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厚生労働科学研究費補助金 難治性疾患克服研究事業 難治性疾患等実用化研究事業 免疫アレルギー疾患等実用化研究事業 免疫アレルギー疾患実用化研究分野
総合研究報告書（Ｈ24〜26）
関節炎患者末梢単核球異常とその修復に関する研究
分担研究者 田村直人 順天堂大学医学部膠原病内科 准教授 研究協力者 多田久里守 順天堂大学医学部膠原病内科
杉崎良親 順天堂大学医学部膠原病内科 林 絵利 順天堂大学医学部膠原病内科
研究要旨 関節炎患者の末梢血単核球について、そのサブセット異常と修復の可能性について検討した。
平成 24 年度は、ラットのアジュバント関節炎（AIA）について検討した。AIA ラットでは関節炎の発症に伴 い所属リンパ節で T 細胞増加がみられたが、PI3K 阻害薬経口投与により抑制された。また、リンパ節 T 細 胞をin vitro にて刺激すると IFNγ、IL‑17 の発現が認められたが、これらも PI3K 阻害薬により濃度依存 性に抑制された。平成 25 年度は、関節リウマチ（RA）患者の末梢血単核球を刺激し、CD4 陽性 T 細胞にお ける IL‑17 および IFNγを解析したところ、発現は健常人より高く、PI3K 阻害薬添加により抑制された。
さらに、培養上清中の IL‑17、 IFNγ、IL‑17、IL‑6、TNFα産生も PI3K 阻害薬により抑制された。以上か ら、PI3K は RA の Th1, Th17 サイトカイン発現異常に関与しており、その阻害により関節炎は抑制されるこ とが示唆された。平成 26 年度は脊椎関節炎である強直性脊椎炎患者の末梢血単核球における免疫細胞の頻 度を本研究班にて標準化された細胞表面染色にて解析した。強直性脊椎炎患者では Th17 細胞および IL‑17 産生 CD8 陽性 T 細胞の増加が認められ、病態への関与が考えられた。
A. 研究目的
T 細胞サブセットなど免疫細胞の異常は、関節 リウマチ（rheumatoid arthritis: RA）をはじめ とするリウマチ性疾患の病態に深く関与している と考えられている。本研究では RA モデルとしてア ジュバント関節炎（adjuvant‑induced arthritis:
AIA ） ラ ッ ト に お け る T 細 胞 異 常 と phosphoinositide 3‑kinase（PI3K)阻害薬による その是正の可能性について検討した。次に、関節 リウマチ患者末梢血単核球を用いて、Th1、Th17 や他の炎症性サイトカイン産生と PI3K 阻害によ る抑制効果について検討した。また、平成 26 年度 には脊椎関節炎である強直性脊椎炎（ankylosing spondylitis:AS）患者末梢血単核球のサブセット 異常について検討を行った。
B. 研究方法
(平成 24、25 年度) AIA ラットにアイソフォー ム非特異的 PI3K 阻害薬を 10 日目より 1 日 1 回経 口投与し、後肢の体積測定により関節炎の重症度
を評価、また鼡径リンパ節におけるリンパ球数の 経時的変化を解析した。鼡径リンパ節由来 T 細胞 を PI3K 阻害薬存在下および非存在下でin vitro にてマイトジェン刺激し、細胞増殖能や IL‑17 産 生に対する影響を検討した。また、RA 患者末梢血 より単核球を分離、アイソフォーム選択的もしく は非選択的 PI3K 阻害薬の存在下にて、抗 CD3 抗体 および抗 CD28 抗体で刺激し、CD4 陽性 T 細胞にお ける細胞内サイトカインの発現をフローサイトメ トリーにて解析、24 時間後の培養上清中サイトカ イン濃度をビーズアッセイ法にて測定した。
（平成 26 年度）健常人 10 名および AS 患者 10 名 の末梢血単核球（PBMC）を分離し、本研究班で作 製された標準化プロトコールに準じて多重染色後、
フローサイトメトリーにて各免疫細胞の頻度を解 析 し た 。 ま た 、 PBMC を PMA 50 ng/ml お よ び ionomycin 500 ng/ml で 3 時間培養し、サイトカ イン産生細胞の頻度を細胞内染色にて解析した。
（倫理面への配慮）
患者検体を用いるにあたっては当施設の倫理委
28 員会の承認を受け、十分なインフォームドコンセ ントを行った。患者検体は本研究以外の目的では 用いていない。また、個人情報の管理に注意を払 い、個人の特定が行われないように配慮した。ま た、動物実験では本学に物実験計画を申請し、承 認を得たうえで研究を行った。
C. 研究結果
(平成 24、25 年度) AIA ラットでは、関節炎の 発症に伴って鼡径リンパ節における CD4 陽性 T 細 胞の一過性の増加が認められたが、PI3K 阻害薬投 与群では増加が抑制されていた(図 1)。さらに、
AIA ラット鼡径リンパ節由来リンパ球をin vitro で刺激したときの細胞増殖および IL‑17 産生は、
PI3K 阻害薬によって抑制された(図 2)。RA 患者で は、抗 CD3 抗体＋抗 CD28 抗体刺激後の IFNγおよ び IL‑17 陽性細胞数は、RA 患者で健常人より増加 していたが、PI3K 阻害薬により濃度依存的に抑制 された(図 3)。培養上清中の IFNγ、IL‑17、IL‑6、
TNFα濃度も RA 患者で健常人より上昇しており、
PI3K 阻害薬により抑制された（図 4）。AIA ラット、
RA 患者いずれにおいても、アイソフォーム選択的 阻害薬のなかでは PI3Kδ選択的阻害薬の抑制効 果が強かった。
(平成 26 年度) AS 患者は、年齢 30.5（中央値）±
8.7 歳、平均罹病期間 11.3±6.5 年、BASDAI(Bath anlylosing spondylitis disease activity score) は 3.54±2.54、CRP2.51±4.64mg/dl であった。AS 患者 PBMC では、健常人に比して Th17 細胞の頻度 が高い傾向にあった（図 5）が、疾患活動性との 明らかな相関はみられなかった。
図1.AIAラット鼡径リンパ節におけるCD4陽性T
細胞数の変化
図2．AIAラット鼡径リンパ節由来リンパ球のマ
イトジェン刺激による増殖とIL-17産生へ のPI3K阻害薬の影響
また、NK 細胞の頻度が AS では有意に低かったほ か 、 単 球 の 頻 度 が 増 加 し て お り 、 classical monocyte の 頻 度 が 増 加 し 、 non‑classical monocyte は減少していた。Th1、Th2 細胞、Treg 細胞、B 細胞サブセットに有意な差はみられなか った。また、CD8 陽性 T 細胞中の IL‑17 産生細胞 の頻度が AS で高い傾向にあった（図 6）。
図 3.RA 患者の IFNγおよび IL‑17 産生 CD4+T 細
胞の PI3K 阻害による変化
29 図 4.RA 患者 PBMC 培養上清中サイトカイン
濃度
図 5. AS 患者 PBMC における Th17 細胞の頻度
図 6. AS 患者 CD8 陽性 T 細胞における IL‑17 産生 細胞の頻度
D. 考察
(平成 24、25 年度) 関節炎ラットリンパ節や RA 患者 PBMC では、CD4陽性T細胞の増殖や、
Th1, Th17サイトカインの産生亢進がみられ、こ れらにはPI3Kを介した細胞内シグナル伝達が関 与しており、その阻害薬により抗リウマチ作用が 得られる可能性が示唆された。
(平成 26 年度) AS の病態には TNFαのほか、
IL‑17/IL‑23 が関与すると考えられている。これ までに AS 患者末梢血リンパ球における Th17 細胞、
あるいは IL‑17 産生細胞の増加が示されている が、逆に低下しているとの報告もある。日本人 AS 患者では健常人より Th17 細胞が増加していた が、活動性との関連性はみられなかった。AS は 発症早期は炎症が強く、その後は徐々に骨新生に よる変化が主体となることから、検体採取時期や 骨病変の進行度によっても免疫細胞の頻度やサ イトカイン産生量が異なる可能性があると考え られた。今後はより早期の症例で解析を進めると ともに、病期による違いについて検討を行ってい く必要がある。
E. 結論
関節炎モデルラットおよび RA 患者における Th1、
Th17 サブセット異常は PI3K 阻害薬により是正で きる可能性が示唆された。また、AS 患者でも末梢 血 Th17 細胞の増加がみられ、病態との関連につい てさらなる検討が必要と考えられた。
F. 健康危機情報 なし
G. 研究発表 1. 論文発表
1) Ogasawara M, Tamura N, Kageyama M, Onuma S, Kusaoi M, Toyama S, Sekiya F, Matsudaira R, Nawata M, Tada K, Matsushita M, Kempe K, Amano H, Morimoto S, Yamaji K, Takasaki Y.
Single‑center, retrospective analysis of efficacy and safety of tacrolimus as a second‑line DMARD in combination therapy and the risk factors contributing to adverse events in 115 patients with rheumatoid arthritis. Clin Rheumatol 31:251‑257, 2012.
2) Sakai R, Tanaka M, Nanki T, Watanabe K, Yamazaki H, Koike R, Nagasawa H, Amano K, Saito K, Tanaka Y, Ito S, Sumida T, Ihata A, Ishigatsubo Y, Atsumi T, Koike T, Nakajima A, Tamura N, Fujii T, Dobashi H, Tohma S, Sugihara T, Ueki Y, Hashiramoto A, Kawakami A, Hagino N, Miyasaka N, Harigai M. Drug retention rates and relevant risk factors for
30 drug discontinuation due to adverse events in rheumatoid arthritis patients receiving anticytokine therapy with different target molecules. Ann Rheum Dis 11:1820‑1826, 2012.
3) Sakai R, Komano Y, Tanaka M, Nanki T, Koike R, Nagasawa H, Amano K, Nakajima A, Atsumi T, Koike T, Ihata A, Ishigatubo Y, Saito K, Tanaka Y, Ito S, Sumida T, Tohma S, Tamura N, Fujii T, Sugihara T, Kawakami A, Hagino N, Ueki Y, Hashiramoto A, Nagasaka K, Miyasaka N, Harigai M. Time‑dependent increased risk for serious infection from continuous use of TNF antagonists during three years in rheumatoid arthritis patients. Arthritis Care Res (Hoboken) 8:1125‑1134, 2012.
4) Ogasawara M, Murayama G, Yamada Y, Nemoto T, Kageyama M, Toyama S, Kusaoi M, Onuma S, Kon T, Sekiya F, Sugimoto K, Matsudaira R, Matsushita M, Tada K, Kempe K, Yamaji K, Tamura N, Takasaki Y. Autofeedback from ultrasound images provides rapid improvement in palpation skills for identifying joint swelling in rheumatoid arthritis. J Rheumatol 6:1207‑1214, 2012.
5) Haruta K, Mori S, Tamura N, Sasaki A, Nagamine M, Yaguchi S, Kamachi F, Enami J, Kobayashi S, Yamori T, Takasaki Y. Inhibitory effects of ZSTK474, a phosphatidylinositol 3‑kinase inhibitor, on adjuvant‑induced arthritis in rats. Inflamm Res 61:551‑562, 2012.
6) 田村直人. リウマチ性疾患における PI3 キ ナーゼに関する最近の知見. 日本臨床免疫学会 会誌 35:8‑13, 2012.
7) 田村直人, 多田久里守. 脊椎関節炎の分子 病態. リウマチ科 47: 130‑135, 2012.
8) 田村直人. 関節リウマチ（RA）: 診断と治 療 の 進 歩 . 非 生 物 学 的 製 剤 . 日 内 科 会 誌 101:2873‑2879, 2012.
９) Murayama G, Ogasawara M, Nemoto T, Yamada Y, Ando S, Minowa K, Kon T, Tada K, Matsushita M, Yamaji K, Tamura N, Takasaki Y. Clinical miscount of involved joints denotes the need
for ultrasound complementation in usual practice for patients with rheumatoid arthritis. Clin Exp Rheumatol. 31:506‑14, 2013.
10) 田村直人.抗炎症療法における unmet needs.
PI3 キナーゼ阻害薬. 炎症と免疫. 21;234‑238, 2013.
11) Nemoto T, Ogasawara M, Matsuki Y, Murayama G, Yamada Y, Sugisaki N, Ando S, Minowa K, Kon T, Tada K, Matsushita M, Yamaji K, Tamura N, Takasaki Y. Can routine clinical measures predict ultrasound‑determined synovitis and remission in rheumatoid arthritis patients?. Clin Exp Rheumatol.
2014;32:54‑60.
12) Gorai M，Ogasawara M，Matsuki Y，Yamada Y，Murayama G，Sugisaki N，Nemoto T，Ando S，
Minowa K，Kon T，Tada K，Matsushita M，Yamaji K，Tamura N，Takasaki Y．Weighting with the Lansbury articular index improves the correlation of ultrasound score with serum matrix metalloproteinase‑3 level in
rheumatoid arthritis patients．Mod Rheumatol 2014;.24:915‑9.
13) Doe K，Nozawa K，Okada T，Tada K，Yamaji K，Tamura N，Takasaki Y． Usefulness of minor salivary gland biopsy in the diagnosis of IgG4‑related disease． Int J Clin Exp Pathol 2014;15:2673‑7．
14) Sakai R, Cho SK, Nanki T, Koike R, Watanabe K, Yamazaki H, Nagasawa H, Amano K, Tanaka Y, Sumida T, Ihata A, Yasuda S, Nakajima A, Sugihara T, Tamura N, Fujii T, Dobashi H, Miura Y, Miyasaka N, Harigai M;
REAL study group. The risk of serious infection in patients with rheumatoid arthritis treated with tumor necrosis factor inhibitors decreased over time: a report from the registry of Japanese rheumatoid
arthritis patients on biologics for
long‑term safety (REAL) database. Rheumatol Int. 2014;34:1729‑36.
15)Tokai N, Ogasawara M, Gorai M, Matsuki Y,
31 Yamada Y, Murayama G, Sugisaki N, Nemoto T, Ando S, Minowa K, Kon T, Tada K, Matsushita M, Yamaji K, Tamura N, Makino S, Takasaki Y.
Predictive value of bone destruction and duration of clinical remission for subclinical synovitis in rheumatoid arthritis patients. Mod Rheumatol. 2014;
15:1‑6.
16) 田村直人，多田久里守，小林茂人，井上 久，
髙崎芳成．強直性脊椎炎の病態：炎症と骨新生 について．日本脊椎関節炎学会誌．4:19‑24，2014．
2. 学会発表
1) Matsudaira R, Tamura N, Watanabe T, Matsushita M, Ogasawara M, Yamaji K, Takasaki Y. Factors associated with normalized physical function and clinical remission defined with simplified disease activity index by 1‑year infliximab treatment in patients with rheumatoid arthritis. The European League Against Rheumatism Annual Congress 2012, Berlin, Germany, Jun 2012.
2) Matsushita M, Ogasawara M, Kenpe K, Yamaji K, Tamura N, Takasaki Y Non
‑invasive evaluation of pulmonary arterial hypertension in patient with connective tissue disease. The European League Against Rheumatism Annual Congress 2012, Berlin, Germany, Jun 2012.
3) Kawamoto T, Matsushita M, Yamaji K, Tamura N, Takasaki Y. Clinical study of determination of myositis‑associated autoantibodies in Japanese patients with connective tissue diseases except auto
‑immune myositis. American College of Rheumatology 76th Annual Meeting. Washington DC, USA, Nov 2012.
4) Matsushita M, Kawamoto T, Yamaji K, Tamura N, Takasaki Y. Clinical evaluation of anti‑aminoacyl tRNA synthetase antibodies in Japanese patients with connective tissue diseases. American College of Rheumatology 76th Annual Meeting. Washington DC, USA, Nov 2012.
5) Chiba A, Tamura N, Matsudaira R, Yamamura T, Takasaki Y, Miyake S. Mucosal‑associated invariant T cells are inactivated by IFNα and reduced in systemic lupus erythematosus.
American College of Rheumatology 76th Annual Meeting. Washington DC, USA , Nov 2012 6) 石山健太郎, 西山千春, 頭山尚子, 田村直 人, 高崎芳成. 破骨細胞分化における TGF‑β シグナルと転写調節因子 PU.1. 第 56 回日本リ ウマチ学会学術集会, 東京, 2012 年 426‑28 日.
7) Ishiyama K, Tamura N, Yashiro T, Okumura K, Takasaki Y. Role of a transcription factor PU.1 in TGF‑beta signaling‑mediated osteoclast differentiation. Ann Rheum Dis;
72 (Suppl3):380, 2013.
8) 林 絵利，千葉麻子，多田久里守，山路 健，
田村直人，髙崎芳成，三宅幸子．強直性脊椎炎 患者における免疫細胞の解析．第 58 回日本リウ マチ学会総会・学術集会，グランドプリンスホ テル新高輪，東京，2014 年 4 月 24‑26 日．
9) 多田久里守，田村直人，小林茂人，井上 久，
髙崎芳成．本邦における Adalimumab あるいは Infliximab 投与した強直性脊椎炎患者の疾患 活動性予測因子の解析．第 58 回日本リウマチ学 会総会・学術集会，グランドプリンスホテル新 高輪，東京，2014 年 4 月 24‑26 日．
10) Eri Hayashi, Asako Chiba, Mie Kitagaichi, Kurisu Tada, Ken Yamaji, Naoto Tamura, Yoshinari Takasaki and Sachiko Miyake.
Involvement of IL‑17‑Producing MAIT Cells in the pathogenesis of rheumatoid arthritis.
Arthritis Rheumatol 2014;66 (Suppl): s766.
H. 知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）
1. 特許取得 なし
2. 実用新案登録 なし
3. その他 なし
