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学 位 論 文 の 内 容 の 要 旨
学 位 論 文 題 目
肺 投 与 型 ド ラ ッ グ デ リ バ リ ー シ ス テ ム の 肺 が ん 治 療 に お け る 有 用 性 に 関 す る 研 究
指 導 教 員 丁 野 純 男 学 位 申 請 者 兼 平 幸 宗
肺 が ん は 我 が 国 の が ん 死 亡 数 の 第 一 位 で あ り 、世 界 的 に も 上 位 で あ る こ と か ら 、最 優 先 し て 克 服 す べ き 疾 患 で あ る 。肺 が ん 治 療 の た め に 、病 態 の 進 行 や 発 症 に 関 与 す る 分 子 標 的 薬 な ど の 薬 理 学 的 研 究 が 盛 ん に 行 わ れ て い る が 、未 だ 奏 功 す る 治 療 薬 の 開 発 に は 至 っ て い な い 。そ の 理 由 と し て 、優 れ た 薬 理 作 用 を 有 す る 抗 腫 瘍 薬 で あ っ て も 、骨 髄 抑 制 や 重 篤 な 腎 障 害 な ど の 他 臓 器 に お け る 副 作 用 発 現 の た め に 、治 療 途 中 で 投 与 中 止 や 減 量 を 余 儀 な く さ れ る こ と が 挙 げ ら れ る 。そ れ ゆ え 、抗 腫 瘍 薬 の 腫 瘍 組 織 へ の 選 択 的 送 達 に よ る 、高 い 治 療 効 果 と 安 全 性 を 両 立 し た 、 新 た な 肺 が ん 治 療 法 の 開 発 が 切 望 さ れ て い る 。
こ れ ま で に 、当 研 究 室 で は 呼 吸 器 感 染 症 や 肺 線 維 症 の 治 療 を 目 的 と し て 、肺 投 与 型 ド ラ ッ グ デ リ バ リ ー シ ス テ ム（
DDS
）の 開 発 研 究 を 進 め て き た 。そ の 過 程 に お い て 、肺 投 与 は 、血 液 を 介 さ ず に 肺 内 へ 直 接 薬 物 を 送 達 可 能 な 方 法 で あ り 、全 身 性 副 作 用 を 回 避 で き る こ と か ら 、静 脈 内 投 与 や 経 口 投 与 に 替 わ る 新 規 投 与 経 路 と し て 有 用 で あ る こ と を 強 く 示 唆 し て き た 。一 方 、病 態 の 種 類 や 進 行 状 況 に よ っ て は 、標 的 細 胞 へ の 薬 物 送 達 効 率 や 肺 内 滞 留 性 が 不 足 し 、十 分 な 治 療 効 果 が 得 ら れ な い 場 合 が あ る こ と も 同 時 に 明 ら か と し て き た 。す な わ ち 、肺 が ん 治 療 に 最 適 化 し た 肺 投 与 型DDS
を 構 築 す る た め に は 、 抗 腫 瘍 薬 を 直 接 送 達 す る こ と に 意 義 が あ る か 否 か を 把 握 し た う え で 、送 達 す る 抗 腫 瘍 薬 の 治 療 効 果 を 最 大 限 に 発 揮 さ せ る こ と が で き る 製 剤 の 設 計 ・ 調 製 が 必 要 で あ る 。本 研 究 で は 、 肺 が ん 治 療 を 指 向 し た 肺 投 与 型
DDS
の 構 築 を 目 的 と し 、 転 移 性 肺 が ん モ デ ル マ ウ ス を 用 い て 種 々 の 検 討 を 行 っ た 。 以 下 、1.
肺 が ん 治 療 に お け る 抗 腫 瘍 薬 の 肺 へ の 直 接 送 達 の 意 義 、2.
腫 瘍 細 胞 へ の 標 的 指 向 能 を 付 与 し た ナ ノ 粒 子 製 剤 の 設 計 ・ 調 製 、3.
ナ ノ 粒 子 製 剤 を 用 い た 肺 投 与 型DDS
の 肺 が ん 治 療 に お け る 有 用 性 に つ い て 各 々 論 述 す る 。- 2 -
1.
肺 が ん 治 療 に お け る 抗 腫 瘍 薬 の 肺 へ の 直 接 送 達 の 意 義肺 が ん 治 療 に お い て 、抗 腫 瘍 薬 を 肺 へ 直 接 送 達 す る こ と に 意 義 が あ る か 否 か を 検 討 し た 。 マ ウ ス メ ラ ノ ー マ （
B16F10） を マ ウ ス の 尾 静 脈 内 に 注 入 し 、 転
移 性 肺 が ん モ デ ル マ ウ ス を 作 成 し た 。蛍 光 観 察 が 可 能 な 抗 腫 瘍 薬 で あ る ド キ ソ ル ビ シ ン を モ デ ル 薬 物 と し 、そ の 溶 液 をMicroSprayer
で 肺 投 与 し た の ち 、採 血 及 び 肺 の 摘 出 を 行 っ た 。通 常 の 投 与 経 路 で あ る 静 脈 内 に 投 与 し た 場 合 と 比 較 し て 、肺 投 与 し た 場 合 の ド キ ソ ル ビ シ ン の 肺 中 濃 度 は 有 意 に 高 く 、逆 に 血 清 中 濃 度 は 有 意 に 低 値 で あ っ た（Fig. 1）。ま た 、腫 瘍 部 位 を 明 確 に し た 組 織 薄 切 切 片
像 に お い て も 、肺 投 与 し た 場 合 に は 、ド キ ソ ル ビ シ ン 由 来 の 蛍 光 が 静 脈 内 投 与 時 と 比 較 し て 腫 瘍 部 位 に 強 く 観 察 さ れ た （Fig. 2
）。こ れ ら の 結 果 か ら 、抗 腫 瘍 薬 の 肺 投 与 は 、腫 瘍 部 位 へ の 薬 物 送 達 性 に 優 れ た 投 与 方 法 で あ る こ と が 示 さ れ た 。抗 腫 瘍 薬 を 肺 へ 直 接 送 達 す る こ と は 、薬 効 増 強 の み な ら ず 、血 液 を 介 し た 他 臓 器 へ の 分 布 に 由 来 す る 全 身 性 副 作 用 の 回 避 の 観 点 か ら も 意 義 深 い と 考 え る 。
Fig. 1 Doxorubicin concentrations in serum (A) and in the lungs (B) following intrapulmonary and intravenous administration to mice with metastatic lung tumor
Doxorubicin (400 μg/kg) was administered intrapulmonarily or intravenously to mice with metastatic B16F10 lung tumor. The doxorubicin concentrations in serum at 4, 6, and 8 h and those in the lungs at 8 h are shown. Each point represents the mean ± SD (n = 4). *p < 0.05 and ** p < 0.01.
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Fig. 2 Doxorubicin distribution in the lung following intrapulmonary and intravenous administration to mice with metastatic lung tumor
Doxorubicin (400 μg/kg) was administered intrapulmonarily or intravenously to mice with metastatic B16F10 lung tumor. At 8 h after administration, serial sections were prepared by cryobiopsy. (A); Red fluorescence indicates the distribution of doxorubicin in lung tissue. The dotted line represents the tumor region (T). Scale bar is 100 μm. (B); The fluorescent intensity derived from doxorubicin was analyzed using ImageJ software. Each point represents the mean ± SD (n = 3). *p < 0.05.
2.
腫 瘍 細 胞 へ の 標 的 指 向 能 を 付 与 し た ナ ノ 粒 子 製 剤 の 設 計 ・ 調 製前 項 に お い て 、抗 腫 瘍 薬 を 直 接 肺 投 与 す る こ と で 、腫 瘍 部 位 へ の 優 れ た 送 達 と 全 身 性 副 作 用 の 回 避 が 可 能 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。し か し な が ら 、抗 腫 瘍 薬 の 多 く は 、腫 瘍 細 胞 の み な ら ず 他 の 多 く の 細 胞 に 対 し て 強 い 殺 細 胞 作 用 を 示 す こ と か ら 、肺 投 与 す る と 肺 の 正 常 細 胞 に 対 す る 毒 性 発 現 の 危 険 性 が 否 定 で き な い 。そ の た め 、よ り 良 い 肺 が ん 治 療 を 行 う た め に は 、腫 瘍 細 胞 に 対 し て 選 択 的 に 作 用 す る 薬 物 を 、 腫 瘍 部 位 へ 効 率 良 く 送 達 す る 必 要 が あ る 。
21-23
塩 基 対 か ら 成 る 二 本 鎖RNA
で あ るsiRNA
は 、 細 胞 質 内 に 導 入 す る こ と で 特 定 遺 伝 子 の 発 現 を 抑 制 す る こ と か ら 、従 来 の 抗 腫 瘍 薬 と は 異 な り 、腫 瘍 細 胞 に 対 し て 選 択 的 な 作 用 を 示 す こ と が 期 待 さ れ る 。そ の 一 方 で 、siRNAは 分 子 量 が1
万 超 の 水 溶 性 高 分 子 で あ る た め 、細 胞 膜 透 過 性 が 極 め て 低 く 、分 解 酵 素 に 対 す る 生 体 内 安 定 性 に も 乏 し い こ と か ら 、siRNA
を 標 的 細 胞 の 細 胞 質 内 に 導 入 す る た め の 優 れ た 送 達 技 術 の 開 発 が 求 め ら れ て い る 。- 4 -
こ の よ う な 背 景 の も と 、
siRNA
の 腫 瘍 細 胞 へ の 標 的 指 向 能 を 付 与 し た 肺 投 与 型DDS
を 構 築 す べ く 、siRNA
を 封 入 し た ナ ノ 粒 子 製 剤 を 設 計 ・ 調 製 す る こ と と し た 。ナ ノ 粒 子 製 剤 の 設 計・調 製 の コ ン セ プ ト と し て は 、siRNA を 製 剤 内 に パ ッ ケ ー ジ ン グ す る た め に ｢siRNA
を 製 剤 コ ア 内 へ 充 填 す る ｣､siRNA の 生 体 内 安 定 性 を 向 上 さ せ る た め に ｢製 剤 コ ア を 被 覆 保 護 す る ｣、siRNA
の 細 胞 膜 透 過 性 を 向 上 さ せ る た め に ｢製 剤 表 面 に 正 電 荷 を 付 与 す る と と も に 、 腫 瘍 細 胞 に 対 す る 特 異 的 リ ガ ン ド を 修 飾 す る ｣こ と の3
点 を 掲 げ た 。 こ れ ら の コ ン セ プ ト の も と 、3
段 階 の プ ロ セ ス に て ナ ノ 粒 子 製 剤 の 調 製 を 試 み た （Fig. 3）。
Fig. 3 Preparation of nanoparticle formulation
調 製 プ ロ セ ス の 第
1
段 階 で は 、siRNA を 製 剤 コ ア 内 へ 充 填 す る た め に 、負 電 荷 を 有 す るsiRNA
と 負 電 荷 の ヒ ア ル ロ ン 酸 及 び 正 電 荷 の プ ロ タ ミ ン を 混 合 し 、 静 電 的 相 互 作 用 に よ り 負 電 荷 の 複 合 体 を 形 成 さ せ た 。第2
段 階 で は 、製 剤 コ ア で あ る 複 合 体 を 被 覆 保 護 し てsiRNA
の 生 体 内 安 定 性 を 向 上 さ せ る た め 、 負 電 荷 の 複 合 体 と カ チ オ ン 性 リ ポ ソ ー ム を 混 合 し 、複 合 体 を 被 覆 し た 構 造 体 を 形 成 さ せ た 。第3
段 階 で は 、腫 瘍 細 胞 に 過 剰 発 現 す る シ グ マ レ セ プ タ ー の 特 異 的 リ ガ ン ド で あ る ア ニ ス ア ミ ド を 表 面 に 修 飾 し てsiRNA
の 細 胞 膜 透 過 性 を 付 与 す る た め 、 被 覆 構 造 体 とDSPE-PEG-anisamide
を 混 合 し 、 相 転 移 に よ る 脂 質 二 重 膜 の 物 理 的 変 化 を 利 用 し て 最 終 の ナ ノ 粒 子 製 剤 を 調 製 す る こ と に 成 功 し た 。- 5 -
調 製 し た ナ ノ 粒 子 製 剤 の
B16F10
へ のsiRNA
送 達 効 率 をin vitro
に て 評 価 し た 。 ナ ノ 粒 子 製 剤 のsiRNA
送 達 効 率 は 、 ア ニ ス ア ミ ド で 表 面 修 飾 し て い な い コ ン ト ロ ー ル 製 剤 に 比 べ 有 意 に 高 く 、こ の こ と は ナ ノ 粒 子 製 剤 の 腫 瘍 細 胞 へ の 標 的 指 向 能 の 高 さ を 示 す も の で あ る （Fig. 4）。
Fig. 4 In vitro intracellular siRNA delivery of nanoparticle formulations in B16F10 cells
Nanoparticle formulations containing fluorescent-labeled siRNA (200 nM) were applied to B16F10 cells (1 ×105 cells) and then incubated at 37 oC for 4 h. After incubation, the intracellular fluorescent-labeled siRNA was determined. Each point represents the mean ± SD (n = 4). *p < 0.01.
3.
ナ ノ 粒 子 製 剤 を 用 い た 肺 投 与 型DDS
の 肺 が ん 治 療 に お け る 有 用 性前 項 に お い て 、siRNAの 腫 瘍 細 胞 へ の 標 的 指 向 能 に 優 れ た ナ ノ 粒 子 製 剤 を 設 計 ・ 調 製 す る こ と が で き た 。 本 項 で は 、 腫 瘍 増 殖 及 び 転 移 を 促 進 す る
VEGF
、c-Myc
及 びMDM2
を コ ー ド す る 遺 伝 子 を 標 的 と す る3
種 類 のsiRNA
（ 抗 腫 瘍siRNA
）を1:1:1の モ ル 比 で 混 合 封 入 し た ナ ノ 粒 子 製 剤 を 調 製 し 、そ の 抗 腫 瘍 効
果 を 評 価 し た 。抗 腫 瘍 効 果 の 評 価 に 先 立 ち 、 こ の ナ ノ 粒 子 製 剤 を
B16F10
に 適 用 し 、 そ れ ぞ れ の 腫 瘍 関 連 タ ン パ ク 質 の 発 現 に 及 ぼ す 影 響 を 免 疫 蛍 光 抗 体 法 に よ り 検 討 し た と こ ろ 、こ れ ら の タ ン パ ク 質 の 発 現 量 は 低 下 し た（Fig. 5）。こ の こ と は 、ナ
ノ 粒 子 製 剤 の 遺 伝 子 抑 制 効 果 を 示 す も の で あ る 。- 6 -
Fig. 5 In vitro oncogene silencing effect of nanoparticle formulations containing antitumor siRNA in B16F10 cells
Nanoparticle formulations containing antitumor siRNA (200 nM, VEGF/c-Myc/MDM2 = 1:1:1 molar ratio) were applied to B16F10 cells and then incubated at 37oC for 24 h. After incubation, VEGF, c-Myc, and MDM2 proteins were immunostained.
Green fluorescence indicates the localization of VEGF, c-Myc, and MDM2. Scale bar is 50 μm.
転 移 性 肺 が ん モ デ ル マ ウ ス に 上 記 の ナ ノ 粒 子 製 剤 を 肺 投 与 し 、抗 腫 瘍 効 果 を 評 価 し た 。 す な わ ち 、
B16F10
を マ ウ ス の 尾 静 脈 内 に 注 入 後 、6
、9
、12
、15
及 び18
日 目 に ナ ノ 粒 子 製 剤 を 肺 投 与 し 、そ の 後 の 生 存 率 を 算 出 し た（Fig. 6
）。ナ ノ 粒 子 製 剤 を 肺 投 与 し た 群 で は 、コ ン ト ロ ー ル 群 と 比 較 し て 生 存 期 間 が 有 意 に 延 長 し た 。一 方 、ナ ノ 粒 子 製 剤 を 静 脈 内 投 与 し て も 、生 存 期 間 の 延 長 は 認 め ら れ な か っ た 。こ れ ら の 結 果 か ら 、抗 腫 瘍siRNA封 入 ナ ノ 粒 子 製 剤 の 肺 投 与 は 肺
が ん 治 療 に 有 用 な 肺 投 与 型DDS
で あ る こ と が 示 さ れ た 。- 7 -
Fig. 6 Survival rate of mice with metastatic lung tumor following intrapulmonary and intravenous administration of nanoparticle formulations containing antitumor siRNA
Nanoparticle formulations containing antitumor siRNA (0.1 mg/kg, VEGF/c-Myc/MDM2 = 1:1:1 molar ratio) were administered intrapulmonarily or intravenously to mice on days 6, 9, 12, 15, and 18 after B16F10 injection. n = 10. *p < 0.01 as compared to control.
ま と め
本 研 究 で は 、 肺 が ん 治 療 を 指 向 し た 肺 投 与 型
DDS
の 構 築 を 目 的 と し 、 種 々 の 検 討 を 行 っ た 。 得 ら れ た 結 果 を 以 下 に 示 す 。・ 抗 腫 瘍 薬 の 肺 投 与 は 、 腫 瘍 部 位 へ の 薬 物 送 達 性 に 優 れ た 投 与 方 法 で あ っ た 。
・ 腫 瘍 細 胞 へ の 標 的 指 向 能 に 優 れ た
siRNA
封 入 ナ ノ 粒 子 製 剤 を 調 製 し た 。・ 抗 腫 瘍
siRNA
封 入 ナ ノ 粒 子 製 剤 の 肺 投 与 に よ り 、 転 移 性 肺 が ん モ デ ル マ ウ ス の 生 存 期 間 が 有 意 に 延 長 し た 。以 上 の 結 果 は 、 抗 腫 瘍
