バイオトロンで飼育したコガタアカイエカの
日本脳炎ウイルスによる実験的感染
七条明久・三舟求真人・林薫
長崎大学熱帯医学研究所ウイルス学部門（主任：林 薫 教授）
和田義人・小田力
長崎大学医学部医動物学教室（主任：和田義人教授）
大森南三郎
帝京大学医学部寄生虫学教室（主任：大森南三郎教授）
（Received for publication December9，1972）
Experimental Infection of Culex tritaeniorhynchus summorosus Mosquitoes Reared in Biotron with
Japanese Encephalitis Virus
Akehisa SHICHIJO, Kumato MIFUNE and Kaoru HAYASHI Department of Virology, Institute for Tropical Medicine,
Nagasaki University
(Director : Prof. Er. K. Hayashi)
Yoshito WADA and Tsutomu ODA Department of Medical Zoology, Nagasaki University School of Medicine
(Director :Prof. Cr. Y. Wada)
Nanzaburo OMORI
Department of Parasitology, Teikyo University School of Medicine
(Director : Prof. Dr. N. Omori) 長崎大学熱帯医学研究所業辟 第659号
Abstract
The laboratory colonized mosquitoes (NF strain) of Culex tritaeniorhynchus summorosuswere reared in indoor insectary biotron in which the astronomical day length, temperature and humidity were automatically regulated to change by daily cycle and change gradually by 5 days following the changes in the natural astrono- mical conditions from early August through the end of next May.
Adult female mosquitoes which emerged under various conditions were infected with Japanese encephalitis virus by allowing them to bite on 1 day old infected chickens or by feeding the mixture of rabbit blood and virus suspension and kept in controlled conditions of biotron continuously even after infection. At intervals after
infection, 4 to 10 mosquitoes were harvested and a half of them was used for assay of the infectivity of the virus. Another half was processed for the samples of
fluorescent antibody method and the distribution of viral antigen in mosquitoes was examined. The results obtained were as follows:
1. In preliminary experiment in which infected mosquitoes were kept in conventional incubators (defective of apparatus controlling the various natural conditions but able to keep constant temperatures), it was found that virus growth in infected mosquitoes was prolonged in time with lower temperatures, however, the virus replication still occurred even when the infected mosquitoes were kept at 15•Ž throughout the
experiment.
2. The virus in mosquitoes which emerged and infected under the environments of before the end of September began to replicate from 3rd or 5th day after infection and reached the maximum titer on 7th or 10th day. The fluorescent viral antigen observed at first in a part of posterior midgut cells and gradually developed to all over the midguts. When the virus infectivity titer reached the maximum, the fluorescent viral antigen was distributed to fatbody cells, salivary gland cells and thoracic ganglion cells.
3. The virus growth in mosquitoes which emerged and infected under the environ- ments of after the middle part of October was observed from 5th or 7th day after infection and the virus titer reached the maximum on 15th day. The virus titer in this case was constantly very much lower that of mosquitoes which emerged and infected in the conditions of before the end of September. The fluorescent viral antigen was observed only in the limitted part of posterior midgut cells throughout of experiment, however, after the environments in biotron were changed to those of March from January, the fluorescent viral antigen was observed to develop to the whole cells of midguts, fatbody cells, thoracic ganglion cells and salivary gland cells.
バイオトロンで飼育したコガタアカイエカv）日本脳炎ウイルスによる実験的感染 219
結 岩
日本脳炎ウイルス（以下目脂ウイルスまたは単にウ イルスという）による蚊の実験的感染は既にHURL−
BUT（195O），HALE et al．（1957），GRESSER et al，
（1958），LaMotte（196o，1963），MIFUNE（1965〕，奈 須等（1966），D。Iet al・（1967）及びMUANGMAN et al．（1972）等によって行われている．これら先 人の業績は（1）蚊体内のウイルス増殖に及ぼす外界 温度の影響をみたもの，（2）蚊体内のウイルス増殖の 様式とウイルス抗原の分布を検索したものと大別され る．このうち，LaMotte（1963）及びMIFUNE（1965）
は特に外気温の変化を考慮に入れて実験的感染蚊を種 々の環境温度で飼育し蚊体内のウイルスの存続を検査 し，次のような貴重な所見を得ている．即ち，蚊に一 旦，感染が成立すればウイルスは低温時でも，その感 染価に極端な低下をみないまま長期間に亘って蚊体内
（1）バイオトロン
バイオトロンは島津製作所製（特型バイオトロン）
を用いた・長崎地方の過去5年間の資料から，5日毎 の平均をとることによって1日の生物学的日長時間，
温度及び湿度の3時間毎の値を結ぶ変化曲線を定め，
これによって1日の気候環境とした・その環境を5日 間継続することで1プログラムとし，プログラムを連 続的に変えることで1年間の気候環境を再現した．
（2）ウイルス
当部門で1968年夏，野外で摘発したコガタアカイエ カから分離し日脳ウイルスと同定した MP3667−68 株のマウス脳内継代2〜3代目のものを使用した．
（3）コガタ7カイエカの日脳ウイルスの感染 教室で継代保存されているコガタアカイエカ（NF 系）の5o代ないし7o代目のものを実験に使用した．予 備実験には1O3・6LD5o／O．02mlのウイルス血症の 豚を吸血させて感染した・本実験には8月中旬から10 月上旬までの気候条件で羽化した蚊の場合，1O3・2 ま たは104．0LD50／0302mlのウイルス血症の感染ヒナ を吸血させ，また11月中旬の気候条件で羽化した蚊の 場合，2日間飢餓させた後，1o3・5または105．5LD5o
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に保たれることを明かにした．しかし，この種の実 験笹は，なおウイルスの生態学という観点から蚊の吸 血，産卵，羽化，越年など種々の生理的条件が考慮さ
れねばならない．
我々は蚊の羽化及び吸血時の環境尭件を考慮し出来 るだけ自然の状態に近い生理的条件の蚊でウイルスに よる実験的感染を行うことにした・先ず，長崎地方に おける最近5年間の気象を調査し，毎日の生物学的日 長時間，気温，湿度を5日毎に平均して作ったプログ ラムを用いて1年間の気候環境をバイオトロンで再現 した．このようなバイオトロンで種々の時期に孵化し 羽化したコガタアカイエカ雌成虫を用いてウイルスを 実験的に感染させ，蚊体内のウイルス増殖及びウイル ス抗原の分布を調べたのでその成績を詳述する．
した・蚊1個体当りの吸血量は蚊が満腹したときの吸 血量を0−o02mlとし，血液のウイルス量が1o3・6 LI）50／o・02mlとすると10216LD50／0．02mlと計算 出来る・
（4〕ウイルスの感染価の測定
蚊体内のウイルスの測定は感染蚊2〜5個体を1プ ールとし，0・75％牛血清アルブミン，加Or／mlスト レプトマイシン，2oOu／mlペニシリン加O．olM燐 酸緩衝食塩水pH7．2P）o．5mlまたは1mlで乳剤 とした・これを4℃で1O，OOOrPm15分3間遠心し，そ の上清を1腹8〜10匹の晴乳マウス脳内にO．O−2ml ずつ接種した・Reed andMuench（1938）の方法で LD5oを算定し，それから蚊1個体当りのウイルス量 LD50／mosq．を計算した．
（5）螢光抗体法
DoIet al．（1967）の方法に準じて行なった．即 ち，感染及び非感染蚊を卵白とアラビアゴムを等量混 合したものを媒体として包埋し，米国Lipshow社製
のクリオスタット（ModelNo・1200）で4ミクロン
の凍結切片を作った・ これをカバーグラス上で約5 分間アセトン前処理し直接法によって貸光染色した 複，鏡検した．抗体のFluoresceinisothiocyanate
（FITC）蛍光色素のラベルは川村（1967）の方法に よった，
実 験 村 料 と 実 験 方 法
バイオトロンで飼育したコガタアカイエカの目本脳炎ウイ′レスによる実験的感染 221
実 験 成 績
実 験 は
感染蚊の飼育温度とウイルス増殖との関係〔予備実 顔)
日脳ウイルスの抗体のない牒に103,OLDso/0.02ml のウイルスを5ml皮下接種し3日後に1Q3.6LU550ノ 0･02mlのウイルス血症のときコガタアカイエカ雌成 虫に吸血させた.吸血蚊を6群に分け30℃, 27℃, 24℃, 21℃, 18℃及び15oで通常の恒温室で飼育
した･ 1日, 3日, 5日, 7日, 10日及び14日目にそ れぞれ5個体ずつ取り出L,これを1プールとLて晴 乳マウス脳内接種法でウイルスの感染価を測定した.
その結果をまとめたものはFig.Iである‑ 30℃.27t 及び24℃での蚊体内のウイルス増殖ほほとんど類似 の様相を示L感染後6時間ないし12時間目のウイルス の感染旭〔図中には1日目の線上に記載Lた月よ最低
となり,以後急速に増加し3日目で大体最高値に達L ている･ 21℃でのウイルスの増殖ほ24℃よりおくれ,
1日臥102･oLDso/mosq,3日臥103.oLDso/
mosqとわずかに増殖を示L.7日目に10^.5LDso/
mosqの最高値に達Lた.18牀では3日臼102.OLD5G /mosq.151でほ101･oLD50/mosq･以下で,良 後ゆるやかに増殖し,18℃でほ7日目にIOo.OLDso /mosq.15℃でほ10日目に104･OLD50/mosq･の最 高値に達した･
Fig.1から明かなように感染後6‑12時間目のウ イルスの感染価ほ温度が低いほど高い値を示L､い る.これほvtl
itilL度が低くなるほど蚊体内での血液の消化 に時間を要し,かつウイルスほ血清で保s護されている ため生残ウイルスを表わLていることに注意Lなけれ ばならない.LかL,この実験成続から言えること は吸血感染雌成虫を15℃の低域こさらしても,18=C 以上の温度の場合の増殖速度より著Lくおくれるとは いえ,蚊体内のウイルスは増殖するという注目すべき 事実が明かにされたことである.
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Fig･ 1 Virus concentration of intected mosquitoes after incubation of various
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実 験 Ⅲ.
〔1〕バイオトロンの環境条件とコガタアカイエカ の羽化及びその吸血率
コガタアカイエカの肺化及び羽化の条件と蚊の吸血 率の成鰐は Tablelに示Lた.即ち, 8月上旬
〔Aug林 E･ 〔1〕〕から10月下旬(Oct. L. (1〕〕ま での気候環境で貯化したgroup lから group 9ま
では多少の発育期間のずれがあるにLても羽化L成虫 とな‑うたが, 11月上旬(Nov, E. 〔1〕〕以後の環境 で肺化Lたものほ遂に羽化をみるに至らなかった
(group 10. ll. 12)｡
goup 1‑6の雌成虫はいずれも吸血能があって感 染ヒナから30.6%ないし16林7%が吸血Lた･ Lかし group 7. 8及び9の雌成虫は吸血能がなく,従って
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バイオトロンで飼育したコガタアカイエカの日本脳炎ウイルスによる実験的感染 223
感染実験では2日間飢餓状態とした複，ウイルスを加 えた脱繊維家兎血液を綿に浸して吸血させた・ただ し，gr0up 4， 7及び8は感染実験を行わなかっ た・
（2）種々の気候条件で羽化L成虫となったコガタ アカイエカの実験的感染と蚊体内のウイルスの消長
バイオトロンで飼育したコガタアカイエカの各集団 のうち，蛍光抗体法だけで蚊体内のウイルス抗原を検 索した groupl及び蚊体内のウイルスの検索を行わ なかった group7を除いて感染蚊体内のウイルス増 殖の態度をまとめた成績はFig，2の過りである・
gr0up23 3及び5は感染ヒナから吸血後，3日目 にすでにウイルス増殖の立上りを認めul03・3〜1O4．5 LD50／m0Sq．を示した・ 7日目ないし10日目では 106・3LD50／mosq・の最高値に達し，その後ウイル ス感染価はゆるやかに低下するが，5o目ないし65日後 でも1｛〕3．9〜1o4・6LD50／mosq3 であった．これに 反しu group6及び9の場合，ウイルス増殖の立上 りは前3老に比しておそく，吸血感染摸7日ないし10 日で103，O〜1O3・3LD50／mosq．を示し，15日Rに 10432〜1o4・3 LD50／m0Sq．の最高値となった．そ して，その後のウイルス感染価はやや急速に低下の傾
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とによって蚊体内のウイルスは急激に増加し105．0 LD50／m0Sqを示すに至った．そしてバイオトロン内 の気候温度の上昇（平均気温15℃〜18℃）につれてウ イルス感染価は105・6〜106・3LD30／mosq− となり group 2u 3及び5の最高感染価と同程度と示すに至
った．しかし group9（Exp31）の場合，40日目で 1ol，ULD50／m0Sq．以下であったものが60日目に環境 温度を上昇させた後105・o LD5O／mosq．までウイル スの増殖をみた事実から，先ず次の2二頁について検討 する必要があると考えた・即ち，（1）飼育中，温度を 急激に上昇させなかった場合，101・O LD50／mosq3 以下のウイルス保有の状態が何時の気候条件まで続い たであろうか（2）吸血感染時のウイルス量を更らに 低くLた場合どのような経過をとるであろうか，この 2矧こついてgroup9と同じような条件で羽化した蚊 について実験的感染を反復した．その成績はFig．2 のgr0up9（Exp．23）に示したように，脱繊維家兎血 液中のウイルス量を103・3LD5O／0．02mlとし細に浸 して吸血させた場合，吸血直接に102・3LD50／mosq．
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Fig･ 2 Virus concentration in infected mosquitoes reared in various condition of biotron. Symbols 0. group2 ; ▲, group3 ; B, group5 ;
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であったが1日目には101・0LD5o／mosq．以下とな り30日間同じ状態であった．しかし，45日目に1o2・7 LD5o／mosq．となり46日目以後バイオトロンを3月 中旬（平均気温1O℃〜14℃）の気候環境にすると蚊体 内のウイルスは103・5LD50／mOSq．まで増加した・
以上の実験成績から，10月上旬以後の気候環境で羽 化した蚊（group6及び9）の体内ウイルスの増殖は 9月下旬以前の気候環境で羽化した蚊（gr0up2．3 及び5）のウイルス増殖より著しくおくれ，かつウイ ルス感染価も低い．この所見は通常の恒温室で温度を 変えて感染蚊を飼育した予備実験の成績とほとんど同 じである・ただ，group9の場合のように，J；イオ トロン内の環境温度を上昇すると蚊体内のウイルスは 急速に増殖することが新たに附加された所見である．
group 9 について反復して行った実験では蚊体内の ウイルスは長期間1Ol．0 LD50／mosq．以下に保た れ45日目にようやく102・7LD50ノmosq・を示した
が，これは感染ウイルス量ないし感染率が著しく低い ためにみられた成績であろうと考えられた・
（3）蛍光抗体法による蚊体内のウイルス抗原の検 索
groupl．2．3．5・6及び9について行った蚊体 内のウイルス抗原の分布と気温の推移及び grOupl を除き蚊体内のウイルス増殖とを対比してそれぞれ Fig・3，4．53 6．7及び8に示した・
先ずFig．3．4．5・及び6にみられる共通した所 見は次のようであった・即ち，（1）ウイルス増殖の立 上りと共に（吸血感染後3日目）後部中腸壁の1ケ所 ないし数ケ所に特異蛍光を認め，日数の経過と共に蛍 光は次第に中腹全壁に拡がった．（2）吸血感染後10日 ないし15日以後には唾液腺，脂肪組織，神経節及び卵 巣にも特異覧光を認めた・（3）唾液腺の特異螢光は50 日以後でも認めたが，中腹や脂肪組織の特異蛍光は認 められなくなる傾向を示した．
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Fig．6 Virus conCentrati0n and distributi0n of viralantigenininfected mosquitoes reared fr0m thelate part of SePtember to the middle part of December（group5）・Remarks：See Fig．3・
Fig・7及び8の場合，蚊体内のウイルス増殖の立 上りは吸血感染後7日目であったが，既に感染後4日 ないし5日目に後部中腸壁の1ケ所，あるいは2〜3 ケ所に特異蛍光を認めた． しかし，その後の経過で は中腸壁細胞に特異蛍光の拡がりを認めず60日でもな お中腸の一部に限局した蛍光をみるだけであった・そ して，特に唾液腺や脂肪織組及び神経組織までウイ ルス抗原の拡がりを認めることはなかった．Fig．8 の場合，60日目にバイオトロンを3月中旬の環境条件 とし，更らに連続的に4月及び5月の気候条件へと移 行させた．気温上昇後14日日（吸血感染後74日目）に 前部中腸壁に特異壁光を認め，それと共に蚊体内の ウイルス感染価も1O5・o LD50／mo5q．を示すように なった・気温上昇後23日目（吸血感染後83日目）には 脂肪組織や唾液腺にまで特異蛍光の拡がりを認めた・
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以上の所見から明かなように，吸血感染時の蚊が9 月中旬（Sept．M．（2））以前に羽化したものでは蚊 体内のウイルス増殖の立上りと平行して中腹後壁にウ イルス抗原を最も早く認め，唾液腺や脂肪組織にも蛍 光を認めるようになると蚊体内のウイルス増殖ははば 最高値に達することが判かった・また10月上旬（Oct．
E．（1））以後に羽化した蚊の場合，特にgroup9の 反復実験におけるように感染ウイルス量が低いと中腹 細胞内のウイルス感染の進行は長期間に亘って抑制さ れるが，group9 の初回及び反復の両案除から推察 されるように感染ウイルス畳または感染率の大小にか かわらず，ひとたび温度の上昇の機会があれば蚊体内 のウイルスの増殖は急速に開始されるものと考えられ る・
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Fig．7 Virus concentrati0n and distribution Of viralantigenininfectedmosquit0eSrearedfrOmthe middle part of October to the middle part0fJanuary（grO）up6）・Remarks：See Fig・3．
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Fig．8 Virus conCentration and distribution0f viralantigenininfected m0Squitoes reared from the middle part of November to the early part of May（group9，Exp．1）・Remarks：See Fig．3．
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考
LaMotte（1963）は CuleX quilDqZbq毎C血加3 1ol．4〜101．8LD50／m0Sq− を感染させ26．5℃で25 日間飼育した後，1o℃に25日及び47日間飼育しても 1ol．9〜104・7LD50／mosq．のウイルスを保有してい たという・また，CutexP桓言ensに1o3・6LD5o／o・03 mlのウイルスを含んだ血液を吸血させ26・5℃ で3 日間飼育し1o℃で61日間保つと1ol・5LD50／mosq．
以下でウイルスは検出出来ないが，26．5℃に1日飼 育すると5個体中3個体，5日間飼育では全個体から 104・0〜105−0LD50LD／m0Sq．のウイルスが検出さ れたと述べている・
MIFUNE（1965）は野外蚊から孵化，羽化したコガ タアカイエカを用い104．4または1o5．5LD5o／0・02 mlのウイルスを含んだ血液を吸引させ感染し，屋内 及び野外の自然気候下で飼育した・1964年10月27日か
ら翌年5月15日までj2ol日間に越年生残したコガタア カイエカは感受性豚にウイルス血症を起し得るという 事実を提示した．
我々は予備実験で15℃でも蚊体内のウイルスは増 殖するという事実を認め，次いで出来るだけ自然界に 近い環境条件で実験を行った・その結果，（1）9月中 旬以前の環境で羽化した蚊の場合，蚊体内のウイルス 増殖と平行してウイルス抗原の分布は中腸壁壊部の一 部から妖雲掛こ中腹全壁に，更らに脂肪組織，神経細 胞，唾液腺へと拡がり，（2）10月中旬以後の環境で羽 化した蚊の場合，蚊体内のウイルス増殖はおくれ，ウ イルス感染価も低く，かつウイルス抗原は中腸壁の一 部に局限して認められる・しかし，ひとたび気温が上 昇するとウイルス増殖は急速に行われ，ウイルス抗原 も脂肪組織，唾液腺へと及んで行く・以上の2つの感 染の様相が観察された・
上記の所見を，先ず蚊体内におけるウイルスの感染
括
長崎地方における最近5年間の毎日の気温，湿度，
日照時間を平均し，5日ごとのプログラムを作成し て，1年間の気候環境を再現したバイオトロンでコガ タアカイエカを飼育し，目脂ウイルスの実験的感染を 行った，実験成賃を要約すると次のようである．
（1）蚊体内におけるウイルスの増殖は環堵温度が低 くなるほど遅く，かつウイルス畳も低下するが，15℃
案
価と環境温度との関係だけの観点からみれば我々の今 回の実験は低温下でも蚊体内のウイルスは存続し得る という LaM0tte（1963）及び MIFtJNE（1965）の 実験成績の追認の域を出ない．しかし，出来るだけ自 然界に近い条件で特に8月中旬以後の種々の気候環境 下で孵化，羽化したコガタアカイエカの体内における ウイルスの増殖及びウイルス抗原の分布が自然界に近 い環境条件の推移によってどのような修飾をうけるか という観点からは上記の（1）及び（2）の所見は新たに重要 な意義を提示したものと考えることが出来る．
LaM0tte（196o）はウイルス感染後日を追って感 染蚊の腹部，胸部，頭部のウイルス感染価を検査し，
最も早く，かつ高いウイルス感染価は腹部にみられ，
次いで胸部，頭部の順であったという・I）oIet al．
（1967）は蛍光抗体法で感染蚊体内のウイルス抗原の 分布を検索し，感染初期は中温 脂肪組織に，後期に は唾液腺，胸部及び腹部に特異蛍光を認軌 腹部では 感染の日数が経つと共に蛍光が認められなくなること を述べている・LaMotte（1960）及び DoIet al．
（1967）の所見は我々の実験成績では（1）の場合に相当 して認められた・
MAUNGMANetal−（1972）はコガタアカイエカ及び CutexjiLsC0甲pha毎について2・6xl03・oPFU／o・3ml のウイルス血症にあるヒナを吸血させ25℃ないし27℃
での蚊体内のウイルス増殖を検査した・その際，最低 感染量を測定し8PFU／mosq− で感染が成立し10日以 内に1o5．0PFU／mosl，に達することを明かにした，
従って，本実験に使用した教室継代保存のコガタアカ イエカとは生態学的に違いがあるとも考えられる野外 蚊を使用し，MAUNGMAN et al．の成績を参照して 最低感染量を求めた後，今後の実験を進める必要があ るものと考える．
言
でもなお感染蚊体内のウイルスは増殖しウイルスが検 出される・
（2）8月上旬から10月上旬の気候環境下で羽化した 雌成虫は吸血能を有しているが，10月中旬以後11月中 旬までの気候条件では羽化しても吸血能がなく，11月 上旬に孵化したものは羽化しなかった．
（3）9月下旬以前の気候環境で吸血感染したものは
ノミイオトロンで飼育した丁∫ガツアカイエれ月日本職偵ウイルスG二。〕￣る一3‡謂如勺感染 229
蚊体内のウイルス増殖も3日ないし5Hで立上りを示 し7日ないし10日で最高に達した・琶光抗体法による ウイルス抗原も中腸後壁から次第に拡大し ウイル1 量が最高に達した頃には神経細胞や唾液腺内にもウイ ルス抗原が証明された．
（4）10月中旬以後の気候環境で吸血感染させたもの は蚊体内のウイルス増殖の立上りはおくれ5R日ない
文
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