緒 言
第 1 章 で 述 べ た よ う に 、K. marxianus は ケ フ ィ ア グ レ イ ン に 見 出 さ れ る 代 表 菌 種 で あ り 、 古 く か ら 発 酵 乳 と し て の 食 経 験 が あ る 。 ま た 、K. marxianus は 菌 体 増 殖 収 率 が 高 く 、 か つ 、 ラ ク ト ー ス 発 酵 性 が 高 い た め 、 安 価 な 発 酵 基 材 で あ る チ ー ズ ホ エ イ で も 良 好 に 増 殖 可 能 で あ る(33)。 さ ら に 、K. marxianus は 米 国 食 品 医 薬 品 局 の “Generally Recognized As Safe（GRAS）”リ ス ト 、お よ び 、欧 州 食 品 安 全 機 関 の“Qualified presumption of safety（QPS）” リ ス ト に 収 載 さ れ て お り 、 安 全 な 微 生 物 と し て 受 容 さ れ て い る こ と か ら 、 食 品 素 材 と し て 高 い 適 性 を 有 す 。
食 物 繊 維 は 、 水 溶 性 と 不 溶 性 の 2種 に 大 別 さ れ る が 、 そ れ ぞ れ に 食 品 素 材 と し て の 利 用 性 や 加 工 性 、 生 理 機 能 等 が 異 な る 。 一 般 に 水 溶 性 食 物 繊 維 は コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 活 性 を 有 す る こ と が 様 々 な 研 究 に よ っ て 示 さ れ て い る が 、 不 溶 性 の 食 物 繊 維 に つ い て は 、 ヒ ト に お け る コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 活 性 に 関 す る 報 告 が 少 な い(27)。 一 方 、 著 者 ら は 、食 餌 性 高 コ レ ス テ ロ ー ル 血 症 モ デ ル を 用 い た 研 究 に お い て 、種 々 の 酵 母 の 中 で K.
marxianus YIT 8292が 特 に 高 い コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 活 性 を 有 す こ と 、 ま た 、 そ の 主 た る 活 性 成 分 は α-マ ン ナ ン と β-グ ル カ ン か ら 成 る 細 胞 壁 多 糖 で あ る こ と を 示 し た 。本 酵 母 の 細 胞 壁 多 糖 は 不 溶 性 食 物 繊 維 で あ る が 、 ペ ク チ ン や グ ア ー ガ ム 等 の 水 溶 性 食 物 繊 維 と 同 等 の 混 餌 投 与 量 で コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 活 性 を 発 揮 す る 。 し た が っ て 、K.
marxianus YIT 8292 の 細 胞 壁 多 糖 は 、 コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 活 性 を 訴 求 す る 新 規 の 機 能 性 食 品 素 材 と し て の 応 用 が 期 待 さ れ る 。
本 章 で は 、K. marxianus YIT 8292 の 細 胞 壁 多 糖 を 濃 縮 し た 粗 細 胞 壁 画 分 （KM-CW）
に つ い て 、 ヒ ト に お け る 有 効 性 を 3種 類 の 試 験 に よ っ て 検 討 し た 。 試 験 1と 2で は 、 血 清 総 コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 が 200 mg/dL以 上 の 方 を 対 象 に KM-CWを 圧 縮 錠 剤 の 形 態 で 1.0 g～8.0 g/日 の 用 量 で 4週 間 摂 取 さ せ て 、 血 中 脂 質 濃 度 へ の 影 響 を 調 べ た 。 そ れ ら の 結 果 に 基 づ い て 、 試 験 3で は KM-CWを 3.0 gあ る い は 4.0 g含 有 す る ヨ ー グ ル ト を 健 常 者 と 軽 度 高 コ レ ス テ ロ ー ル 血 症 者 に 8 週 間 摂 取 さ せ て 、 血 中 脂 質 濃 度 へ の 影 響 を 二 重 盲 検 プ ラ セ ボ 対 照 試 験 で 検 討 し た 。
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材 料 と 方 法
KM-CW の 調 製
K. marxianus YIT 8292 は 1t 培 養 タ ン ク（ 鈴 木 精 工(株)製 ）を 用 い て 、70 g/L Glc、30 g/L コ ー ン ス テ ィ ー プ リ カ ー 、2.0 g/L KH2PO4、3.0 g/L K2HPO4お よ び 0.5 g/L MgSO4 か ら 成 る 培 地 （ 実 働 容 積 ：750L） で 培 養 し た 。 シ ー ド の 植 菌 量 は 5%と し 、 培 養 温 度 は 28°C、 通 気 量 は 1.0 vvm、 攪 拌 速 度 は 330 rpmと し た 。 培 養 液 の pH は 5N NaOH の 自 動 添 加 に よ っ て 5.5に 下 限 制 御 し た 。培 養 開 始 23 時 間 後 に 、培 地 中 の グ ル コ ー ス が 枯 渇 し た こ と を 確 認 し て 培 養 を 終 了 し た 。
培 養 液 か ら 遠 心 分 離 に よ っ て 回 収 し た 菌 体 を 蒸 留 水 に 懸 濁 し 、121°C で 15 分 間 加 熱 し た 後 、 遠 心 分 離 に よ っ て 沈 殿 を 回 収 し た 。 沈 殿 は 蒸 留 水 で 複 数 回 洗 浄 し 、 粗 細 胞 壁 画 分 （KM-CW） と し た 。KM-CW は 凍 結 乾 燥 し て 粉 末 化 し た 。KM-CW の 栄 養 組 成 を Table 17に 示 し た 。
試 験 試 料 の 調 製
試 験 1で 使 用 し た 錠 剤（T1）の 組 成 は 、100 gあ た り KM-CW が 72.0 g、ま た 、微 結 晶 性 セ ル ロ ー ス 、粉 糖 、Ca3(PO4)2お よ び ス テ ア リ ン 酸 マ グ ネ シ ウ ム が そ れ ぞ れ 15.0 g、
10.0 g、2.5 g お よ び 0.5 g と し た 。エ キ セ ン ト リ ッ ク 型 打 錠 機 を 使 用 し 、直 接 粉 末 圧 縮 法 に よ っ て 1 錠 あ た り 370.4±4.3 mgの 錠 剤 を 作 製 し た 。
試 験 2で は 組 成 の 異 な る 2種 類 の 錠 剤 、T2aと T2b を 使 用 し た 。T2b の 組 成 は T1と 同 一 と し た 。T2b の 組 成 は 、100 gあ た り KM-CW が 36.0 g、 ま た 、 微 結 晶 性 セ ル ロ ー ス 、 粉 糖 、 カ ゼ イ ン 、Ca3(PO4)2お よ び ス テ ア リ ン 酸 マ グ ネ シ ウ ム が そ れ ぞ れ 31.3 g、
15.9 g、13.8 g、2.5 g お よ び 0.5 g と し た 。 同 打 錠 機 を 使 用 し て 直 接 粉 末 圧 縮 法 に よ っ て 1錠 あ た り 308.6±3.4 mgの 錠 剤 を 作 製 し た 。
試 験 3 で は 、3 種 類 の ヨ ー グ ル ト を 使 用 し た 。 ス キ ム ミ ル ク と 全 粒 粉 の 混 合 液 を 乳 酸 菌 ス タ ー タ ー （Lactobacillus casei と Streptococcus thermophilus） で 発 酵 さ せ た 後 、 甘 味 料 と 増 粘 剤 を 加 え て ヨ ー グ ル ト 調 合 液 を 作 製 し た 。 こ の 調 合 液 に KM-CW を 加 え て 、90 g あ た り KM-CW が 3.0 g ま た は 4.0 gと な る よ う に 調 整 し 、90 gず つ 容 器 に 充 填 し た 。プ ラ セ ボ ヨ ー グ ル ト に は KM-CW の 代 わ り に 水 を 添 加 し 、90 gず つ 充 填 し た 。 容 器 に 蓋 を シ ー ル し 、 使 用 時 ま で 4°Cで 保 存 し た 。
被 験 者
す べ て の 試 験 は 、 ヘ ル シ ン キ 宣 言 お よ び 関 連 指 針 等 を 遵 守 し て 実 施 さ れ た 。 被 験 者 に 関 わ る す べ て の 実 施 内 容 は 、(株)ヤ ク ル ト 本 社 中 央 研 究 所 の ヒ ト 試 験 倫 理 審 査 委 員 会 の 審 査 を 受 け 、 承 認 さ れ た 。 被 験 者 に は 、 登 録 前 に 試 験 の 目 的 と 内 容 、 安 全 性 等 を 十 分 に 説 明 し た 上 で 、 書 面 に よ る 同 意 を 得 た 。
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被 験 者 は(株)ヤ ク ル ト 本 社 中 央 研 究 所 の 従 業 員 を 対 象 に 募 集 し 、 試 験 1 と 2 で は 、 血 清 総 コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 が 200 mg/dL 以 上 で 、 か つ 血 清 コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 を 低 下 さ せ る 薬 剤 を 服 用 し て い な い 臨 床 的 に 健 康 な 日 常 生 活 を 営 む 成 人 、そ れ ぞ れ 31名 お よ び 20名 を 登 録 し た 。 試 験 3で は 血 清 総 コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 が 150～310 mg/dL の 範 囲 の 健 常 域 者 ま た は 軽 度 高 コ レ ス テ ロ ー ル 血 症 者 で 、 血 清 コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 を 低 下 さ せ る 薬 剤 を 服 用 し て い な い 臨 床 的 に 健 康 な 日 常 生 活 を 営 む 成 人 、48名 を 登 録 し た 。
試 験 デ ザ イ ン
試 験 1と 試 験 2の 被 験 者 は と も に 無 作 為 に 2群 に 分 け 、 試 験 1 で は KM-CW の 摂 取 量 が 8.0 g/日 お よ び 4.0 g/日 の グ ル ー プ に 、 試 験 2で は KM-CW の 摂 取 量 が 2.0 g/日 お よ び 1.0 g/日 の グ ル ー プ に 割 付 け た 。試 験 1の 8.0 g/日 お よ び 4.0 g/日 の グ ル ー プ に は 、 1日 3回 毎 食 後 にT1を そ れ ぞ れ 10錠 ま た は 5錠 ず つ4週 間 摂 取 し て も ら っ た 。ま た 、 試 験 2の 2.0 g/日 お よ び 1.0 g/日 の グ ル ー プ に は 、1 日 3 回 毎 食 後 にT2a ま た は T2b を 3 錠 ず つ 4 週 間 摂 取 し て も ら っ た 。 試 験 試 料 の 摂 取 開 始 前 と 摂 取 期 終 了 後 に 空 腹 時 採 血 を 行 い 、 脂 質 濃 度 を 分 析 し た 。
試 験 3 の 被 験 者 は 、 無 作 為 に 3 群 に 割 付 け 、KM-CW の 含 有 量 の 異 な る ヨ ー グ ル ト の い ず れ か 、 ま た は プ ラ セ ボ ヨ ー グ ル ト を 1 日 1 カ ッ プ （90 g） ず つ 、8 週 間 摂 取 し て も ら っ た 。 試 験 試 料 の 摂 取 中 止 後 の 経 過 を 観 察 す る た め に 、 摂 取 期 終 了 後 に 4 週 間 の 後 観 察 期 を 設 け た 。 試 験 試 料 の 摂 取 開 始 前 （0 週 ）、 摂 取 期 4 週 目 （4 週 ） お よ び 8 週 目（8週 ）、な ら び に 、後 観 察 期 4週 目（12 週 ）に 空 腹 時 採 血 を 行 い 、脂 質 と ア ポ リ ポ タ ン パ ク 質 濃 度 の 測 定（ 全 ポ イ ン ト ）、お よ び 、生 化 学・ 血 液 学 的 検 査（0週 と 8 週 の み ） を 実 施 し た 。
血 液 分 析
採 血 は 早 朝 に 10 時 間 以 上 の 絶 食 下 で 行 い 、血 清 を 遠 心 分 離 に よ っ て 分 離 し た 。血 清 中 の 脂 質 濃 度 （ 総 コ レ ス テ ロ ー ル 、LDL-コ レ ス テ ロ ー ル 、HDL-コ レ ス テ ロ ー ル 、 ト リ グ リ セ リ ド ）、 ア ポ リ ポ タ ン パ ク 質 A1（apolipoprotein-A1, Apo-A1） お よ び B
（apolipoprotein-B, Apo-B）、 生 化 学 ・ 血 液 学 的 検 査 （ 総 タ ン パ ク 、 ア ル ブ ミ ン 、 尿 素 窒 素 、 ク レ ア チ ニ ン 、 グ ル タ ミ ン 酸 オ キ サ ロ 酢 酸 ト ラ ン ス ア ミ ナ ー ゼ
（glutamic -oxaloacetic transaminase , GOT）、グ ル タ ミ ン 酸 ピ ル ビ ン 酸 ト ラ ン ス ア ミ ナ ー ゼ （glutamate pyruvate transaminase, GPT）、γ-グ ル タ ミ ル ト ラ ン ス ペ プ チ ダ ー ゼ
（γ-glutamyltranspeptidase, γ-GTP）、 血 糖 、 白 血 球 数 、 赤 血 球 数 、 ヘ モ グ ロ ビ ン 、 ヘ マ ト ク リ ッ ト 、血 小 板 数 ）は 、(株)日 本 ノ ー バ メ デ ィ カ ル 研 究 所（ 試 験 1お よ び 試 験 2）、
ま た は 、(株) 昭 和 メ デ ィ カ ル サ イ エ ン ス （ 試 験 3） に 委 託 し て 分 析 し た 。 統 計 検 定
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結 果 は 平 均 値 ±標 準 偏 差 で 表 し た 。 試 験 1 と 試 験 2 で は 、 対 応 の あ る t-検 定 に よ っ て 各 群 の 飲 用 前 後 の 比 較 を 行 っ た 。 試 験 3 の 血 清 脂 質 と ア ポ リ ポ タ ン パ ク 濃 度 の 経 時 変 化 は 、 制 限 付 き 最 尤 法 を 用 い て 、 ベ ー ス ラ イ ン （0 週 ） を 基 準 と し た Dunnett 多 重 検 定 に よ っ て 解 析 し た 。 生 化 学 ・ 血 液 学 検 査 デ ー タ に つ い て は 、 対 応 の あ る t-検 定 に よ っ て 各 群 の 飲 用 前 後 の 比 較 を 行 っ た 。 ま た 、 群 間 比 較 は Dunnett 多 重 比 較 検 定 で 行 な っ た 。 統 計 ソ フ ト は 、SAS system for windows（release 6.12） を 使 用 し 、 有 意 水 準 は 5％ と し た 。
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結 果
試 験 1お よ び 試 験 2: 錠 剤 形 態 で の KM-CWの 有 効 性 予 備 検 討
被 験 者 背 景 を Table 18 に 示 し た 。 試 験 1 お よ び 試 験2 と も に 脱 落 者 は 1例 も 発 生 せ ず 、 被 験 者 全 員 が す べ て の 検 査 を 完 遂 し た 。 ま た 、 試 験 期 間 中 、 試 験 試 料 の 摂 取 に 関 連 し た 有 害 事 象 ま た は 異 常 値 は 認 め ら れ な か っ た 。
試 験 1 お よ び 2 の 摂 取 開 始 前 と 摂 取 期 終 了 後 の 血 清 脂 質 濃 度 を Table 19 に 示 し た 。 KM-CW を 4.0 g/日 お よ び 8.0 g/日 で 4 週 間 摂 取 す る こ と に よ り 、 摂 取 前 と 比 較 し て 血 清 総 コ レ ス テ ロ ー ル と LDL-コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 が 有 意 に 低 下 し た 。血 清 総 コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 は 、2.0 g/日 の 摂 取 で も 摂 取 前 に 比 べ て 低 下 し た が 、1.0 g/日 の 摂 取 で は 有 意 な 差 が 認 め ら れ な か っ た 。 一 方 、LDL-コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 は 、2.0 g/日 お よ び 1.0 g/
日 の 摂 取 で は 有 意 に 変 化 し な か っ た 。HDL-コ レ ス テ ロ ー ル と ト リ グ リ セ リ ド 濃 度 は 、 す べ て の グ ル ー プ に お い て 摂 取 前 後 で 差 が 認 め ら れ な か っ た 。
試 験 3: ヨ ー グ ル ト 形 態 で の KM-CW の 有 効 性 の 検 討
試 験 3に 割 付 け た 48 名 の 被 験 者 の う ち 、摂 取 期 に プ ラ セ ボ 群 で 1名 、KM-CW 3.0 g/
日 群 で 2名 の 被 験 者 が 腹 部 症 状 に 違 和 感 を 覚 え た と の 理 由 で 途 中 棄 権 し た 。 す べ て の 検 査 を 完 遂 し た 45 名 を 有 効 性 解 析 対 象 者 と し て 抽 出 し 、有 効 性 の 検 討 を 行 っ た 。被 験 者 背 景 に は 群 間 で 有 意 な 隔 た り は み ら れ な か っ た(Table 18)。
す べ て の 有 効 性 解 析 対 象 者 を 対 象 と し た 場 合 、KM-CW 4.0 g/日 群 で は 、4週 の 血 清 総 コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 、お よ び 4 週 と 8週 の LDL-コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 が そ れ ぞ れ の 0 週 の 検 査 値 に 比 べ て 有 意 に 低 か っ た(Table 20)。KM-CW 3.0 g/日 群 で は 、8週 の LDL-コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 が 0週 に 比 べ て 有 意 に 低 か っ た 。 群 間 比 較 で は 、KM-CW 4.0 g/日 群 の 8週 の 総 コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 が プ ラ セ ボ 群 に 比 べ て 有 意 に 低 か っ た 。一 方 、HDL-コ レ ス テ ロ ー ル 、ト リ グ リ セ リ ド お よ び Apo-Bの 濃 度 は 、す べ て の 群 に お い て 摂 取 期 の 前 後 で 変 化 が な く 、群 間 差 も 検 出 さ れ な か っ た 。Apo-AIは プ ラ セ ボ 群 で の み 0週 に 比 べ て 摂 取 期 に 有 意 に 低 下 し た が 、 群 間 差 は 認 め ら れ な か っ た 。
0 週 の 血 清 総 コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 が 220 mg/dL 未 満 の 正 常 域 の 被 験 者 と 220 mg/dL 以 上 の 軽 度 高 コ レ ス テ ロ ー ル 血 症 者 に 分 け て 、 そ れ ぞ れ の 集 団 を 対 象 に 層 別 解 析 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 正 常 域 の 集 団 で は 、 い ず れ の 群 に お い て も 血 清 総 コ レ ス テ ロ ー ル と LDL-コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 は 有 意 な 変 化 し な か っ た(Table 21)。一 方 、軽 度 高 コ レ ス テ ロ ー ル 血 症 者 の 集 団 で は 、KM-CW 3.0 g/日 群 、4.0 g/日 群 と も に 、8 週 の 血 清 総 コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 は 0 週 に 比 べ て 有 意 に 低 く 、 ま た 、 プ ラ セ ボ 群 と 比 較 し て も 有 意 に 低 値 で あ っ た(Table 22)。LDL-コ レ ス テ ロ ー ル 濃 度 に は 群 間 差 が 認 め ら れ な か っ た が 、KM-CW 3.0 g/日 群 お よ び 4.0 g/日 群 の 4週 と 8 週 の 測 定 値 は そ れ ぞ れ の 0 週 の 測 定 値 に 比 べ て 有 意 に 低 か っ た 。Apo-B は 正 常 域 者 、 軽 度 高 コ レ ス テ ロ ー ル 血 症 者 と も に 、 す べ て の