酵母細胞壁の表層多糖構造とコレステロール低下活性との相関

緒 言

酵 母 細 胞 壁 は 、β-(1,3)-グ ル カ ン 、β-(1,6)-グ ル カ ン お よ び 少 量 の キ チ ン か ら 成 る 内 層 と そ の 表 面 を 覆 うα-マ ン ナ ン を 豊 富 に 含 む マ ン ノ プ ロ テ イ ン か ら 成 る 外 層 に 大 別 さ れ る(32)。 細 胞 壁 に 占 め る β-グ ル カ ン と α-マ ン ナ ン の 割 合 と そ れ ら 多 糖 の 構 造 は 、 菌 株 に よ っ て 異 な る と 言 わ れ て い る が(55-59)、中 で も α-マ ン ナ ン の N 結 合 型 糖 鎖 の 側 鎖 構 造 に は 顕 著 な 違 い が あ り 、 酵 母 の 血 清 学 的 分 類 に 利 用 さ れ て い る 。

こ れ ま で に S. cerevisiae、Saccharomyces italicus、Candida albicans、Candida kefyr お よ び Kluyveromyces lactis 等 で α-マ ン ナ ン の 構 造 が 決 定 さ れ て い る(40,56)。N-結 合 型 糖 鎖 の 主 鎖 は 、マ ン ノ ー ス（Mannose, Man）が α-(1,6)-結 合 で 直 鎖 状 に 伸 長 し た 構 造 で あ り 、 菌 種 ・ 菌 株 間 で 共 通 す る 構 造 と 考 え ら れ て い る 。 主 鎖 か ら は α-(1,2)-結 合 で Man が 分 岐 し 、さ ら に 属 あ る い は 種 特 異 的 な 結 合 様 式 で 伸 長 し て 側 鎖 を 形 成 す る 。K. lactis は S. cerevisiae と 類 似 し た 側 鎖 構 造 を 有 す る が 、 リ ン 酸 基 を 介 し た 分 岐 構 造 を 欠 き 、 ま た 一 部 の 側 鎖 末 端 が N-ア セ チ ル グ ル コ サ ミ ン に 置 換 さ れ て い る 点 が 異 な る(56,57)。 Ballouは Kluyveromyces 属 の K. marxianusや K. dobzhanskiiも K. lactisと 同 様 の 側 鎖 構 造 を 有 す る と 報 告 し て い る(56)。一 方 、Kobayashiら は 、K. marxianus の 不 完 全 世 代 と 考 え ら れ て い る C. kefyr の IFO 0586株 に 関 し て 、α-マ ン ナ ン は α-(1,6)-結 合 の 主 鎖 と 短 い α-(1,2)-結 合 の 側 鎖 か ら 成 り 、S. cerevisiaeや K. lactis の 糖 鎖 構 造 と は 異 な り 、 リ ン 酸 基 と 側 鎖 末 端 の α-(1,3)-結 合 の Man残 基 を 欠 く と 報 告 し て い る(58,59)。

Ballou ら は α-マ ン ナ ン の 側 鎖 の 合 成 メ カ ニ ズ ム を 解 析 す る た め に 、S. cerevisiae X2180-1A か ら そ の 合 成 経 路 に 欠 損 を 持 つ 種 々 の 変 異 株 を 単 離 し 、 そ れ ぞ れ の α-マ ン ナ ン の 側 鎖 構 造 を 明 ら か に し て い る(40,56,60)。mnn4 変 異 株 は リ ン 酸 基 を 介 し た 分 岐 構 造 、mnn1 変 異 株 は 側 鎖 末 端 の α-(1,3)-結 合 の Man 残 基 を 欠 く 。 ま た 、mnn5 変 異 株 は 側 鎖 へ の 2 番 目 の α-(1,2)-結 合 に よ る Man の 伸 長 が 欠 損 し て お り 、C. kefyr IFO 0586 の 側 鎖 と 同 様 な 構 造 を 有 す る 。こ れ ら の 変 異 株 は α-マ ン ナ ン の 構 造 活 性 相 関 の 解 析 に 利 用 可 能 で あ る 。

本 章 で は 、高 い コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 活 性 を 有 す る K. marxianus YIT 8292 の α-マ ン ナ ン の 側 鎖 構 造 を 解 析 し 、 そ の 構 造 的 特 徴 と コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 活 性 と の 関 係 を S.

cerevisiae X2180-1Aの 変 異 株 を 用 い て 検 証 し た 。

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材 料 お よ び 方 法

微 生 物 お よ び 培 養 条 件

S. cerevisiae X2180-1A（MATα SUC2 mal mel gal2 CUP1）、 お よ び そ の 変 異 株 で あ る mnn4（LB6-5D MATα mnn4-1 SUC2 mal CUP1）、mnn1 mnn4（LB 97 -3C MATα mnn1 mnn4）、

mnn5（LB65-5D MATα mnn5） は 、American Type Culture Collection か ら 入 手 し た 。 他 の 菌 株 は 、(株)ヤ ク ル ト 本 社 中 央 研 究 所 で 系 統 保 管 さ れ て い る 菌 株 ス ト ッ ク を 培 養 し て 菌 体 を 調 製 し た 。培 地 組 成 は 30 g/L Glc、10 g/L polypeptone、5 g/L yeast extract、2 g/L KH2PO4、5 g/L K2HPO4お よ び 0.5 g/L MgSO4·7H2O と し 、10Lジ ャ ー フ ァ メ ン タ ー を 用 い て 、 培 養 温 度 30°C、 通 気 速 度 0.5 vvm、 攪 拌 速 度 800 rpm、 培 養 時 間 は 24時 間 と し た 。 培 養 期 間 中 、5N NaOH 溶 液 を 用 い て pHは 6.0 に 下 限 制 御 し た 。 酵 母 は 培 養 液 か ら 3,000×gで 10 分 間 遠 心 分 離 し て 回 収 し た 。

酵 母 粗 細 胞 壁 画 分 お よ び α-マ ン ナ ン の 調 製

酵 母 の 生 菌 体 を 蒸 留 水 に 懸 濁 し 、115°Cで 10分 間 加 熱 し た 後 、3,000×gで 10分 間 遠 心 し て 沈 殿 を 分 離 し た 。 沈 殿 は 蒸 留 水 で 7 回 洗 浄 し 、 粗 細 胞 壁 画 分 と し た 。

Ballau ら の 方 法(40)に 従 っ て 、α-マ ン ナ ン は 粗 細 胞 壁 画 分 を 0.1M ク エ ン 酸 緩 衝 液

（pH7.0） 中 で 120°C、90 分 間 加 熱 抽 出 し た 後 、 さ ら に エ タ ノ ー ル 沈 殿 、 お よ び 、 hexadecyltrimethylammonium bromide（Cetavlon） と ホ ウ 酸 に よ る 選 択 的 沈 殿 を 行 う こ と に よ っ て 精 製 し た 。

粗 細 胞 壁 画 分 の 栄 養 成 分 の 分 析

粗 タ ン パ ク 、 粗 脂 質 お よ び 総 食 物 繊 維 含 量 は AOAC 法(21)に よ っ て 測 定 し た 。 水 溶 性 食 物 繊 維 と 不 溶 性 食 物 繊 維 は Prosky法(41)に よ っ て 測 定 し た 。

細 胞 表 層 の 疎 水 性 度(cell curface hydrophobisity, CSH)の 分 析

粗 細 胞 壁 の CSHは 既 報(61)に 従 い 、疎 水 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ っ て 決 定 し た 。粗 細 胞 壁 を 100 mM 酢 酸 緩 衝 液 （pH 4.2） で 2 回 洗 浄 し た 後 、 最 終 濃 度 が 15 mg/mLと な る よ う に 同 緩 衝 液 に 再 懸 濁 し た 。GE Healthcare 社 製 の 疎 水 カ ラ ム（Phenyl Sepharose 6 Fast Flow）を 0.6 cm×3.7 cm の カ ラ ム（Bio-Rad 社 製 ）に 1.0 mL 充 填 し 、100 mM 酢 酸 緩 衝 液（125 mM NaClを 含 む, pH 5.0） で 平 衡 化 し た 。 細 胞 壁 の 懸 濁 液 50 μL を カ ラ ム に チ ャ ー ジ し て 、3mLの 100 mM 酢 酸 緩 衝 液 （125 mM NaClを 含 む, pH 5.0)で 溶 出 し た 。 溶 出 液 の OD6 6 0（Ae l u en t）、 お よ び 、 細 胞 壁 懸 濁 液 を 溶 出 用 緩 衝 液 3mLで 希 釈 し た 溶 液 の OD6 6 0（Aa p p l i e d） を 測 定 し 、 次 式 か ら 疎 水 性 度 を 求 め た 。

CSH(%) ＝ 100×(Aa p p l i e d － Ae l u en t) / Aa p p l i ed

41 動 物 お よ び 飼 料

動 物 試 験 の プ ロ ト コ ー ル は(株)ヤ ク ル ト 本 社 中 央 研 究 所 の 動 物 実 験 委 員 会 に よ る 承 認 を 受 け た 。5 週 齢 の Wistar 系 雄 性 ラ ッ ト を 日 本 ク レ ア(株)か ら 購 入 し 、 全 期 間 を 通 じ て 温 度24 ± 1ºC、湿 度60 ± 5%、明 暗12時 間 周 期 の 環 境 で 個 別 ケ ー ジ に て 飼 育 し た 。 市 販 の 固 形 飼 料 （ オ リ エ ン タ ル 酵 母(株)製 MF 飼 料 ） を 自 由 摂 取 さ せ て 1 週 間 馴 化 飼 育 し た 後 、 ラ ン ダ ム に 1群 8匹 ず つ に 群 分 け し た 。

試 験 飼 料 の 組 成 をTable 11に 示 し た 。す べ て の 試 験 飼 料 に は 、コ レ ス テ ロ ー ル を0.5%、

コ ー ル 酸 ナ ト リ ウ ム 塩 を 0.25%添 加 し た 。各 種 酵 母 の 粗 細 胞 壁 画 分 は 試 験 飼 料 に 3.5%

添 加 し た 。 こ の 際 、 各 飼 料 の 食 物 繊 維 、 タ ン パ ク 、 脂 質 の 組 成 を 揃 え る た め に 、 粗 細 胞 壁 に 由 来 す る に 食 物 繊 維 、タ ン パ ク 質 お よ び 脂 質(Table 12)は 、そ れ ぞ れ 高 コ レ ス テ ロ ー ル 食 の セ ル ロ ー ス 、 カ ゼ イ ン お よ び ラ ー ド と 代 替 し た 。

試 験 デ ザ イ ン

馴 化 飼 育 後 の ラ ッ ト を 群 分 け し た 後 、高 コ レ ス テ ロ ー ル 食（Control 食 ）あ る い は 粗 細 胞 壁 画 分 を 3.5%添 加 し た 高 コ レ ス テ ロ ー ル 食 を 14 日 間 自 由 摂 取 さ せ た 。 摂 餌 量 は 3 日 毎 に 体 重 は 1 週 間 毎 に 記 録 し た 。 試 験 最 終 日 に ペ ン ト バ ル ビ タ ー ル ナ ト リ ウ ム 溶 液 の 復 腔 内 投 与 に よ っ て ラ ッ ト を 麻 酔 し た 後 、 腹 部 大 動 脈 か ら 採 血 し 、 血 液 を ヘ パ リ ン と 混 合 し て 遠 心 分 離 に よ っ て 血 漿 を 分 離 し た 。 ま た 、 生 理 食 塩 水 で 肝 灌 流 し た 後 、 肝 臓 を 採 取 し 、 重 量 を 測 定 し た 。 肝 脂 質 は Folchら の 方 法(22)で 抽 出 し た 。

生 物 学 的 解 析

血 漿 総 コ レ ス テ ロ ー ル お よ び HDL-コ レ ス テ ロ ー ル は 、 協 和 メ デ ッ ク ス(株) 製 の 測 定 キ ッ ト （ デ タ ミ ナ ーTC555 お よ び デ タ ミ ナ ーHDL） を 用 い て 、 ト リ グ リ セ リ ド お よ び リ ン 脂 質 は 、 和 光 純 薬 工 業(株)製 の キ ッ ト （ ト リ グ リ セ リ ド E テ ス ト ワ コ ー お よ び リ ン 脂 質 B テ ス ト ワ コ ー ）を 用 い て 酵 素 的 手 法 で 測 定 し た 。肝 脂 質 は 、エ タ ノ ー ル に 再 溶 解 し 、 上 述 の 酵 素 的 手 法 で 総 コ レ ス テ ロ ー ル 、 ト リ グ リ セ リ ド お よ び リ ン 脂 質 を 測 定 し た 。

α-マ ン ナ ン の 構 造 方 法

総 糖 質 の 定 量 は フ ェ ノ ー ル 硫 酸 法(62)で 行 っ た 。マ ン ナ ン の 糖 組 成 は 、4Mト リ フ ル オ ロ 酢 酸 （TFA） 溶 液 中 で 80°C、1 時 間 加 水 分 解 を 行 っ た 後 、 ま た 、 粗 細 胞 壁 画 分 の 糖 組 成 は 、メ タ ノ リ シ ス（5% 塩 酸 メ タ ノ ー ル 中 で 100°C、2 時 間 ）と 4M TFA 加 水 分 解 を 行 っ た 後 、1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone で 標 識 し て HPLC法 で 分 析 し た(64)。総 リ ン 酸 含 量 は Ames ら の 方 法(64)に よ っ て 測 定 し た 。

既 報(65)に 従 い 、 約 50 mg の α-マ ン ナ ン を 酢 酸: 無 水 酢 酸: 硫 酸 （10:10:1） 混 合 液 に 溶 解 し 、 ア セ ト リ シ ス に よ っ て 主 鎖 の α-(1,6)-結 合 を 選 択 的 に 切 断 し た 。O-ア セ チ

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ル 化 さ れ た マ ン ノ オ リ ゴ 糖 を ク ロ ロ ホ ル ム で 抽 出 し た 後 、0.2% ナ ト リ ウ ム メ ト キ シ ド/メ タ ノ ー ル 溶 液 を 加 え て 室 温 で 一 晩 放 置 し 、脱 ア セ チ ル 化 し た 。マ ン ノ オ リ ゴ 糖 の 1/10 量 は ピ リ ジ ル ア ミ ノ 化 し 、 サ イ ズ 排 除 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー カ ラ ム （ 東 ソ ー(株)製 TSKgel α-2500）を 用 い て HPLC法 で 分 析 し た(66)。残 り は 、Bio-Gel P2（Bio-Rad 社 製 ） を 充 填 し た カ ラ ム を 用 い て 糖 鎖 長 ご と に 分 離 し 、2 糖 お よ び 3糖 画 分 を 回 収 し た 。

α-マ ン ナ ン お よ び マ ン ノ オ リ ゴ 糖 は 数 回 重 水 で 置 換 し た 後 、 重 水 に 溶 解 し 、 フ ー リ エ 変 換 核 磁 気 共 鳴 装 置 ECA-500 （ 日 本 電 子(株) 製 ） を 用 い て 、30°C で ア セ ト ン を 内 部 標 準 と し 、¹H-NMR お よ び ^{1 3}C-NMR（DEPT 135） ス ペ ク ト ル を 測 定 し た 。 ま た 、 2D-NMR （HSQC, HMQC, HMBC, COSY） ス ペ ク ト ル は 、60°Cに て ア セ ト ン を 内 部 標 準 と し て 測 定 し た 。

結 合 部 位 を 調 べ る た め に 、Ciucanuら の 方 法(67)に よ っ て α-マ ン ナ ン を メ チ ル 化 し た 。 メ チ ル 化 産 物 は 4M TFA溶 液 中 で 121°C、1分 間 加 熱 し て 加 水 分 解 し 、次 い で 水 酸 化 ホ ウ 酸 ナ ト リ ウ ム で 還 元 し た 後 、 無 水 酢 酸 と ピ リ ジ ン で ア セ チ ル 化 し た 。 メ チ ル 化 糖 の ア ル ジ ト ー ル ア セ テ ー ト は 、GC-MSで 同 定 し た 。測 定 は Hewlett-Packard 社 製 の 6890A ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ と 日 本 電 子(株)製 JMS-700V 質 量 分 析 計 を 組 み 合 わ せ て 行 っ た 。 ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー は 、30 m SE52 キ ャ ピ ラ リ － カ ラ ム （ 内 径 0.25 mm） を 用 い 、 カ ラ ム 温 度 は 200°C 、キ ャ リ ア ー ガ ス は Heと し 、流 速 0.7 mL/minと し た 。マ ス ス ペ ク ト ル の 検 出 条 件 は 、接 続 管 温 度 270°C、ガ ラ ス 管 温 度 270°C、イ オ ン 源 温 度 250°C、

イ オ ン 化 法 EI＋ 、 イ オ ン 化 電 圧 70 eV と し た 。

統 計 解 析

結 果 は 平 均 値 ±標 準 偏 差 で 表 し た 。 デ ー タ は ANOVA で 解 析 し 、 有 意 差 が 認 め ら れ た 場 合 は 、Tukey の 多 重 比 較 を 行 っ た 。 有 意 水 準 は 5％ と し た 。 統 計 ソ フ ト は 、SAS system for windows（release 6.12） を 用 い た 。

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結 果

K. marxianus YIT 8292 の α-マ ン ナ ン の 構 造 解 析

Table 13 に 示 し た よ う に 、K. marxianus YIT 8292 か ら 単 離 し た α-マ ン ナ ン は 、 大 部 分 が 炭 水 化 物 で あ り 、 そ の 98%を Manが 占 め た 。 ま た 、 リ ン 酸 含 量 は 50 μmol/g で あ っ た 。S. cerevisiae X2180 -1Aや パ ン 酵 母 で あ る S. cerevisiae YIT 10025か ら 単 離 し た α-マ ン ナ ン の リ ン 酸 含 量 を 調 べ た と こ ろ 、 そ れ ぞ れ 230 μmol/g、200 μmol/gで あ っ た 。

K. marxianus YIT 8292 の α-マ ン ナ ン の ¹H-NMR、^{1 3}C-NMR DEPT 135、HSQC、HMBC お よ び COSY-NMRス ペ ク ト ル を Fig. 6 に 示 し た 。¹H-NMR ス ペ ク ト ル で は 5.09 ppm、

5.01 ppmに 2本 の 強 い ア ノ マ ー シ グ ナ ル が 検 出 さ れ 、 そ れ ぞ れ を H1A お よ び H1Bと し た 。 ま た 、^{1 3}C-NMR DEPT 135ス ペ ク ト ル に お い て も 98.5 ppm と 102.4 ppmに 主 要 な 2 本 の ア ノ マ ー シ グ ナ ル が 検 出 さ れ 、 そ れ ぞ れ の シ グ ナ ル は 、HSQC ス ペ ク ト ル に お い て H1A お よ び H1B と の 間 で 交 差 ピ ー ク が 観 察 さ れ た こ と か ら 、 そ れ ら の 水 素 と 直 接 結 合 す る C1A お よ び C1B と し て 帰 属 し た 。H2A と C2A の 化 学 シ フ ト は 、 COSY-NMR ス ペ ク ト ル に お け る 5.09/4.01 ppmの 交 差 ピ ー ク と HSQCス ペ ク ト ル に お け る4.01/78.9 ppmの 交 差 ピ ー ク の 存 在 か ら 、そ れ ぞ れ4.01 ppm、78.9 ppmと 同 定 し た 。 ま た 、H2Bと C2Bに つ い て は 、COSY-NMR ス ペ ク ト ル に お け る 5.01/4.05 ppm の 交 差 ピ ー ク と HSQCス ペ ク ト ル に お け る 4.05/70.3 ppm の 交 差 ピ ー ク の 存 在 か ら 、そ れ ぞ れ 4.05 ppm、70.3 ppmと 帰 属 し た 。 さ ら に 、 ア ノ マ ー と の グ リ コ シ ル 結 合 を 介 し た ロ ン グ レ ン ジ 結 合 を 検 出 で き る HMBC ス ペ ク ト ル に お い て 、C2A（78.9 ppm）は H1B（5.01 ppm） と の 間 に 交 差 ピ ー ク が み ら れ た こ と か ら 、 こ れ ら の 間 に は α-グ リ コ シ ル 結 合 が 存 在 し 、本 Man 残 基 の 2位 は α-(1-2)-結 合 し て い る と 推 察 さ れ た 。^{1 3}C-NMR DEPT 135 ス ペ ク ト ル か ら は 、2 つ の メ チ レ ン シ グ ナ ル が 観 察 さ れ 、 高 磁 場 側 の 61.4 ppmの シ グ ナ ル は 遊 離 の 6 位 と 帰 属 さ れ た 。一 方 、低 磁 場 シ フ ト し た 65.9 ppmの メ チ レ ン シ グ ナ ル は 、HMBC ス ペ ク ト ル に お い て H1A（5.09 ppm） と の 間 に 交 差 ピ ー ク が み ら れ た こ と か ら 、主 鎖 の α-(1-6)-結 合 の 存 在 が 示 さ れ た 。以 上 の こ と か ら 、K. marxianus YIT 8292 の α-マ ン ナ ン は Table 14に 示 す 部 分 構 造 を 有 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。

K. marxianus YIT 8292の α-マ ン ナ ン を 構 成 す る Manの 結 合 位 置 を メ チ ル 化 分 析 で 調 べ た 結 果 、 主 要 生 成 物 は 2,3,4,6 -tetra-O-methyl mannitolと 3,4-di-O-methyl mannitolで あ り 、そ れ ら が 全 体 の 約 70%（mol/mol）を 占 め た(Table 15)。し た が っ て 、主 鎖 の α-(1-6)-結 合 と そ こ に α-(1-2)-結 合 で Man が 結 合 し た 短 い 側 鎖 が 主 体 の 構 造 と 考 え ら れ た 。

K. marxianus YIT 8292の α-マ ン ナ ン の α-(1-6)-結 合 を ア セ ト リ シ ス に よ っ て 切 断 し 、 側 鎖 の 鎖 長 を 解 析 し た 結 果 、2糖 、3 糖 、4 糖 お よ び5 糖 は そ れ ぞ れ 全 体 の 76.5、11.8、

8.8 お よ び 2.9%（mol/mol）で あ っ た(Fig.7)。パ ン 酵 母 の S. cerevisiae YIT 10265と 比 較 す る と 、3糖 以 上 の 占 め る 割 合 が 著 し く 低 か っ た 。ま た 、2 糖 と 3糖 を 分 画 し て 、NMR 分 析 を 行 っ た 結 果 、2 糖 の ¹H-NMR お よ び ^{1 3}C-NMR の デ ー タ は 、Man-α-(1,2)-Man の

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標 準 品 の デ ー タ と 完 全 に 一 致 し た 。3糖 に つ い て は 、HSQC、HMBCお よ び COSY-NMR ス ペ ク ト ル か ら 、Man-α-(1,2)-Man-α-(1,2)-Man と 同 定 さ れ た(Fig. 8、Table 14)。そ れ ぞ れ の ¹H お よ び ^{1 3}Cの 化 学 シ フ ト は 、既 報(59,60)と も 一 致 し た 。こ の 3糖 の 構 造 は 、メ チ ル 化 分 析 に お い て 3,4,6-tri-O-methyl mannitol が 検 出 さ れ た こ と と 合 致 し た 。 ま た 、 K. marxianus YIT 8292 の α-マ ン ナ ン の HSQCス ペ ク ト ル に お い て 、5.26/100.8 ppm に 弱 い 交 差 ピ ー ク が 検 出 さ れ た が 、こ れ は C. kefir IFO 0586に つ い て の 既 報 NMRデ ー タ (58,59)に お い て 、側 鎖 内 部 の Mal 残 基 に 帰 属 さ れ た 化 学 シ フ ト に 対 応 す る も の と 考 え ら れ た 。

以 上 の 結 果 か ら 、K. marxianus YIT 8292 の α-マ ン ナ ン は 、α-(1,6)-結 合 の 主 鎖 と 大 部 分 が α-(1,2)-結 合 の 短 い 側 鎖 か ら 成 る 、 く し 状 の 構 造 で あ る こ と が 明 ら か に な っ た 。

S. cerevisiae X2180-1Aと そ の 変 異 株 の コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 活 性 お よ び 細 胞 表 層 疎 水 性 度 の 比 較

S. cerevisiae X2180-1A、そ の 変 異 株 で あ るmnn4、mnn1mnn4 お よ びmnn5、K. marxianus YIT 8292 の 粗 細 胞 壁 画 分 を 高 コ レ ス テ ロ ー ル 負 荷 ラ ッ ト に 3.5%混 餌 投 与 し て コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 活 性 を 比 較 検 証 し た 。S. cerevisiae X2180-1A と 各 種 変 異 株 の N-結 合 α-マ ン ナ ン の 側 鎖 構 造 を Fig.1A に 示 し た 。各 細 胞 壁 画 分 の 食 物 繊 維 含 量 等 に は 差 が ほ と ん ど み ら れ ず(Table 12)、加 水 分 解 物 の Glcと Man の 構 成 比 も す べ て で ほ ぼ 1:1(mol比) で あ っ た 。

摂 餌 量 と 体 重 増 加 量 に は 群 間 で 差 が 認 め ら れ な か っ た(Table 16)。ま た 、血 漿 ト リ グ リ セ リ ド 、リ ン 脂 質 、HDL-コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 に も 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た(Table 16)。 肝 乾 燥 重 量 は S. cerevisiae の mnn4、mnn1mnn4 お よ び mnn5 変 異 株 の 粗 細 胞 壁 の 投 与 で 低 下 し た が 、 野 生 株 の 粗 細 胞 壁 を 与 え た 場 合 に は 変 化 が み ら れ な か っ た 。 血 漿 総 コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 は 、の 粗 細 胞 壁 の 投 与 で Control群 に 比 べ て 有 意 に 低 下 し た が 、 野 生 株 の 粗 細 胞 壁 を 与 え た 群 で は 有 意 な 変 化 が み ら れ な か っ た(Fig.9)。 ま た 、 血 漿 総 コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 は 、 側 鎖 長 が 短 く な る に つ れ て 顕 著 に 低 下 す る 傾 向 が み ら れ た 。 最 も 側 鎖 長 の 短 いmnn5変 異 株 の コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 活 性 は 野 生 株 よ り も 有 意 に 高 く 、 K. marxianus YIT 8292 と ほ ぼ 同 等 で あ っ た 。

S. cerevisiae X2180-1Aの 野 生 株 と mnn4、mnn1mnn4 お よ び mnn5 変 異 株 の 粗 細 胞 壁 に つ い て 、細 胞 表 層 の 疎 水 性 度（cell surface hydrophobicity, CSH）を 比 較 し た(Fig.10)。 そ の 結 果 、CSH は 野 生 株 に 比 べ て 、mnn4、mnn1mnn4 お よ び mnn5 変 異 株 の 方 が 有 意 に 高 か っ た 。 ま た 、mnn5変 異 株 の CSHは mnn4 に 比 べ て も 高 値 傾 向 （p = 0.051）、 野 生 株 と mnn1mnn4 に 比 べ る と 有 意 に 高 値 で あ っ た 。

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考 察

K. marxianus YIT 8292 か ら 単 離 し た α-マ ン ナ ン の 構 造 を 解 析 し た 結 果 、 糖 質 の 約 98%が Manか ら 成 る こ と 、そ の リ ン 酸 基 の 含 有 量 は S. cerevisiae X2180-1Aや パ ン 酵 母 と 比 較 す る と 1/4 以 下 で あ り 、明 ら か に 低 い こ と が 分 か っ た 。¹H-NMR、^{1 3}C-NMR DEPT 135、HSQC、HMBCお よ び COSY-NMRス ペ ク ト ル か ら は 、K. marxianus YIT 8292の α-マ ン ナ ン に α-(1-6)-結 合 と α-(1-2)-結 合 の 存 在 が 示 さ れ た 。ま た 、メ チ ル 化 分 析 に お い て 、 主 要 産 物 と し て 2,3,4,6-tetra-O-methyl mannitolと 3,4-di-O-methyl mannitolが 生 成 し 、そ れ ら が 全 体 の 約 70%（mol/mol）を 占 め た 。よ っ て 、K. marxianus YIT 8292の α-マ ン ナ ン はα-(1-6)-結 合 の 主 鎖 と そ こ にα-(1-2)-結 合 でManが 結 合 し た 短 い 側 鎖 が 主 体 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 さ ら に 、 主 鎖 の α-(1-6)-結 合 を ア セ ト リ シ ス に よ っ て 切 断 し た と こ ろ 、K. marxianus YIT 8292の α-マ ン ナ ン か ら 生 成 し た 2糖 は 76.5%を 占 め 、3 糖 と 4 糖 は そ れ ぞ れ 11.8%お よ び 10%未 満 で あ っ た 。 パ ン 酵 母 と 比 較 す る と 2 糖 の 側 鎖 が 占 め る 割 合 が 著 し く 高 か っ た 。各 種 NMR分 析 の 結 果 か ら 、K. marxianus YIT 8292 の α-マ ン ナ ン か ら ア セ ト リ シ ス で 生 成 し た 2 糖 は Man-α-(1,2)-Man、 ま た 、3 糖 は Man-α-(1,2)-Man-α-(1,2)-Man と 同 定 さ れ た 。 以 上 の 結 果 か ら 、K. marxianus YIT 8292 の α-マ ン ナ ン は 、 リ ン 酸 基 含 量 が 少 な く 、α-(1,6)-結 合 の 主 鎖 と 大 部 分 が α-(1,2)-結 合 の 短 い 側 鎖 か ら 成 る 、 く し 状 の 構 造 で あ る こ と が 分 か っ た 。

K. marxianus YIT 8292 の α-マ ン ナ ン の 構 造 的 特 徴 は 、K. marxianusの 不 完 全 世 代 で あ る C. kefir IFO 0586 や S. cerevisiae mnn5変 異 株 で 報 告 さ れ て い る 構 造(58-60)と 極 め て 類 似 す る 。 デ ー タ は 省 略 す る が 、 実 際 に S. cerevisiae mnn5 変 異 株 の α-マ ン ナ ン の HSQCお よ びHMBCス ペ ク ト ル を 測 定 し た と こ ろ 、交 差 ピ ー ク はK. marxianus YIT 8292 の そ れ ら と 一 致 し た 。一 方 、同 じ Kluyveromyces属 の K. lactisの 側 鎖 構 造 は 、S. cerevisiae と 類 似 す る が 、 リ ン 酸 基 を 介 し た 分 岐 構 造 を 欠 き 、 一 部 の mannnotetrarose の 末 端 に N-ア セ チ ル グ ル コ サ ミ ン が 付 加 さ れ て い る 点 が 異 な る と 報 告 さ れ て い る(55)。Ballou ら は K. marxianus が K. lactis と 同 様 の 側 鎖 構 造 を 持 つ と 報 告 し て い る が(56)、K.

marxianus YIT 8292 の 側 鎖 構 造 は 、K. lactis の そ れ と は 明 ら か に 異 な っ た 。し た が っ て 、 K. marxianus の α-マ ン ナ ン の 側 鎖 構 造 は 、 菌 株 に よ っ て 異 な る 可 能 性 が 考 え ら れ た 。

第 1章 で は 、K. marxianus YIT 8292 は ビ ー ル 酵 母 や パ ン 酵 母 等 に 比 べ て 高 い コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 活 性 を 有 す る こ と を 、 ま た 、 第 2章 で は 、K. marxianus YIT 8292の 細 胞 壁 多 糖 が コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 活 性 の 主 た る 活 性 成 分 で あ る こ と を 示 し た 。 筆 者 ら は 、 K. marxianus YIT 8292の α-マ ン ナ ン の 側 鎖 構 造 の 特 徴 が 高 い コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 活 性 に 関 与 す る の で は な い か と 考 え 、本 仮 説 を S. cerevisiae X2180-1Aと そ の 変 異 株 を 用 い て 検 証 し た 。各 酵 母 の 粗 細 胞 壁 画 分 を 高 コ レ ス テ ロ ー ル 負 荷 ラ ッ ト に 3.5%混 餌 投 与 し て 血 漿 総 コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 に 及 ぼ す 影 響 を 調 べ た 結 果 、 野 生 株 は 総 コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 を 変 化 さ せ な か っ た が 、マ ン ナ ン 側 鎖 中 の リ ン 酸 基 を 欠 損 し た 、mnn4変 異 株 は 総