緒言Dibutyryl cyclic AMP (DBcAMP)

培養肝癌細胞に及ぼす DIBUTYRYLCYCLIC AMP ^の影響

奈良県立医科大学病態検査学教室

悶 本 康 幸 ， 辻 井 啓 之 ， 中 野 博

奈良県立医科大学第 3 内科学教室

松 本 真 ， 中 山 雅 樹 ， 辻 井 正 EFFECT OF DIBUTYRYL CYCLIC AMP O N   THE 

GROWTH OF  CULTURED HEPATO お 1ACELLS 

YASUYUKI OKAMOTO ，  HIROYUKI TSUJII and HIROSHI NAKANO  De φa r 抑 制 t 0 /   C l i n i c o ‑ L α b o r a t o ヮ D i a g n o s t i c s ， N a r a  M e d i c a l  

MAKOTO MATSUMOTO ，  MASAKI NAKAYAMA and TADASU TSUJII  T h i r d  D ψ a r t m e n t   0 /   I n t e r n a l   M e d i c i n e ，  N  a r a   M e d i c a l  U n i v e r s i r y  

R e c e i v e d  J a n u a r y   9 ，  1 9 8 9   S

品 ω u 仰 7 仰 7

he 叩 p a t 加 omac 白 e l 肱 l l swere s t u d i e d  with r a t  M o r r i s  hepatoma c e l l s   (HT C )  and human hepatoma  c e l l s   (HepG

DBcAMP i n h i b i t e d   DNA s y n t h e s i s   i n   HTC w i t h o u t   c y t o t o x i c i t y .   DBcAMP a 1 s o   induced t y r o s i n e  a m i n o t r a n s f e r a s e   (T  AT) i n   HTC.  DBcAMP i n h i b i t e d  DNA  s y n t h e s i s   i n  HepG

ateach t i m e  p o i n t  d u r i n g  t h e  24h ・ c u l t u r e . DBcAMP d e l a y e d  t h e  p o p u 1 a t i o n   d o u b 1 i n g  t i m e  o f  HepG 2  and t h e   t i m e  a t  which t h e   p e r c e n t a g e  o f  t h e   c e l l s   w i t h   mi‑

t o s i s   r e a c h e d  a p e a k .  

These o b s e r v a t i o n s  s u g g e s t e d  thatDBcAMP h a s  an i n h i b i t o r y  e f f e c t   on t h e   growth  o f  hepatoma c e l 1 s  by e l o n g a t i n g  t h e  c e l l   c y c l e .  

Index T e r l l l s   d i b u t y r y 1  c y c l i c  AMP ，  c u l t u r e d  hepatoma c e l l s  

緒 言

D i b u t y r y l  c y c l i c  AMP (DBcAMP) は，最近，ショ ックの治療薬として臨床応用が可能となった薬剤である が

1，本剤の主要な薬理作用はすべて c y c l i cAMP の

a n a l o g としてのものであり， 当然，広範かっ多彩な作 用を有することが予測される.本剤は，また，以前より ある種の癌細胞に作用して増殖を抑制したり分化を誘導 することが知られておりわ阿久とくに，ヒトの悪性黒色 腫や神経芽細胞腫については比較的詳細に検討されてい るわめ，肝癌も，木剤の増殖抑制作用が期待されるもの

として，ラットやマウスの培養肝癌細胞を用いた検討は 多くみられているの ~15). しかも，最近，臨床的に本剤 を切除不能な肝癌患者に投与することにより h 今まで有 効な対策の乏しかった門脈腫場塞栓が消失したとする極 めて興味ある報告が出され

，われわれも同様の効果を 経験し得たことから

，本都の肝癌治療への応用が注目

される.

そこで今回，われわれは， ラット M o r r i s 肝癌細胞

HTCI 8 ) およびヒト肝癌細胞 HepG

に対する DBc

AMP の増殖抑制効果，機能変化の指標としての誘導酵

素への影響について検討をおこない，興味ある成僚を得

( 6 )  岡 本 康 幸 ( 他 5 名) たので報告する.

実 験 方 法 A . 細胞および試薬

Hepatoma t i s s u e   c u l t u r e  c e l l s  (HTC ，ラット M o r r i s 肝癌細胞 7 2 8 8c ) ，  newborn b o v i n e  s 巴 rum(NBS) ，  f i 巳 t a l b o v i n e  serum ( F B S ) ，非必須ア E ノ倣 (NEAA) ， E a g l e の minimume s s e n t i a l   medium (MEM) お よ び D u l ‑ b e c c oの MEM20) は ， Flow L a b o r a t o r i e s   I n c .   USA 

より購入した. [ 3 H ]   t h y m i d i n e .  (TdR) は ， [ 6

3 H ]t h チ midine (>15Cifmmol ，  NEN R e s e a r c h   l ' r o d u c t s ) を 月 J ¥，、た.その他の試薬は，半井化学薬品側より購入し，

ヒ卜肝脳細胞 HepG2 は，京都大学医学部第 2 内や

国 1 ' I I I 善弘博士より供与されたものを用いた.また， DBcAMP  は，第一製薬(附より供与された.

B.培養方法

HTC は ， 10% NBS と NEAA を含む E a g l e の M E M 中にて培養した. HTC は ， 2  X  1 0

c e l l s f m l に浮 遊し， 9 6 穴および 35mm 径の p l a s t i cd i s h に 5 0 ， 000 c e l l s f c m2 となるように播種し， 2 4 時間培養した後 DBc AMP を含んだ medium に交換し，実験に用いた.

HepG2 は， 10% FBS を含む Dulbecco の M E M 中 にて培養した. HepG2 は， 4  X  1 0

c e l l s f m l に浮遊し，

HTC の場合と同様の d i s h に ， 1 0 ， 0 0 0  c e l l s f c m2 となる ように播種し 3 日間培養した後 DBcAMP を含んだ medium  ~こ交換し，実験に用いた.培養条件は， 3 7 ' C   で ， 5  % CO2 および 95% 空気下で行った. なお DBc AMP は medium に終濃度 lmM となるよう添加し て用いた.

C .   DNA 合成能の測定

DNA 合成能は， DNA への TdR の取り込みによっ て測定した.

HTC では， 9 6 穴の d i s h で 2 0 時間培養し， さらに 4 時間 l μ c i f w e l l の TdR を加えて培養し，その後トリプ シン処:阻にて細胞を剥離し， 7 % の c o l dt r i c h r o l i c   a c i d   (TCA) を加え，酸不溶性部分を c e l lh a r v e s t e r を用い て g l a s s f i b e r 印刷、に吸着させ，そのよ七放射活性を液体 シンチレーションカウンターにて測定した. HepG2 で も同じように測定したが， TdR の投与法は次のように 変えた.すなわち，投与量は o . 1 μ c i f w e l l とし 2 4 時間を 6 分割した各 4 時間での取り込みを経時的に測定した.

また酸不溶性部分の DNA 量は S e t a r o と M o r l e y 2 1 ) の蛍光法により測定した.

D . 誘導酵素の組織化学的染色

HTC を 3 日間培養後， Dulbecco の p h o s h a t e ‑ b u f ‑

f e r e d   s a l i n e   (PBS) にて細胞を 3 回洗浄し， I~I 完投乾燥 固定した後，組織化学的に t y r o s i h e a m i n o t r a n s f e r a s e   (TAT) および r ‑ g l u t a m y l t r a n s p e p t i d a s e   ( r

GTP) を 染色した. TA T:は Thompson と Thomkins2 2) の方 法 ， r ‑GTP は Harada ら 3 2 ) の方法で染色した.判定に

l 然しては，全く染色されない場合を陰性，一様な染色像 を得られた場合を陽性とした.

E.細胞数および核の m i t o s i s を有する訓 1 1 胞の出現本 の算出

HepG2 を 35mm 径の d i s h で培養し， 2 4 日奇聞を 6 分割した各 2 4 時間で細胞を Giemsa 染色し，光顕的に d i s h の任意の辺縁から中心にむかつて細胞をし 0 0 0 個ず つ2 回観察し，核の m i t o s i s の出現率を求めた.細胞数 は，単層地養をトリプシンにて分散処 n f l した後，血球算 定盤にて測定した.

F . その他

培養終了時の細胞の v i a b i l i t y は ， トリバンプソレー染 色により光顕的に観察し，同医 l に培養前後の medium 中の l a c t a t edehydrogenase (LDH) 活性の差を遊離酵 素の l っとして測定した. データはすべて 6w e l l の平 均(土標準偏差)で表現し，有意差検定には S t u d e n t の t ‑ t e s t を用いた.

全土

ヨ

a

ロ : > 1 < :

A .   HTC の DNA 合成能に対する DBcAMP の影響 HTC の DNA に取り込まれた TdR の量は， C o n t r o l   で 2 9 0 . 2 1 土 2 2 . 0 7(dpmfng DNA ，以下同じ)， DBcAMP ImM 投与では 9 8 . 6 2 土 1 0 . 1 7 であった， DBcAMP 投与 によ

り有意な DNA 合成能の低下が認められた (p<

0 . 0 0 1 ) .  

また，培養終了時の細胞の v i a b i l i t y は ， C o n t r o l お よび DBcAMP 投与群で差はなく， mediu r P . r l : t の LPH 活性は， C o n t r o l で 2 6 土5( I U f l ，以下向じ)， DBcAMP  投与群で， 1 9 土 6 であり，有意差はなかった.

B .   HTC の誘導酵素に対する DBcAMP の影響 HTC  における TAT および r ‑GTP の組織化学的染 色像に対する DBcAMP の影響を検討した.その結果，

TAT は ， C o n t r o l では染色されなかったが， DBcAMP  投与により軽度の陽性像が得られ，本酸素の誘導が認め

られた.逆に， C o n t r o l で陽性で あった r ‑GTP の発現 は， DBcAMP 投与により抑制された.

C .   HepG2 の増殖に対する DBcAMP の影響 HepG2 の DNA への TdR の取り込みの投移を F i g . l に示した. ¥   、ずれの時点でも ， DBcAMP は TdR の取

り込みを抑制 j し ま た そ れ は DBcAMP が 100μM お

b h / / /  

C o n t r o l   1 0  

5 

一 E

¥ 心 守 口 一 ﹀ ︿ ) ﹂ ω E コ

c = ω U 2 0  

ーーームー‑一ー‑

1 2   1 6   2 0   2 4   H o u r s  a f t e r  t h e  b e g i n n i n g  o f   e x p e r i m e n t a l  c u l t u r e   F i g .  3 .   E f f e c t  o f  DBcAMP on change o f  c e l l  

number o f  HepG2 ・ C o n t r o l  

D 8 c A M P   1 0 0 μ M  

n u  

( d H Z O M C ¥ E 立 百

﹀ 切 E 工 判 亡 ︑ 月 間

4 z o

るように作用するものと考えられた.

また，細胞数の推移では， Fig.3に示すように，前値 4.25 土 2 .8  (x  1 04  c e l l s / m l ，以下同じ)に対して， C o n t r o l   では実験培養開始 1 6 時間後に 8 . 4 5 土 7.0とほぼ倍加した が ， DBcAMP投与では2 0 1 1 ，)閉まで噌加せず， 24 時間後 に8 .7 5 士7 . 1 となり，倍加する 11~:i点の遅延が認められた.

，  4  8  1 2   1 6   2 0   2 4   H o u r s  a f t e r  t h e  b e g i n n i n g  o f  e x P e r i m e n t a l  c u l t u r e   F i g .  1 .   E f f e c t   o f  DBcAMP on DNA  s y n t h e s i s   o f  

HepG2 ・

DNA  s y s t h e s i s  was dctermined i n  everyιh  i n t e r v a l   during t h e  c u l t u r e .  

HTC の増般に対する DBcAMP の影響については 諸家により報告されているが

，とくに vanWijk  らのは，高濃度 (1‑2mM) で、みられる増殖の抑制は非 特異的な毒性によるものとし， • Reuber H 3 5すなわち ラット肝癌細胞 H‑4 ・ E

E

C3 などでみられる特異的な 増殖抑制とは異なるとした.さらに Hargroveと Grar ^ト ner

は，培養に用いる血清中の酵素が DB cA M P か ら a d e n o s i n e 様毒性物質を生じることが増殖抑制の要 因であることを報告している. しかいわれわれの成績 て t 土，培養細胞から medium 中に遊離された酵素活性 や細胞の v i a b i l i t y の違いなどの毒性を示唆する所見は 得られなかった.ただし，今回の検討では DBcAMPの 投与則間は24 時間と短期であり，また細胞の増殖機能の うちでも DNAへの TdRの取り込みについてのみの 検討であるため，毒性があまり前回に出なかったのかも しれない.今後細胞密度や培養期間などの実験条件の変 化も合めた多角的な検討が必要であろう.

DBcAMP による TAT の誘導については Reuber H35においては認められているが2 4 )‑ 2 6 ) ，  HTCにおい てはその作用があるとする成績

とないとする成績

めが あり，一致した見解は得られていない.ただし，同じよ

うに TAT を誘導することの知られているステロイド ホルモンが HTC で本酵素を誘導することは報告され

察 考

1 2   1 6   2 0   2 4   H o u r s  a f t e r  t h e  b e g i n n i n g  o f  e x p e r i m e n t a l  c u l 土 u r e F i g .  2 .   E f f e c t  o f  DBcAMP on m i t o t i c  phase of 

HepG2  c e l l s .  

n U F h d  

( 次 ) E E H E

工ゼ﹀﹀旦一

ω O

半

0 0 田 町 村 亡 ω ピ ω 且

よび lmMの2 点でほぼ濃度依存性の作用を示した.

光顕的に認められる核の m i t o s i s像の出現の比率の推 移は， . F i g . 2に示すように， C o n t r o lでは実験培養開始 1 2 時間後に最大値 8.3%を示したが， DBcAMP投与で は1 6 時間後に最大値 7.5%を示した.なお，その他のi 時 点では，いずれも比率はほぼ 1‑2% にとどまっていた.

DBcAMP  投与は，核の m i t o s i s 出現の比率そのものの

低下に作用するよりは，むしろそのピーク時期を遅らせ

( 8 )  岡 本 康 幸 ( 他 5 名)

ている22).われわれの成績では vanRijn らの報告

と HepG

に対する DBcAMP の影響について検討をおこ 同様に，軽度の TAT 誘導を認めた. DBcAMP による ない，次の成績を得た.

TAT 誘導の機序についてはかなり研究されており， ① DBcAMP ( 1  mM) は ， HTC の DNA 合成能を gene の t r a n s c r i p t i o n および t r a n s 1 a t i o n の両方に作用 抑制したが，明らかな毒性は示さなかった.

しているものと考えられている

TAT は ， ラット肝 ②  DBcAMP は ， HTC に TAT 誘導作用を示した 細胞での検討などでは，静止期細胞に出現することが特 が，逆に HTC にみられる r ‑ ^GTP の発現を抑制した.

徴的であるが， r ‑ ^GTP は逆に増殖期細胞に出現するこ ③ DBcAMP は ， 2 4 時間経時的に測定した HepG

とを特徴としており

，腫場細胞の特性の 1 っとして霊 の DNA 合成能を，いずれの時点でも抑制した.

視される23). DBcAMP は，この r ‑ ^GTP の発現を抑制 ④  DBcAMP は ， HepG

の細胞数の倍化時期ぉょ する傾向を示した. これらの酵素に対する DBcAMP び m i t b s i s 期細胞数がピークとなる時期を遅延させた.

の態度は，特異的な誘導および誘導抑制というよりはむ ⑤  以上より， DBcAMP は，肝癌細胞の細胞周期に しろ細胞の増殖を抑制し，分化に導くことによる副次的 影響することにより，増殖の抑制に働く傾向が認められ

な現象のようにも思われる. た.

以上のようなラット肝癌細胞に対する DBcAMP の

作用からみて，ヒト肝癌細胞においでも類似した作用が 文 ^献

期待される. しかし， ヒト培養肝癌細胞について DBc 1 ) 吉武潤ー:日本臨休 3 8 : 1 9 1 4 ，  1 9 8 0 .  

AMP の影響を検討した報告は，われわれが検索し得た 2 ) 西川英郎

森本美典，岡野秀治，市川毅彦，藤田公 範囲では認められておらず，その詳細は明らかにされて 明 ， 小 寺 崇 ， 金 丸 正 泰 ， 中 野 魁 ， 竹 沢 英 郎 : 心

いない. 臓 1 6 :450 ，  1 9 8 4 .  

そこでまず今回，われわれは， HepG

を用いて 2 4 8 寺 3 ) 及川 淳:代謝 1 7 : 1 4 2 7 ，  1 9 8 0 .  

閉経時的に DBcAMP の増殖への影響を検討した. そ 4 )   Cho

Chung ， Y ふ ， Clair ，  T . ，  Bodwin ，  J ふ and の結果， DNA への TdR の取り込みはどの時点せも Berghoffer ，  B . :   S c i e n c e  2 1 4 :   77 ，  1 9 8 1 .  

DBcAMP により抑制を受け， また細胞の分裂期が遅延 5 )   Sher D1 an ，  M. L . ，   Shaf D1 an ，  T.D.  andKufe ，  する傾向が認められた. しかも， m i t o s i s のピーク時で D.W.: Biochem.  B i o p h y s .   R e s .   Commun.  1 3 4 :  

の比率そのものに対する明らかな抑制作用はみられなか 845 ，  1 9 8 6 .  

った.このことは， DBcAMP は，細胞周期の 1 部ある 6 )   Yoshida ，  H. ，  Azu D1 a ，  M. ，  Yanagawa ，  T . ， .Yura ，  いはすべての時期を延長させることにより増殖を抑制す Y. ，  Hayashi ，  Y. and Sato ，  M.: Canc 巴 r5 7 :   1 0 1 1 ，  るものであることを示唆しており，一般の抗癌剤のよう 1 9 8 6 .  

な t o x i c な作用の関与は少ないものと考えられる 7 )Prasad ，  K.N. and Kumar ，  S . :   Cancer 3 6 : ，  1 3 3 8 ，  以上の成績および本剤の性質から考えて， DBcAMP 1 9 7 5 .  

が培養肝癌細胞に示す作用の主体は，おそらく細胞内情 8 )   Giuffre ，  L . ，  Schreyer ，  M. ，  Mach ，  J . ‑ P .   and  報伝達機構や代謝系などを介したものであろうと推測さ Carrel ，  S . :   Cancer  6 1 :   1 1 3 2 ，  1 9 8 8 .  

れる.またそれは，細胞を分化に導く方向に作用してい 9 )   van Wijk ，  R . ，   Wicks ，  W.D. and Clay ，  K.: Can‑

る可能性が強い.今回われわれは， DBcAMP の長期投 c e r   R e s .   3 2 :   1 9 0 5 ，  1 9 7 2 .  

与による影響や形態学的な検討はおこなわなかづたが 1 0 ) Granner ，  D.K. ，  S e l l e r s ，  L . ，  Lee ，  A . ，  Butters ，  すでに他の培養癌細胞の中には， DBcAMP 投与により C. and Kutina ，  L . :   A r c h .  Biochem. B i o p h y s .  1 6 9 :   形態学的に分化を示すものも矢口られているめ

現時点 6 0 1 ，  1 9 7 5 .  

で、は，本薬剤を単独で癌治療に臨床応用できる可能性は 1 1 )   Bevers ，  M.M. ，  van Rijn ，  J .   and vanWijk ， R . :   少ないが，今後，他の薬剤 j との併用や投与方法の工夫な FEBS L e t t .   7 2 :   275 ，  1 9 7 6 .  

どによってユニーグなメカニズムをもっ抗癌剤の l っと 1 2 )   Ham D1 an ，  H.C. ，  S i D 1 pson ，  J . A .   and Ledford ，  してさらに積極的な臨床応用が可能となることが期待さ B.E.:Arch.  Biochem.  B i o p h y s .   2 0 4 :  277 ，  1 9 8 0 .   れる.

結 a 命

ラット Morris 肝癌細胞 HTC およびヒト肝癌細胞

1 3 )   Hargrove ，  J . L .   and  Granner ，  D.K.: J .   C e l l .   P h y s i o l .   1 1 1 :  232 ，  1 9 8 2 .  

1 4 )   Ha D1D1 an ，  H.C. and Ledford ，  B . E . :  A r c h .  B i o

chem.  B i o p h y s .   2 1 3 :  620 ，  1 9 8 2 .  

1 5 )   T o r i i ，  M. ，  Mi) 

7 5 :   1 0 8 3 ，  1 9 8 4 .   f f . ，  Miyata ，  K. and Enomoto ，  M.: Acta H i s t o ‑ 1 6 )石井公道，白崎敬こう杉本政直，松木茂樹，新井重 chem.  Cytochem.  9 :   1 6 8 ，  1 9 7 6 .  

紀，苅部ひとみ，圏分茂博，山田伸夫，柴田久雄 2 4 ) Snoek ，  G.T. ，  Voorma ，  f f . O .  and van Wijk ，  R . :   阿部治弥

草野正一，大部誠，奥平雅彦:日本医 B i o c h i m .   B i o p h y s .   Acta 6 5 5 :   1 0 7 ，  1 9 8 1 .   事新報 No.3339:3 1 ，  1 9 8 8 .   2 5 )   Snoek ，  G.T. ，  Voorma ，  H.O. a 吋 vanWijk ，  R . :   1 7 )松本真，岡本康幸，中野博，中山雅樹，辻井 E u r .   J .   B i o c h e 瓜 1 2 3 :2 1 7 ，  1 9 8 2 .  

正:肝臓 29(Supp l . ) :   2 5 5 ，  1 9 8 8 .   2 6 )   van W羽 k ， R. ，  Loesberg ，  L .  a 吋 Snoek ， G . T . :   1 8 )   Thompson ，  E . B . ，  Tomkins ，  G.M. and Curran ，  B i o c h i m i e  6 5 :   6 4 3 ，  1 9 8 3 .  

J . :   P r o c .  Nat l .   Acad. S c i .   USA 5 6 :   296 ，  1 9 5 9 .   2 7 )   van Rijn ，  H. ，  Bevers ，  M.M. ，  van Wijk ，  R. and  1 9 )   Knowles ，  B . B . ，  Howe ，  C . C .   an c ¥   Aden ，  D . P . :   Wicks ，  W.D.:  J .   C e l l .   B i o l .   6 0 :   1 8 1 ， 1 9 7 4 .  

S c i e n c e  2 0 9 :  497 ，  1 9 8 0 .   2 8 )   Butcher ，  F . R . ，  Becker ，  j . E .  and Potter ，  V . R . :   2 0 )   Dulbecco ，  R.  and  Freeman ，  G . :  V i r o l o g y   8 :   E x p .   Ce l 1   R e s .   6 6 :   3 2 1 ，  1 9 7 1 .  

3 9 6 ，  1 9 5 9 .   2 9 )   Noguchi ，  T . ，  Diesterhaft ，  M. and  Granner ，  2 1 )   Sataro ，  F .  and Morley ，  C . G . D . :  Ana l .   Biochem.  D.K.: Adv. C y c l i c  N u c l e o t i d e  R e s .  1 4 :   5 2 9 ，  1 9 8 1 .  

7 1 :   3 1 3 ，  1 9 7 6 .   3 0 )市原明:日本臨抹 4 4 :3 6 1 ，  1 9 8 6 .   2 2 )   Thompson ，  E . B .  and Tomki 耳 s ， G.M.:  J .   C 巴 1 1 . 3 1 )大林太:岐阜大医紀 3 3 :6 4 5 ，  1 9 8 5 .  

B i o l .   4 9 :   9 2 1 ，  1 9 7 1 .