B Violet Laser Tools(JPN) indd

フローサイトメトリー

バイオレットレーザー

リソースガイド

フローサイトメトリー

バイオレットレーザー

リソースガイド

Molecular Probes

®

_{バイオレットレーザー用試薬}

一次抗体と二次検出

Pacifi c Blue™ と Pacifi c Orange™ 蛍光色素

Pacifi c Blue™ dye

（最大蛍光波長

455 nm

）と

Pacifi c Orange™

dye

（最大蛍光波長

551 nm

）は、共にバイオレットレーザーで励起

が で き、

1

レ ー ザ ーで マル チパ ラメー ター 解 析 が 可 能 で す

（図

1

）。

Pacifi c Blue™

および

Pacifi c Orange™

では、マウス

IgG

およびウサ ギ

IgG

とストレプトアビジンコンジュゲートや、

マウス

IgG

用の

Zenon

®

_{抗体標識キットを取り扱っています。}

Qdot

®

_{ナノクリスタル}

Qdot

®

_{ナノクリスタルの高い蛍光強度はフローサイトメト}

リーにおける理想的な標識が可能です。その非常に明るい

フローサイトメーターの可能性を広げる

バイオレットレーザー

バイオレット励起試薬の利点

:

→ フローサイトメーターの可能性を最大限に引き出すマルチプレックス解析が可能

→ 生死判定、細胞周期解析、細胞生命力測定、細胞増殖およびアポトーシス解析等における

ユニークな解析が可能

→ バイオレットレーザーを最大限に活用することで、他のレーザーでの用途も拡大

→ バイオレット励起で一次検出および二次検出可能な数多くの選択肢をご用意（

Pacifi c

Blue™

、

Pacifi c Orange™

蛍光色素および

Qdot

®

_{ナノクリスタル）}

図1. バイオレット励起によるマルチプレックス解析 ヒト単核細胞を

Pacifi c Blue™ anti-CD4 抗体およびZenon® _{Pacifi c Orange™ anti-CD8} 抗体で標識し、405 nm励起により、450/50 nmおよび585/42 nm蛍光

フィルターの組み合わせで、BD LSR™ IIフローサイトメーターで解析し

ました。右上の図はPacifi c Blue™ dye（青線）と Pacifi c Orange™

dye（オレンジ線）のスペクトルを示しています。 CD4 Pacific Blue™ CD8 Zenon ® P acific Or ange™ 0 102 ₁₀3 ₁₀4 ₁₀5 0 102 103 104 105 波長 (nm) 励起波長 蛍光波長 300350400450500550600650700 図2. Qdot®_{コンジュゲート一次抗体を用いたCD3陽性およびCD4陽} 性細胞集団の多色解析 ヒト末梢血リンパ球をQdot® _{605 anti-CD4} およびQdot® _{655 anti-CD3抗体で標識し、バイオレットダイオードレ} ーザー励起により、605/20 nmおよび655/20 nm蛍光フィルターを用い BD LSR™ IIフローサイトメーターで解析しました。側方散乱光/CD45 によってゲートされたリンパ球をプロットしました。プロット上の矢印 はコンペンセーション値を示します。 1.7% 4.5% Qdot® _{605-CD4 (605/20)} Qdot ® 655-CD3 (655/20) -629 0 M 100 ₁₀4 ₁₀5 -633 0 103 104 105

蛍光は、少量の細胞外タンパク質検出に最適です（図

2

）。

405 nm

のバイオレットレーザーを使用すると、効率的な励起

が可能になります。さらに、

Qdot

®

_{ナノクリスタルコンジ}

ュゲートの蛍光ピークは幅が狭く左右対称であり、バイオ

レットレーザーを用いることでさらに効率的なマルチカ

ラー解析が可能になります（図

3

）。

Qdot

®

_{ナノクリスタル}

で直接コンジュゲートしたマーカーを多数用意している上

に、ビオチン化抗体を検出するための数多くのストレプト

アビジンコンジュゲートもご利用いただけます。

Ordering Information

ヒトマーカー用一次抗体

ターゲット クローン アイソタイプ Pacifi c Blue™ Pacifi c Orange™ Qdot® _{605 Qdot}® _{655 Qdot}® _{705 Qdot}® ₈₀₀

CD2 S5.5 マウス IgG2a Q10172 CD3 UCHT1 マウス IgG2a CD0328 CD0330 Q10054 CD3 S4.1 マウス IgG2a MHCD0328 Q10012 CD4 S3.5 マウス IgG2a MHCD0428 MHCD0430 Q10008 Q10007 Q10060 CD8 3B5 マウス IgG2a MHCD0828 MHCD0830 Q10009 Q10055 Q10059 CD10 MEM-78 マウス IgG1 Q10153 Q10154 CD11c BU-15 マウス IgG1 MHCD11c28 CD14 TüK4 マウス IgG2a MHCD1428 MHCD1430 Q10013 Q10056 Q10064 CD15 H130 マウス IgM MHCD1528 MHCD1530 CD16 3G8 マウス IgG1 MHCD1628 MHCD1630 CD19 SJ25-C1 マウス IgG1 MHCD1928 Q10306 Q10179 CD20 HI47 マウス IgG3 MHCD2030 Q10305 CD27 CLB-27/1 マウス IgG2a Q10065 Q10066 CD38 HIT2 マウス IgG1 Q10053 Q10057 CD45 HI30 マウス IgG1 MHCD4528 MHCD4530 Q10051 Q10155 Q10062 Q10156

CD45RA MEM-56 マウス IgG2b MHCD45RA28 Q10047 Q10069

CD56 MEM-188 マウス IgG2a Q10307

CD62L Dreg 56 マウス IgG1 MHCD62L28

CD64 10.1 マウス IgG1 CD6428

CD95 DX2 マウス IgG1 MHCD9528

HLA-DR Tü36 マウス IgG2a MHLDR28 MHLDR30 Q10052 Q10063

IFN-γ B27 マウス IgG1 MHCIFG28

TNFα MP9-20A4 ラット IgG1 RHTNFA28

ZAP-70 1E7.2 マウス IgG1 MHZAP7028

マウスマーカー用一次抗体 CD3 500A2 ハムスター IgG HM3428 CD3 124-2C11 ハムスター IgG Q10090 CD4 RM4-5 ラット IgG2a MCD0428 MCD0430 Q10092 CD8a 5H10 ラット IgG2b MCD0828 MCD0830 CD11b M1/70.15 ラット IgG2b RM2828 CD25 Pc61-53 ラット IgG1 RM6028 CD31 390 ラット IgG2a RM5228 CD45 30-F11 ラット IgG2b MCD4528 MCD4530 CD45R (B220) RA3-6B2 ラット IgG2a RM2628 RM2630 Q10176 CD62L MEL-14 ラット IgG2a RM4328 CD69 H1-2F3 ハムスター IgG HM4028 F4/80 BM8 ラット IgG2a MF48028 MF48030

Ly-6A/E (Sca-1) D7 ラット IgG2a MSCA28

Ly-6C/G (Gr-1) RB6-8C5 ラット IgG2b RM3028 RM3030

NK1.1 PK-136 マウス IgG2 MM6628

TCRαβ H57-597 ハムスター IgG HM3628

TNFα MP6-XT22 ラット IgG2a RM90128

ZAP-70 1E7.2 マウス IgG1 MHZAP7028

アイソタイプ・コントロール

ハムスター IgG NA ハムスター IgG HM28

マウス IgG1 NA マウス IgG1 MG128 MG130 Q10073 Q10298

マウス IgG2a NA マウス IgG2a MG2a28 MG2a30 Q10014 Q10015 Q10076 Q10075

マウス IgG2b NA マウス IgG2b MG2b28 Q10074

ラット IgG2a NA ラット IgG2a R2a30

ラット IgG2b NA ラット IgG2b R2b28 R2b30

抗体およびZenon®_{標識キット}

製品 Pacifi c Blue™ Pacifi c Orange™ Qdot® _{565 Qdot}® _{605 Qdot}® _{625 Qdot}® _{655 Qdot}® _{705 Qdot}® ₈₀₀

APEX™ 抗体標識キット A10478 モノクローナル抗体標識キット P30013 P30014 Q22031MP Q22001MP A10197 Q22021MP Q22061MP Q22071MP タンパク質標識キット P30012 P30016 Zenon® _{マウスIgG1標識キット Z25041 Z25256} Zenon® _{マウスIgG2a標識キット Z25156 Z25257} セルカウンティング 製品 レーザー 最大蛍光波長 サイズ カタログ番号 CountBright™ Absolute Counting Beads UV–635 nm 385–800 nm 5 mL C36950 標識試薬 製品 反応部位 反応性 Ex/Em サイズ カタログ番号

Pacifi c Blue™ Succinimidyl ester Amines 410/455 nm 5 mg P10163 Pacifi c Blue™ Maleimide Thiols (mercaptans, sulfhydryls) 410/455 nm 1 mg P30506 Pacifi c Orange™ Succinimidyl ester Amines 404/553 nm 1 mg P30253 Pacifi c Orange™ Maleimide Thiols (mercaptans, sulfhydryls) 404/553 nm 1 mg P30507

コンペンセーションビーズ

製品 サイズ カタログ番号

AbC™ Anti-Mouse Bead Kit, for mouse antibody capture

100 tests A10344

AbC™ Anti-Rat/Hamster Bead Kit, for rat/hamster antibody capture, for fl ow cytometry

100 tests A10389

Ordering Information

ストレプトアビジンおよび二次抗体 製品 ホスト 形状 Pacifi c Blue™ Pacifi c

Orange™ Qdot® _{565 Qdot}® _{605 Qdot}® _{625 Qdot}® _{655 Qdot}® _{705 Qdot}® ₈₀₀

抗マウス IgG ヤギ Whole Ab P10993

抗マウス IgG* ヤギ Whole Ab P31582

抗マウス IgG ヤギ F(ab’)2 P31581 P31585 Q11031MP Q11001MP A10195* Q11021MP Q11061MP Q11071MP

抗ウサギ IgG ヤギ Whole Ab P10994 P31584

抗ウサギ IgG ヤギ F(ab’)2 Q11431MP Q11401MP A10194* Q11421MP Q11461MP Q11471MP

ストレプトアビジン NA NA S11222 S32365 Q10131MP Q10101MP A10196 Q10121MP Q10161MP Q10171MP * highly cross-adsorbed 図3. Qdot®_{ナノクリスタルの吸収および蛍光波長プロファイル Qdot}®_{ナノクリスタルは、広い吸収スペクトルを持ち、蛍光ピークの幅が狭く左右対称} な蛍光特性が特徴です。 0 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 5 x 105 1 x 106 1.5 x 106 2 x 106 2.5 x 106 3 x 106 3.5 x 106 4 x 106 4.5 x 106 5 x 106 Wavelength (nm) Extinction coef ficient (M -1cm -1) 8 8 7 7 6 6 5 5 4 4 3 3 2 2 1 1 Normalized fluor escence emission 10分間で標識が完了！ 標的特異的 IgG抗体 + Zenon®_標識試薬 （標識されたFabフラグメント） インキュベーション 標識されたFabフラグメントが IgGに結合 未標識Fabと非特異的IgGの 結合

Zenon

®_{標識キット} 8. Qdot® _{800コンジュゲート励起波長} 7. Qdot® _{705コンジュゲート励起波長} 6. Qdot® _{655コンジュゲート励起波長} 5. Qdot® _{625コンジュゲート励起波長} 4. Qdot® _{605コンジュゲート励起波長} 3. Qdot® _{585コンジュゲート励起波長} 2. Qdot® _{565コンジュゲート励起波長} 1. Qdot® _{525コンジュゲート励起波長} 8. Qdot® _{800コンジュゲート蛍光波長} 7. Qdot® _{705コンジュゲート蛍光波長} 6. Qdot® _{655コンジュゲート蛍光波長} 5. Qdot® _{625コンジュゲート蛍光波長} 4. Qdot® _{605コンジュゲート蛍光波長} 3. Qdot® _{585コンジュゲート蛍光波長} 2. Qdot® _{565コンジュゲート蛍光波長} 1. Qdot® _{525コンジュゲート蛍光波長}

細胞周期解析

Vybrant

®

_{DyeCycle™ Violet Stain}

_による

生細胞の細胞周期解析

Vybrant

®

_{DyeCycle™ Violet}

_{は生細胞の}

_DNA

_{量の解析に使用し}

ます。

Vybrant

®

_{DyeCycle™ Violet Stain}

_は

_DNA

_{選択的かつ細}

胞 膜 透 過 性で、二 本 鎖

DN A

と結 合するまでは 蛍 光を 発しませ

ん。

Vybrant

®

_DyeCycle™

_Violet

_{による細胞周期解析では、次のよ}

うな明瞭な分布パターンを得ることができます

: G

₀

/G

₁

期（細胞

1

個

当たりの染色体が

1

セットのフェーズ）、

S

期（可変量の

DNA

を伴

う

DNA

合成期）および

G

₂

/M

期（細胞分裂に先立つ細胞

1

個当たり

の染色体が

2

セットのフェーズ）

（図

4

）。

Vybrant

®

_DyeCycle™

_Violet

Stain

は、

405 nm

のレーザー励起に適していますが、

UV

励起で使用

することもでき、蛍光ピークが∼

440 nm

になります。この生細胞

標 識 試 薬は、他のパラメーターにより細 胞を同時に標 識するこ

とができるので、

DNA

含量に基づく細胞のソーティングも可能で

す。また、

Vybrant

®

_{DyeCycle™ Violet Stain}

_{は、バイオレットレー}

ザー励起による青色蛍光と赤色蛍光の検出により、哺乳類の造

血組織中の幹 細胞（

SP

細胞）および初期幹 細胞を特定すること

も可能です（図

5

）。

FxCycle™ Violet Stainによる固定細胞の細胞周期解析

FxCycle™ Violet Stain

は、固定細胞の細胞周期解析に使用される

バイオレットレーザー励起試薬です。

FxCycle™ Violet

を細胞周期

解析に使用することで、イムノフェノタイピング、アポトーシス解析

および死細胞の識別などの他の細胞解析で

488 nm

および

633 nm

レー

ザーが使用可能になるので、高度なマルチプレックス解析が可

能になります（図

6

）。蛍光波長の幅が狭い蛍光スペクトルのた

め、

FxCycle™ Violet Stain

は、一般的に使用されている他の試薬

（プロピジウムアイオダイド（

PI

）および

7-ADD

）よりも他の

蛍光チャネルへのオーバーラップが少ないので、必要最低限の

コンペンセーションで正確なデータが得られます。

図5. DyeCycle™ Violet Stainによるヒト臍帯血の幹細胞（SP

細胞）解析細胞は10 µM DyeCycle™ Violet Stainで 37 ℃で

90分間インキュベートし、洗浄後、解析に使用するまで冷凍保

存しました。バイオレットレーザー励起後、DyeCycle™ Violet Stainを青色蛍光チャネルと赤色蛍光チャネルで検出すること により、DyeCycle™ Violet Stain排出能を持つSP細胞（赤色 の括弧部分）が検出されました。Dr. William Telford、NIH 提 供によるデータ。

図4. Vybrant® _{DyeCycle™ Violet Stainによる細胞周期解析}

Vybrant® _{DyeCycle™ Violet Stainで染色されたJurkat生細} 胞のDNA量の分布を示すヒストグラム。G0/G1とG2/M期のピー ク間にS期が分布しています。Violet 405 nm励起により440/40 nm

のバンドパスフィルターでデータを取得しました。

Vybrant® _{DyeCycle™ Violet fluorescence}

Number of cells counted

0 50 100 150 200 250 500 0 1,000 1,500 2,000

DyeCycle™ _{Violet red fluorescence}

0 200 400 600 800 1,000

DyeCycle

™ Violet blue fluor

escence 200 400 600 800 1,000 0

Ordering Information

製品 Cell status Ex/Em サイズ カタログ番号

Vybrant® _{DyeCycle™ Violet Stain Live 369/437 200 µL V35003}

FxCycle™ Violet Stain Fixed 358/461 1 kit F10347 参考文献：13ページ

図6. マルチパラメーターによる細胞周期およびイムノフェノ

タイピング解析TF-1赤芽細胞を一晩アルコールで固定し、洗浄

後、0.1% Triton® _{X-100/PBS/1% BSAで懸濁してから、Zenon}®

Alexa Fluor® _{488 ウサギ IgG標識試薬で標識した抗ヒストンH3}

[pS10]精製抗体（Cat. No. 441190G）とFxCycle™ Violet Stainで

染色しました。pH3を発現している細胞群を、有糸分裂期にあ

る細胞群中より識別できています。

FxCycle™ Violet fluorescence

pH3-Alexa Fluor ® 488 fluor escence 50 100 100 200 250 0 102 103 104 105

DNA

合成を指標とした細胞増殖解析

Click-iT™ EdU Pacifi c Blue™ Flow Cytometry Assay Kit

DNA

合成中にヌクレオシドを取り込ませることで、新生

DNA

を直接測定します。

従来は、ヌクレオシドアナログであるブロモデオキシウリジン（

BrdU

）を

DNA

に取

り込ませ、

anti-BrdU

抗体で検出しました。この方法は、

BrdU

を抗体に曝露する

ために、

HCl

処理や熱処理、デオキシリボヌクレアーゼを使用した

DNA

変性が必要

で、均一性の高い結果を得るには操作が非常に長く困難であり、サンプルの品質に

対して悪影響が生じます。

Click-iT™ EdU Pacifi c Blue™ Flow Cytometry Assay Kit

は、

DNA

変性の必要性がなく、標準的な

BrdU

抗体法でフローサイトメトリーを

使って細胞の増殖を測定する方法に代わる優れた製品です。

Click-iT™

の利点は、

ユ ニー クな低 分 子 化 合 物 を 用 い 、特 異 的 に共 有 結 合で反 応 するため 、バック

グランドを低く抑えることができる点にあります。

5-ethnyl-2

’

-deoxyuridine

（

EdU

）はアル キン を 含 有 するヌクレ オシド ア ナ ログ で す。銅 触 媒 反 応 で、

アルキンは

Pacifi c Blue™ dye

で標識化されたアジ化物に反応し、安定した共有結

合を形成します。低分子のアジ化物の試薬は、細胞に対する激しい処理を施さなく

ても

DNA

へ効率的に取り込まれるので、処理過程が簡易化されるにもかかわらず、

従来法と同程度以上の結果を得られます（図

7

、

8

）。

Click-iT™ EdU

標識化ケミスト

リーはほとんどの固定プロトコルと互換性を持っています。

Ordering Information

製品名 Ex/Em サイズ カタログ番号

Click-iT™ EdU Pacifi c Blue™ Flow Cytometry Assay Kit 410/455 1 kit A10034 参考文献：13ページ

図7. Click-iT™ EdU Pacifi c Blue™ Flow

Cytometry Assay Kitによる細胞増殖解析

Jurkat細胞を10µM EdUで2時間処理し、プロ トコルに従って検出しました。細胞はPacific Blue™ azideで標識後、405 nm励起し450/50 nmバンドパ スフィル ターにより検 出しまし た。シグナル／バックグラウンド比（S/N比） は、マーカーで 示されるように、Click-iT ™ EdU陽 性 細 胞 群（P3）の蛍 光強 度の中央 値 と、増殖していない細胞群（P2）の蛍光強度 の中央値を除算して計算されます。

Click-iT™ _{EdU Pacific Blue}™

fluorescence Number of cells 103 102 ₁₀4 ₁₀5 0 S/N = 13 100 150 200 250 50 0 P3 P2 7-AAD fluorescence

Click-iT™ EdU Pacific Blue™ fluor

escence 50 100 150 200 250 -20 105 104 103 102 101 図8. Click-iT™の技術を使った細胞増殖の フローサイトメトリー解析 Jurkat細胞を10 µM EdUで2時間処理し、固定・透過・クリッ ク反 応による 標 識・洗 浄・7-A A Dで 標 識し た 後、細 胞 周 期 解 析を 行 いました 。細 胞 は フローサイトメーターを使用して405 nm励起、 450⁄50 nmバンドパスおよび675⁄20 nmバン ドパスフィルターで解析しました。

細胞増殖解析（蛍光量の減衰を指標とした世代数解析）

CellTrace™ Violet Cell Proliferation Kit

CFSE

はその均一な細胞標識能および世代間に亘る優れた解像度により、生体内に

おける細胞増殖の解析に広く使用されています。

CFSE

による細胞増殖解析は色

素の希釈により得ることができ、細胞分裂後、娘細胞は細胞分裂後に親細胞の半

分の蛍光強度になります。

CFSE

は膜マーカー

PKH26

のような他の細胞トラッキ

ング用試薬よりも均一な細胞標識化が行えるので、優れた世代間の解像度を達成

できます。しかしながら、

CFSE

はフルオレセイン分子に基づくので、

GFP

発現

細胞あるいは

FITC

共役抗体によるイムノフェノタイピングと、

CFSE

を用いた細

胞増殖実験を組み合わせて行なうことは不可能でした。

CellTrace™ Violet Cell

Proliferation Kit

は、

CFSE

と同様に色素希釈により細胞増殖解析が可能であり、

バイオレットレーザー励起により青色蛍光を発するため、

GFP

発現細胞を含む

広範囲な青色励起蛍光と細胞増殖実験を組み合わせて行なうことができます。ま

た、

CellTrace™ Violet

は

CFSE

よりも優れた細胞保持力があり、細胞毒性も低い

ので、

10

世代までの分解能が可能になります（図

9

）。

Ordering Information

製品名 Ex/Em サイズ カタログ番号

CellTrace™ Violet Cell Proliferation Kit 405/450 1 kit C34557

図9. 10µM CellTrace™ Violet Cell Proliferation

Kitで染色されたヒトCD8ポジティブTリンパ球

の細胞増殖分析

CellTrace™ Violet fluorescence

0 50 100 150 200 Number of cells 10 20 30 40 0 Parent Generation 2 Generation 3 Generation 4 Generation 5 Generation 6 Generation 7 Generation 8 Generation 9 Generation 10

図10. 固定可能な死細胞標識試薬の使用例

LIVE/DEAD® _{Fixable Aqua Dead Cell Stain}

Kit を用いて、生細胞（左側のピーク）と 熱処理したJurkat細胞（右側のピーク）の 混合試料を用いて生死判定を行いました。 （A）の細胞は未固定のサンプルで、（B）の 細胞は標識反応後に3.7%ホルムアルデヒ ドで固定しました。サンプルは405 nm励起お よび∼525 nm蛍光でフローサイトメトリーを 用いて解析しました。

LIVE/DEAD® _{Fixable Aqua fluorescence}

Number of cells 102 103 104 105 Number of cells 102 103 104 105 25 0 50 75 100 125 0 50 100 150 未固定 固定後 生細胞 生細胞 死細胞 死細胞

B

A

SSC

Lymphocyte gate Viability gate

生細胞 死細胞 CD4 Cy ®5.5 PE CD4 Cy ®5.5 PE FSC SSC CD8 Qdot® ₇₀₅ CD8 Qdot® ₇₀₅ Fixable Violet 0.55%

C

A

D

B

図11. 死細胞を排除することで、アーチファクトの少ないより正確な解析が可能Lymphocyteを

ゲーティング後（A）、LIVE/DEAD®_{Fixable Violet dyeにより生細胞と死細胞をゲーティングし} ました（B）。死細胞（C）および生細胞（D）を、CD4およびCD8抗体でイムノフェノタイピン

グ解析した結果、2つの細胞集団は明白な表現型の差を示しました。

生死判定

固定を必要とするプロトコル用生死判定試薬

:

LIVE/DEAD

®

_{Fixable Dead Cell Stains}

固定可能な

LIVE/DEAD

®

_{Fixable Dead Cell Stains}

_{は、アミノ基と共有結合する}

細胞膜非透過性色素を用いており、生細胞の場合は細胞内部に入り込めないため、

標識試薬は生細胞の表面タンパク質のみに反応します。一方、死細胞では標識試

薬は細胞質全体のタンパク質を標識するので、死細胞は生細胞より少なくとも

50

倍の蛍光を発します。標識は共有結合性なので、アルデヒド固定・透過処理後も

生死判定能は保持されます（図

10

）。

LIVE/DEAD

®

_{Fixable Dead Cell Stains}

_はバ

イオレットレーザーでご利用いただける

Violet

（∼

460 nm

最大蛍光波長）、

Aqua

（∼

530 nm

最大蛍光波長）および

Yellow

（∼

575 nm

最大蛍光波長）の

3

種類をご

用意しております。これらの試薬は、分析前にサンプルを固定する場合や、細胞内

マーカー染色とともに死細胞の識別をする場合に理想的です（図

11

）。

P1 SYTOX ® Blue stain 250 200 150 100 50 103 102 104 105

Vybrant® _{DyeCycle™ Green stain}

SYTOX ® Blue stain 250 200 150 100 50 0 500 1,000 1,500 2,000 図13. 熱処理済みの細胞と未処理細胞の混 合物を使用した死細胞標識試薬とエステラ ーゼ基質の解析例 CHO細胞をLIVE/DEAD®

Violet Viability/Vitality Kit（Calcein violetと

Fixable violet dead cell stain）のプロトコル

に従って標識しました。405 nm励起を使用し

て、フローサイトメトリーによって解析しまし た。

Calcein violet fluorescence

Fixable Aqua stain fluor

escence 0 102 ₁₀3 ₁₀4 ₁₀5 0 102 103 104 105 405 nm excitation Live Dead

固定なしの生死判定試薬: SYTOX

®

_{Blue Dead Cell Stain}

SYTOX

®

_{Blue Dead Cell Stain}

_{は、プロピジウムアイオダイド（}

_PI

_{）に似たメカニ}

ズムを持つ高親和性の核酸標識試薬で、完全ではない原形質膜を容易に浸透しま

すが、完全な細胞膜を通過できないため、死細胞の核酸と結合することで蛍光を

発します。

SYTOX

®

_{Blue Dead Cell Stain}

_{で短時間インキュベートした後、}

_{405 nm}

のバイオレットレーザーで励起すると、死細胞の核酸は蛍光を発します（図

12

）。

SYTOX

®

_{Blue Dead Cell Stain}

_{は、核酸と結合することにより}

₅₀₀

_{倍以上の蛍光を}

発し、バイオレットレーザー搭載のフローサイトメーターで使用できる、簡便で

定量的なシンプルな死細胞インジケーターです。

細胞生命力測定用試薬: Calcein Violet AM

細胞内のエステラーゼ活性により測定されるような細胞生命力は、広く使用されて

いる細胞の健康パラメーターです。非蛍光性の細胞透過性

Calcein violet AM

は、

生細胞に遍在する細胞内エステラーゼ活性により蛍光性の

Calcein violet

に変換さ

れることで測定されます（

400 nm

励起、

452 nm

蛍光）。

Calcein violet AM

は

Cell

Vitality

や

Cell Health

測定において最適な試薬であり、バイオレットレーザーで使

用できるため、他のレーザーを用いた一般的な蛍光標識マーカーと組み合わせて

使用できます。

Calcein violet AM

は単独でも使用できますし、

LIVE/DEAD

®

_Violet

Viability/Vitality Kit

の

Aqua

蛍光色素を用いた死細胞反応性色素と組み合わせて使

用することもできます（図

13

）。このユニークなキットの使用で、バイオレット

レーザーを使って、生細胞と死細胞の両方を解析することができます。

図12. Vybrant® _{DyeCycle™ Green Stain}

とSYTOX® _{Blue Dead Cell Stainの使用例}

Jurkat細胞をVybrant® _{DyeCycle™ Green}

Stainで染色し、次に細胞膜非透過性のDNA

標識試薬であるSYTOX® _{Blue Dead Cell}

Stainで染色後、405 nmおよび488 nm励起し、 死細胞を除去するためにSYTOX® _{Blue陰性細胞} をゲーティングしてフローサイトメーターで 解析しました。その後、生細胞のみの細胞周 期をVybrant® _{DyeCycle™ Green stainingの} ヒストグラムで評価しました。

B

A

Ordering Information

製品 Cell status Ex/Em サイズ カタログ番号

固定可能な死細胞標識試薬

LIVE/DEAD® _{Fixable Violet Dead Cell Stain Kit Dead 416/451 1 kit L34955}

LIVE/DEAD® _{Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit Dead 367/526 1 kit L34957}

LIVE/DEAD® _{Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit Dead 400/575 1 kit L34959}

LIVE/DEAD® _{Fixable Dead Cell Sampler Kit Dead Various 1 kit L34960}

固定サンプル用コンペンセーションビーズ

ArC™ Bead Kit, for use with amine reactive

dyes, for fl ow cytometry compensation NA NA 1 kit A10346

核酸結合死細胞標識試薬

SYTOX® _{Blue Dead Cell Stain, for fl ow}

cytom-etry

Dead 444/480 1 mL S34857

Viability / Vitality

LIVE/DEAD® _{Violet Viability/Vitality Kit Live/Dead} 400/452 (Live)

367/526 (Dead)

1 kit L34958

Calcein Violet, AM Live 400/452 20 x 25 µg C34858

アポトーシス解析

細胞膜の非対称性

アポトーシスは核染色体の凝集と断片化、細胞質の収縮お

よび細胞膜の非対称性の損失を含む、特有の形態的およ

び生化学的変化によりネクローシスと区別されます。蛍

光標識されたアネキシン

V

コンジュゲートは細胞膜非対称

性の変化を解析するために使用される最も一般的な試薬

です。

Pacifi c Blue™ Annexin V/SYTOX

®

_AADvanced™

Apoptosis Kit

で、アポトーシス解析を迅速かつ簡便に行え

ます。キットには、感度を最大にするためのバイオレット

励起

Pacifi c Blue™ dye

標識組換えアネキシン

V

、そして細

胞膜完全性に基づいてアポトーシス細胞を識別するための

赤色蛍光

SYTOX

®

_{AADvanced™ Dead Cell Stain}

_が含まれ

ています。

Pacifi c Blue™ dye

は

415 nm

の最大励起波長と

455 nm

の最大蛍光波長を持つので、フローサイトメトリーで

のバイオレットレーザー励起に適しています。

レシオメトリックな膜非対称性

Violet Ratiometric Membrane Asymmetry Probe/Dead

Cell Apoptosis Kit

は、アポトーシス検出のための簡便で

効率的な方法であるバイオレットレーザー・フローサイト

メーター用の検出キットです。キットは接着細胞にも浮

遊細胞にも有効に働き、カスパーゼ検出やミトコンドリア

膜電位変化の検出といった他のアポトーシスインジケー

ターとも相関します。このキットにはバイオレット・レシ

オ メ ト リ ッ ク 非 対 称 プ ロ ー ブ で あ る

F 2 N 1 2 S

を 含 み ま

す。

F2N12S

は励起状態分子内プロトン移動（

ESIPT

）反応

により、

530 nm

および

585 nm

の

2

本の蛍光ピークを発し、

表面電荷によって

2

色のレシオメトリック反応を生じま

す。アポトーシスによって原形質膜の外側の表面電荷の

変化が引き起こされると、バイオレット膜非対称プロー

ブ

F2N12S

は、

2

本の蛍光ピークの相対強度の変化によっ

て、アポトーシス中に生じる膜非対称性の変化をモニター

することができます（図

14

）。アネキシンと異なり、こ

の解析法は特別なバッファーまたは洗浄ステップを必要と

せず、接着細胞の分析時に物理的または化学的な細胞膜損

傷による影響が低いので、より精度の高いデータが得ら

れます。レシオメトリックプローブは、細胞のサイズや

レーザー光量の変動、あるいは検出器の感度のような機器

の差異を自動較正でき、プローブ濃度に依存しないアポ

トーシス解析を実現できます。

膜透過性

アポトーシス解析を行う際に、アネキシン

V

で細胞を標識す

ることが最適な方法ではない状況がいくつかあります。例

えば、アネキシンＶ結合に必要な高カルシウム濃度に細胞

が敏感なアッセイや、接着細胞のホスファチジルセリン検

出がトリプシン処理によって悪影響をおよぼすアッセイお

よびサンプルの洗浄が困難なアッセイなどです。バイオレ

ットレーザー励起

Cyanine

蛍光色素

PO-PRO™-1

は、原形質

膜の非対称性の喪失に伴うアポトーシス細胞膜の透過性変

化により、アポトーシス細胞の細胞膜を透過し核酸と結合

します。ここから細胞膜非透過性の蛍光色素により死細胞

染色を除く事で、アポトーシス細胞を識別出来ます。

Violet

Membrane Permeability/Dead Cell Apoptosis Kit

は、

迅速で簡便なアポトーシス解析が可能です。キットには、

アポトーシス細胞を特定するための

PO-PRO™-1

、そして

膜透過性に基づき死細胞を識別するための赤色蛍光染料

7-AAD

が含まれています（図

15

）。

F2N12S orange fluorescence F2N12S gr een fluor escence 0 65,536 131,072 196,608 262,144 0 65,536 131,072 196,608 262,144 Live cells Apoptosis+Dead cells

A

F2N12S orange fluorescence F2N12S gr een fluor escence 0 65,536 131,072 196,608 262,144 0 65,536 131,072 196,608 262,144 Live cells Apoptosis+Dead cells

B

F2N12S ratio 585 nm/530 nm fluorescence x 1,000 SYTOX ® AADvanced ™ fluor escence 0 1,200 2,500 3,750 5,000 101 102 103 104 105 Live cells Apoptosis cells Dead cells

C

F2N12S ratio 585 nm/530 nm fluorescence x 1,000 SYTOX ® AADvanced ™ fluor escence 0 1,200 2,500 3,750 5,000 101 102 103 104 105 Live cells Apoptosis cells Dead cells

D

図14. 10µMカンプトテシンで4時間処理したJurkat細胞（ヒト白血病T細胞）（パネルB, D）およ び処理をしていないコントロール（パネルA, C） 細胞をプロトコルに従って染色し、F2N12Sを 405 nm励起で585 nmおよび530 nmのバンドパスフィルターで検出し、SYTOX® _AADvanced™

Dead Cell Stainには488 nm励起で695 nmのバンドパスフィルターを用いて解析しました。パネ

ルAとBでは、生細胞はF2N12Sからの2本の蛍光バンドの相対強度により、アポトーシス細胞と

死細胞から識別することができます。パネルCとDではSYTOX® _{AADvanced™ Dead Cell Stain} の蛍光と、F2N12Sの2本の蛍光バンド(585/530 nm)の比率の2パラメーターに対してプロットさ れ、生細胞と死細胞、アポトーシス細胞のそれぞれを識別できています。

図15. アポトーシス検出用のバイオレット励起

DNA標識試薬 Jurkat細胞を10µMカンプトテ シンで4時間処理した後、Violet Membrane Permeability/Dead Cell Apoptosis Kit試 薬で標識しました。細胞は405 nmおよび488

nmの励起によりフローサイトメトリーで解析

しました。アポトーシス細胞と生細胞および 死細胞を明確に識別できています。

PO-PRO™-1 dye fluorescence

7-AAD fluorescence 102 ₁₀3 ₁₀4 ₁₀5 102 103 104 105 _{Dead cells}

Ordering Information

製品 アポトーシス細胞の染色 死細胞の染色 Ex/Em assays

カタログ 番号

Annexin V-Pacifi c Blue™ conjugate

Annexin V-Pacifi c Blue™

NA 410/455 500 µL A35122

Violet Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit with Pacifi c Blue™ Annexin V/SYTOX®

AADvanced™ Annexin V-Pacifi c Blue™ SYTOX® AADvanced™ 410/455 （アポトーシス細胞） 546/647（死細胞） 1 kit A35136

Violet Chromatin Condensa-tion/Dead Cell Apoptosis Kit with Vybrant® _DyeCycle™

Violet/SYTOX® _AADvanced™ Vybrant® DyeCycle™ Violet SYTOX® AADvanced™ 369/437 （アポトーシス細胞） 546/647（死細胞） 1 kit A35135

Violet Ratiometric Mem-brane Asymmetry Probe/ Dead Cell Apoptosis Kit

F2N12S SYTOX ® AADvanced™ 405/585（生細胞） 405/530 （アポトーシス細胞） 546/647（死細胞） 1 kit A35137

Violet Membrane Permeabil-ity/Dead Cell Apoptosis Kit, with PO-PRO™-1 and 7-AAD

PO-PRO™-1 7-AAD 435/455 （アポトーシス細胞） 546/647（死細胞） 1 kit V35123

アポトーシス解析

クロマチン凝縮

アポトーシス細胞は核クロマチン凝縮の増加を示します。いくつかの核染色法

で標識した際に、クロマチン凝縮した核の蛍光強度は高くなります。

Vybrant

®

DyeCycle™ Violet /SYTOX

®

_{AADvanced™ dye}

_{が含まれている}

_{Violet Chromatin}

Condensation/Dead Cell Apoptosis Kit

は、アポトーシス細胞のクロマチン凝集

状態の蛍光解析に基づいた迅速で簡便なアポトーシス解析が行えます（図

16

）。

キットには細胞透過性のバイオレットレーザー励起

Vybrant

®

_{DyeCycle™ Violet}

Stain

および非透過性の赤色蛍光

SYTOX

®

_{AADvanced™ Dead Cell Stain}

_が含まれ

ています。アポトーシス細胞の凝縮クロマチンは、

Vybrant

®

_{DyeCycle™ Violet}

Stain

により正常細胞のクロマチンよりも明るく染色されます。

図16. 10µMカンプトテシンで6時間処理し

たJur kat細 胞（ヒト白 血 病T細 胞 ）（ パ ネ

ルB）と処 理してい ないJurkat細 胞（パネ

ルA）細胞にVybrant® _{DyeCycle™ Violet/}

SYTOX® _{AADvanced™ Apoptosis kitの試} 薬を加え、405/488 nm二重励起を使用して フローサイトメトリーで解 析しました。カン プトテシンで処理した細胞（パネルB）は、 コントロール 細胞（パネルA）で見られるア ポトーシス 細 胞よりもアポトーシス 細 胞の 割合が高いことが確認できます。

Vybrant® _{DyeCycle™ Violet fluorescence}

SYTOX ® AADvanced™ fluor escence 102 101 103 104 105 -102 0 102 103 104 105

Live cells Apoptosis cells

Dead cells

A

Vybrant® _{DyeCycle™ Violet fluorescence}

SYTOX ® AADvanced™ fluor escence 102 101 ₁₀3 ₁₀4 ₁₀5 -102 0 102 103 104 105

Live cells Apoptosis cells

Dead cells

Qdot

®

_{ナノクリスタルおよびバイオレットレーザー励起用のスペクトル特性}

および推奨フィルター

蛍光色素/ナノクリスタル 励起波長（nm） ピーク蛍光波長（nm） 推奨フィルター Qdot® _{565 405* 565 575/26} Qdot® _{605 405* 605 605/20} Qdot® _{625 405* 625 625/20} Qdot® _{655 405* 655 655/20} Qdot® _{705 405}† _{705 720/20} Qdot® _{800 405}† _{800 787/42} Pacifi c Blue™ 410 455 450/50 Pacifi c Orange™ 400 551 585/42 CellTrace™ Violet 391 450 450/50 PO-PRO™-1 435 455 450/50 Calcein violet, AM 400 452 450/50

SYTOX® _{Blue Dead Cell Stain 444 480 440/40}

LIVE/DEAD® _{Fixable Violet Dead Cell Stain 416 451 450/50}

LIVE/DEAD® _{Fixable Aqua Dead Cell Stain 367 562 525/30}

LIVE/DEAD® _{Fixable Yellow Dead Cell Stain 400 551 585/42}

Vybrant® _{DyeCycle™ Violet Stain 369 437 440/40}

FxCycle™ Violet Stain 358 461 450/50

* Qdot®_{ナノクリスタルは、UVおよび405 nmで最適に励起されますが、488 nmのレーザーでも励起可能です。† Qdot}®_{705および Qdot}®_{800は633 nmレーザーでも} 励起可能です。

参考文献

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Click-iT™ EdU cell proliferation assay

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LIVE/DEAD® _{Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit}

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Attune™ Acoustic Focusing Cytometer

のための蛍光選択ガイド

レーザー 励起波長 蛍光チャネル 蛍光フィルタ Filter range (nm) 主な蛍光色素 その他の蛍光色素

Violet 405 Blue 450/50 425–475 Pacifi c Blue™ PO-PRO™-1

    Alexa Fluor® _{405 DyeCycle™ Violet}

    Fixable Violet Dead Cell Stain

    CellTrace™ Violet

    Calcein Violet

    SYTOX® _Blue

    FxCycle™ Violet

  Green 522/31 507–537   Fixable Aqua Dead Cell Stain

  Yellow 603/48 579–627 Pacifi c Orange™ Fixable Yellow Dead Cell Stain

      Qdot® ₆₀₅  

Blue 488 Green 522/31 507–537 Alexa Fluor® _{488 Calcein}

    Fluorescein Fluo-3/fl uo-4

    TO-PRO®_-1     CFSE     GFP     JC-1/DiOC2(3)     SYTOX® _Green     DyeCycle™ Green     Rhodamine 123     YO-PRO®_-1

    Fixable Green Dead Cell Stain

  Yellow 575/26 562–588 PE PI     Fura Red™     DyeCycle™ Orange     JC-1/DiOC2(3)     pHrodo™ dye     SNARF® _{(低 pH)}

  Orange 645LP >645 PE-Alexa Fluor® _{610 PI}

    PerCP JC-1/DiOC2(3)

    PE-Alexa Fluor® _{700 Fixable Red Dead Cell Stain}

    PE-Cy®_{5.5 7-A AD}

    TRI-COLOR® _SNARF® _{(高 pH)}

    PE-Cy®_{7 SYTOX}® _{A ADvanced™}

    PE-Alexa Fluor® _{750 DyeCycle™ Ruby}

    Qdot® ₆₅₅

    Qdot® ₇₀₅  

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