 HDL-cholesterol (mg/dL) Week 0 59 ± 17 61 ± 21 60 ± 17 Week 4 56 ± 14 62 ± 16 57 ± 17 Week 8 59 ± 14 63 ± 17 60 ± 16 Week 12 (post-feeding) 60 ± 15 65 ± 18 63 ± 16 Triglyceride (mg/dL) Week 0 149 ± 131 143 ± 163 117 ± 54 Week 4 152 ± 83 94 ± 31# 122 ± 52 Week 8 188 ± 159 123 ± 67 120 ± 81 Week 12 (post-feeding) 130 ± 69 117 ± 51 128 ± 59 Apo-B (mg/dL) Week 0 121 ± 20 121 ± 25 120 ± 24 Week 4 100 ± 20** 97 ± 22** 89 ± 16** Week 8 109 ± 20** 98 ± 17** 95 ± 17** Week 12 (post-feeding) 120 ± 23 109 ± 19* 117 ± 24 Apo-AI (mg/dL) Week 0 148 ± 22 152 ± 34 150 ± 32 Week 4 139 ± 21* 146 ± 22 142 ± 31 Week 8 150 ± 20 154 ± 24 148 ± 25 Week 12 (post-feeding) 156 ± 23* 164 ± 33 165 ± 27

70

Table 21. Effects of Yogurt Supplemented with KM -CW on Serum Lipids in Normal Subjects

with Total Cholesterol under 220 mg/dL (Study 3)

Placebo 3.0g/d KM-CW 4.0g/d KM-CW (N = 9) (N = 6) (N = 8) Total cholesterol (mg/dL) Week 0 200 ± 13 193 ± 16 185 ± 23 Week 4 203 ± 15 199 ± 11 182 ± 24 Week 8 214 ± 24 202 ± 12 189 ± 14# Week 12 (post-feeding) 204 ± 26 204 ± 19 207 ± 18 LDL-cholesterol (mg/dL) Week 0 118 ± 21 113 ± 23 115 ± 25 Week 4 114 ± 20 113 ± 15 107 ± 25 Week 8 121 ± 19 117 ± 18 109 ± 18 Week 12 (post-feeding) 119 ± 23 108 ± 13 122 ± 17 HDL-cholesterol (mg/dL) Week 0 55 ± 12 55 ± 18 56 ± 18 Week 4 54 ± 13 67 ± 14* 54 ± 19 Week 8 57 ± 12 66 ± 12* 60 ± 15 Week 12 (post-feeding) 56 ± 12 67 ± 15* 63 ± 18 Triglyceride (mg/dL) Week 0 156 ± 153 211 ± 240 104 ± 56 Week 4 155 ± 91 85 ± 43 117 ± 48 Week 8 191 ± 162 119 ± 94 96 ± 46 Week 12 (post-feeding) 123 ± 55 138 ± 70 114 ± 60 Apo-B (mg/dL) Week 0 111 ± 14 102 ± 10 106 ± 17 Week 4 92 ± 13** 86 ± 16* 82 ± 14** Week 8 101 ± 15** 90 ± 11 88 ± 10** Week 12 (post-feeding) 110 ± 16 98 ± 18 108 ± 16 Apo-AI (mg/dL) Week 0 144 ± 15 147 ± 35 140 ± 36 Week 4 138 ± 16 159 ± 16 136 ± 31 Week 8 149 ± 18 164 ± 16 146 ± 22 Week 12 (post-feeding) 150 ± 22 174 ± 27* 162 ± 30*

71

Table 22. Effects of Yogurt Supplemented with KM-CW on Serum Lipids in Hypercholesterolemic

Subjects with Total Cholesterol above 220 mg/dL (Study 3)

Placebo 3.0g/d KM-CW 4.0g/d KM-CW (N = 6) (N = 8) (N = 8) Total cholesterol (mg/dL) Week 0 251 ± 33 243 ± 23 243 ± 16 Week 4 243 ± 35 230 ± 30 217 ± 23** Week 8 262 ± 32 227 ± 18*# 224 ± 30*# Week 12 (post-feeding) 256 ± 29 233 ± 23 239 ± 37 LDL-cholesterol (mg/dL) Week 0 159 ± 24 159 ± 33 154 ± 19 Week 4 152 ± 25 145 ± 30* 127 ± 19** Week 8 155 ± 23 135 ± 28** 125 ± 20** Week 12 (post-feeding) 161 ± 31 144 ± 26* 140 ± 32 HDL-cholesterol (mg/dL) Week 0 64 ± 22 66 ± 24 64 ± 16 Week 4 59 ± 16 58 ± 17 60 ± 15 Week 8 62 ± 18 60 ± 20* 60 ± 17 Week 12 (post-feeding) 65 ± 17 63 ± 21 64 ± 14 Triglyceride (mg/dL) Week 0 137 ± 103 92 ± 34 131 ± 52 Week 4 147 ± 79 100 ± 21 128 ± 57 Week 8 183 ± 169 125 ± 45* 144 ± 103 Week 12 (post-feeding) 140 ± 91 101 ± 25 142 ± 59 Apo-B (mg/dL) Week 0 136 ± 20 134 ± 24 134 ± 21 Week 4 112 ± 24** 106 ± 22** 96 ± 16** Week 8 122 ± 22* 104 ± 18** 102 ± 21** Week 12 (post-feeding) 135 ± 26 117 ± 15* 125 ± 28 Apo-AI (mg/dL) Week 0 156 ± 29 155 ± 36 159 ± 26 Week 4 142 ± 28* 137 ± 22 148 ± 32 Week 8 152 ± 24 147 ± 27 150 ± 29 Week 12 (post-feeding) 166 ± 24 157 ± 37 167 ± 26

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Table 23. Changes in Blood Cells and Biological Examination Results during the Study Period in All Subjects (Study 3)

Placebo 3.0 g/d KM-CW 4.0g/d KM-CW

Week 0 Week 8 Week 0 Week 8 Week 0 Week 8

N = 15 N = 14 N = 16 Total protein (g/d L) 7.3 ± 0.4 7.4 ± 0.4 7.2 ± 0.4 7.3 ± 0.4 7.3 ± 0.3 7.3 ± 0.3 Albumin (g/dL) 4.6 ± 0.2 4.6 ± 0.2 4.5 ± 0.2 4.6 ± 0.2 4.5 ± 0.2 4.5 ± 0.3 GOT (IU/L) 22.3 ± 4.6 22.5 ± 6.4 26.5 ± 6.4 23.6 ± 9.6 26.3 ± 10 20.4 ± 4.8* GPT (IU/L) 23.7 ± 11.3 24.8 ± 12.9 33.1 ± 19.1 26.7 ± 14.1* 32.3 ± 20 23.4 ± 12.2** -GTP (IU/L) 30.7 ± 18.7 34.1 ± 20.5 40.2 ± 21.5 40.3 ± 19 52.6 ± 42 40.2 ± 34.5** Urea nitrogen (mg/dL) 15.4 ± 2.9 16.0 ± 3.6 16.1 ± 4.2 14.4 ± 4.8* 15.2 ± 3.1 14.8 ± 3.4 Creatinine (mg/dL) 0.76 ± 0.17 0.77 ± 0.15 0.77 ± 0.2 0.81 ± 0.19 0.73 ± 0.15 0.74 ± 0.15 Blood glucose (mg/dL) 91.8 ± 11.1 89.3 ± 9.5 92.4 ± 8.6 93.1 ± 11.6 97.9 ± 14.2 93.4 ± 15.9 White blood cell (102/mL) 59.5 ± 15.2 61.5 ± 16.9 51.0 ± 14.4 60.3 ± 16.7* 50.8 ± 12.2 52.6 ± 12.5 Red blood cell (104/mL) 491 ± 38 492 ± 40 475 ± 57 476 ± 56 466 ± 40 466 ± 42 Hb (g/dL) 15.2 ± 1.3 15.3 ± 1.5 14.7 ± 1.5 14.8 ± 1.4 14.9 ± 1.4 14.9 ± 1.4 Hematocrit (%) 48.7 ± 3.5 48.7 ± 3.9 47.3 ± 4.5 47.4 ± 4.5 47.2 ± 4.3 47.4 ± 4 .0 MCV (fl) 99.3 ± 3.9 99.1 ± 3.7 100.1 ± 6.2 100 ± 6.4 101.3 ± 3.0 101.7 ± 2.6 MCH (pg) 31.0 ± 1.3 31.0 ± 1.3 31.1 ± 2.3 31.2 ± 2.3 31.9 ± 1 .0 31.9 ± 1 .0 MCHC (%) 31.2 ± 0.9 31.3 ± 0.8 31.1 ± 0.8 31.2 ± 0.7 31.5 ± 0.7 31.4 ± 0.9 Platelet (104/mL) 23.2 ± 4.6 22.5 ± 3.4 24.4 ± 4.6 25 ± 6.7 24.5 ± 5.4 25.3 ± 5.2 Each value is the mean ± SD. Significantly different from week 0 in each group, * p < 0.05, **p < 0.01.