Japanese Journal of Lactic Acid Bacteria
Copyright 0 2001, Japan Society for Lactic Acid Bacteria
総
説
乳 酸 菌 の ア ス パ ラ ギ ン酸 脱 炭 酸
樋 口
猛,内
田金 治,阿
部敬 悦
キ ッコー マ ン株 式 会 社研 究 本 部 〒278-0037千葉県野田市野田399 醤 油 乳 酸 菌 T e t r a g e n o c o c c u s h a l o p h i l u s の 一 部 の 菌 株 は 醤 油 諸 味 中 の ア ス パ ラ ギ ン 酸 を 脱 炭 酸 し , ア ラ ニ ンに変 換 す る。 この変 換 は醤 油 の 味 を マ イ ル ドにす る,醤 油 醸 造 に と って有 用 な反 応 で あ る。 ア ス パ ラ ギ ン酸 脱 炭 酸 を 引 き起 こ す 株(Asd+株)で あ るD10株 は,キ ュ ア リ ン グ処 理 に よ り,多 く の ア スパ ラギ ン酸 脱 炭 酸 を 引 き起 こさ な い株(Asp-株)を 生 じる。 この 株 の ア ス パ ラ ギ ン酸 脱 炭 酸 性 は22kb の プ ラ ス ミ ドpD1上 に コ ー ドされ て お り,ア スパ ラ ギ ン酸 輸 送 体 遺 伝子 と脱 炭 酸 酵 素 が オ ペ ロ ンを 形 成 し て いた。 D10株 の よ うなAsd+株 は,連 続 的 に工 業 使用 したい ところで あ るが,特 定 の乳酸 菌株 の連 続使 用 は,フ ァー ジ汚 染 を しば しば引 き起 こす 。 そ こでD10株 を親 株 と して フ ァー ジ抵抗 性 株 を 育種 した 。育 種 さ れ た変 異 株 は醤油諸味仕込試験 で良好 な性質 を示 した。 醤 油 乳 酸 菌 の ア スパ ラギ ン酸 脱 炭 酸 の生 理 的 意 義 は不 明 確 で あ るが,ア ス パ ラギ ン酸 脱 炭酸 を 引 き起 こ す 別 の 乳 酸 菌Lactobacillus subsp.M3株 で は,ア ス パ ラ ギ ン酸:ア ラ ニ ン の 対 向 輸 送 に 伴 い, proton-motive forceの 形 で エ ネ ル ギ ー 生 成 に 寄 与 して い る事 が 明 らか に な っ た 。 醤 油 乳 酸 菌 の ア ス パ ラ ギ ン酸 脱 炭 酸 で も同 様 の事 が 起 こ って い る事 が 予 想 され た 。 乳 酸 菌 の 中 に は,特 定 の ア ミノ酸 を 脱 炭 酸 す る もの が 見 られ る。 これ らの 菌 は多 くの 場 合,食 品 衛些 上,好 ま し くな い ア ミン類 を 生 成 す る汚 染 乳 酸菌 と して知 られ る。 た とえ ば,肉 製 品 を 腐 敗 させ る乳 酸 菌 や チ ー ズ の乳 酸 発 酵 中 の汚 染 乳 酸 菌 に よ る,ヒ ス チ ジ ンか ら ヒス タ ミンへ の 脱 炭 酸 や チ ロ シ ンか らチ ラ ミンへ の脱 炭 酸)な どで あ る。 これ に対 して,乳 酸 菌 の ア ミノ酸 脱 炭 酸 の 中 で も,醤 油 乳 酸 菌7窃 湿8飢ococo粥 勧Z(≧ρ観 粥 に よ る醤 油 諸 味 中 の ア スパ ラギ ン酸 の ア ラニ ンへ の脱 炭 酸 は,醤 抽 を よ りマ イ ル ドな もの に仕 上 げ る と い う意 味 で 産 業 上 重 要 な 反 応 で あ る%本 稿 で は醤 油 乳 酸 菌 を 中 心 に 乳 酸 菌 の ア スパ ラギ ン酸 脱 炭 酸 に関 す る研 究 にっ いて 紹 介 す る。 1.醤 油 乳 酸 菌 の ア スパ ラギ ン酸 脱炭 酸 とそ の 有 用 性 醤 油 は醸 造 工 程 にお いて,そ の主 発 酵 で あ る酵 母 発酵 に先 立 って醤 油 乳 酸菌Z加 ♂op観醐 に よ る乳 酸 発 酵 が 起 こ る。Z加Zρ ρ駕 麗 は,菌 株 ご と に 糖 発 酵 能,諸 味 還 元 性,有 機 酸 代 謝 性 が異 な る3)とい う代 謝 的 に み て 非 常 に多 様 な乳 酸 菌 で あ る。 こ の よ うな菌 株 ご とに異 な る 代謝 能 は醤 油 品 質 に微 妙 に影 響…す るが,そ の 中 で も特 に 醤 油 品質 に良 い影 響 を与 え る もの と して,ア スパ ラギ ン 酸 の脱 炭 酸 性 が 挙 げ られ る3)。 乳 酸 発 酵 前 の醤 油 諸 味 中 に は,主 と して 大 豆 タ ンパ ク 質 の分 解 に 由来 す る30-50mM程 度 の ア ス パ ラ ギ ン酸 を 含 む が,乳 酸 発 酵 後 に は諸 味 に よ って は ア スパ ラギ ン酸 を ほ とん ど含 まな い もの もあ る。 この よ うな醤 油諸 味 中 に は多 くの場 合,通 常 の諸 味 よ りア ラニ ンが多 い。 これ は,ア スパ ラギ ン酸 税 炭 酸 性 乳 酸 菌 株(Asd率 株)が, 醤 油 乳酸 菌 の主 要 フ ロー ラ と して生 育 した場合 に起 こる。 これ らのAsd+株 は,酸 味 の あ る酸 性 ア ミノ 酸 ア スパ ラギ ン酸 を脱 炭 酸 し,甘 み の あ る ア ラニ ンを生 成 す る た め,醤 油 を ま ろ や か にす る と い われ る。 ち ょ うど,ワ イ ンが マ ロ ラク テ ィ ック発 酵(ワ イ ン中 の リ ンゴ酸 が 乳酸 菌 に よ り脱 炭 酸 され て 乳酸 に な る発 酵)に よ って ま ろや か に な る の と類 似 した現 象 で あ る。 した が って ア スパ ラ ギ ン酸 脱 炭 酸 性 の醤 油 乳酸 菌 を醤 抽 醸 造 で 使 い こな す こ とは,醤 油 品 質 の 改善 お よ び そ の多 様 化 の 為 に有 用 で あ *To whom correspondence should beaddreissed.
Phonel十81-471-58-9123 Fax:十81-47L583124
Janpanese Journal of Lactic Acid Bacteria Vol.12, No.1 る 。 2.ア ス パ ラ ギ ン酸 分 解 性 プ ラ ス ミ ドpD14) 醤 油 乳 酸 菌 の ア ス パ ラ ギ ン酸 脱 炭 酸 性 の 遺 伝 的 背 景 は 明 か で は な か っ た 。 し か し な が らAsd+株 の 植 え 継 ぎ を 重 ね る こ と に よ り脱 炭 酸 性 を 欠 落 し た 株(Asd一 株)が 出 現 す る こ と や,ま た ひ と た びAsd一 株 に な っ た 株 は 再 び Asd+株 に は 戻 らな い こ と が 経 験 的 に知 ら れ て い た の で, プ ラ ス ミ ド上 に コ ー ドさ れ て い る 可 能 性 が 考 え ら れ て い た 。 そ こ で,キ ュ ア リ ン グ 剤 に よ り ア ス パ ラ ギ ン酸 脱 炭 酸 性 の 脱 落 頻 度 が 上 昇 す る か ど う か,代 表 的 なAsd+株 で あ る 皿 んα♂qρ観 粥D10株 に つ い て 実 験 を 行 っ た 。 そ の 結 果,キ ュ ア リ ン グ剤 無 添 加 区 で のAsd脱 落 率 が3% で あ っ た の に 対 し,キ ュ ア リ ン グ 剤 と し て10μg/mlの ethidiumbrolnideを 添 加 し た 時,46%と 高 頻 度 のAsd 脱 落 が 観 察 さ れ た 。 こ の 時 得 ら れ た,Asd一 株6株 と, 脱 落 し な か っ た 株Asd+株6株 に っ い て,そ の プ ラ ス ミ ド プ ロ フ ィ ー一ル を 調 べ た 。Asd+株 で は親 株 と 同 様 に3 本 の プ ラ ス ミ ドバ ン ドが 観 察 さ れ た の に 対 し て,Asd一 株 で は 一 番 大 き い プ ラ ス ミ ドバ ン ドが 脱 落 し て い た(図 1)。 こ の こ と か ら,こ の プ ラ ス ミ ド上 にAsd遺 伝 子 が コ ー ドさ れ て い る も の と 推 定 さ れ た 。 こ の プ ラ ス ミ ドを pD1と 名 付 け た 。 図1.ア ス パ ラ ギ ン酸 脱 炭 酸 菌 株D10株 の キ ュ ア リ ン グ 株 の プ ラ ス ミ ドプ ロ フ ィ ー ル プ ラ ス ミ ドpD1は2個 所 の8αZIサ イ トを 持 ち,約 10kbと12kbの フ ラ グ メ ン トが 得 ら れ た の で,pD1は 約 22kbの 大 き さ と推 定 さ れ た 。8αZI切 断 に よ る 小 さ い 方 の10Kbの フ ラ グ メ ン トの 塩 基 配 列 を 決 定 し た と こ ろ, こ の フ ラ グ メ ン トに は,少 な く と も2っ の オ ー プ ン リー デ ィ ン グ フ レ ー ム(ORF)が 含 ま れ そ い た 。 配 列 か ら 予 想 さ れ る遺 伝 子 配 列 の 模 式 図 を 図2に 示 した 。 遺 伝 子 は 次 の よ う に 並 ん で い た 。 図2.T.halophilusD10の プ ラ ス ミ ドpD1の10kb-Sall 断 片 に 含 ま れ る ア ス パ ラ ギ ン 酸 脱 炭 酸 関 連 遺 伝 子 オ ペ ロ ン の 推 定 構 造 P,プ ロ モ ー タ ー;S,Shine-Dargarno配 列;AspD, ア ス パ ラギ ン酸 デ カ ル ボ キ シ ラ ー ゼ 遺 伝 子;AspT,ア ス パ ラ ギ ン酸 輸 送 体 遺 伝 子
VoL12,No.1JapaneseJoumalofLacticAcidBacteria 1)プ ロ モ ー タ ー 様 配 列 2)一 っ 目 のSD配 列 3)最 初 のORF(AspD) 4)二 つ 目 のSD配 列 5)二 っ 目 のORF(AspT) 一 っ 目 のORF(AspD)よ り予 想 さ れ る ア ミ ノ 酸 配 列 に つ い て ホ モ ロ ジ ー 検 索 を 行 っ た と こ ろ,既 知 の ア ス パ ラ ギ ン酸 ア ミ ノ ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ と相 同 性 が み られ た。 ア ミ ノ 酸 ア ミ ノ トラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ と ア ミ ノ 酸 デ カ ル ボ キ シ ラ ー ゼ は ア ミ ノ 酸 配 列 上,非 常 に 近 縁 の 酵 素 で あ る と 考 え らて い る 紡こ と か らか らAspDは ア ス パ ラ ギ ン 酸 デ カ ル ボ キ シ ラ ー ゼ の 遺 伝 子 と 推 定 し た 。 一 方,二 っ 目 のORF(AspT)よ り 予 想 さ れ る タ ン パ ク 質 の ア ミ ノ 酸 配 列 は12個 のTransmembrane-spanningregionと 思 わ れ る 構 造 を 持 って い た 。 こ の 構 造 は 膜 に 存 在 す る輸 送 担 体 に し ば し ば み ら れ る6)。 従 っ て,AspTは 何 ら か の 輸 送 担 体 で あ る こ と が 予 想 さ れ た 。 以 上 を ま と め る と,こ れ ら の 遺 伝 子 はAspDが ア ス パ ラ ギ ン酸 デ カ ル ボ キ シ ラ ーゼ,AspTが ア ス パ ラ ギ ン 酸 キ ャ リア ー で,こ れ ら2つ の 構 造 遺 伝 子 がAspD上 流 の プ ロ モ ー一夕 一一か ら転 写 さ れ る1っ の オ ペ ロ ン を 形 成 して い る と予 想 さ れ た 。 AspD,Tを 含 むDNA断 片 を 大 腸 菌 に お い て, pTrC99Aを ベ ク タ ー と して,pTrCプ1ロ モ ー タ ー を 用 い て 発 現 さ せ た と こ ろ,ア ス パ ラ ギ ン酸 か ら ア ラ ニ ンへ の 変 換 が 観 察 さ れ た?)こ と か ら も,こ のAspD,Tが ア ス パ ラ ギ ン酸 脱 炭 酸 オ ペ ロ ンで あ る こ と が 支 持 さ れ た 。 な お,大 き い 方 の12kbの8α 召 フ ラ グ メ ン トか ら は 脱 炭 酸 酵 素 や 輸 送 体 タ ンパ ク 質 に 相 同 性 の あ る配 列 は 見 出 さ れ な か っ た7)。 な お,こ れ ら の 遺 伝 子 が ア ス パ ラ ギ ン酸 脱 炭 酸 遺 伝 子 群 で あ る こ と を 完 全 に 証 明 す る た め に は,こ れ らの 遺 伝 子 をZ肱Zop観 認 で 発 現 す る必 要 が あ ろ う か と 思 わ れ る が,7∴ んα♂opん吻sは 形 質 転 換 系 自 体 が 未 だ 報 告 が な い 。 今 後 の 研 究 が 待 た れ る と こ ろ で あ る。 醤 油 乳 酸 菌7加Zo勲 磁8に は こ れ ま でcripticな プ ラ ス ミ ド しか 見 出 さ れ て い な か っ た。 ま た,乳 酸 菌 の ア ミ ノ 酸 脱 炭 酸 能 が プ ラ ス ミ ド上 に コ ー ド さ れ て い る例 も これ ま で 報 告 さ れ て い な か っ た 。そ う し た 意 味 でpD1は 非 常 に興 味 深 い 性 質 を 持 っ た プ ラ ス ミ ドで あ る。 な お,D10株 に 限 ら ず,一 般 に 皿 加ZOP観 認 の ア ス パ ラ ギ ン酸 脱 炭 酸 性 は遺 伝 的 に 不 安 定 で,植 え 継 ぎ 時 に し ば しば 欠 損 す る こ と か ら,D10株 以 外 の 多 く の ア ス パ ラギ ン酸 脱 炭 酸 性 菌 株 で も,ア ス パ ラ ギ ン酸 脱 炭 酸 性 は プ ラ ス ミ ド上 に コ ー ド さ れ て い る こ と が 推 定 さ れ る 。 3.ア ス パ ラ ギ ン 酸 脱 炭 酸 性 株 τ カ∂10ρ〃1α3D10株 の フ ァー ジ抵 抗 性 菌株 の育 種 鋤 チー ズ の乳 酸 発 酵 で良 く知 られ るてい る こ とであ るが, 特 定 の乳 酸 菌 株 を連続 的 に使用 す る と,バ ク テ リオ フ ァー ジ汚 染 が しば しば発 生 す る§)。醤 油 乳 酸 菌Zん αZop観 粥 に もバ クテ リオ フ ァー ジの 存 在 が 報 告 され て お り,こ う した フ ァー ジに よ る醤 油諸 味 の汚 染 は,乳 酸 発酵 不 全 や, 添 加 乳 酸 菌 で は な い乳酸 菌 の 生 育 を も た らす1の。 ア スパ ラギ ン酸 脱 炭酸 性 株 は,醤 油 の 品 質 改 善 に有 用 な乳 酸 菌 で あ るが,工 業 レベ ル で 連 続 的 に優 先 フ ロ ー ラ と して醤 油諸 味 中 に生育 させ るた めに は,バ クテ リオフ ァー ジ対 策 が 必 要 で あ る。 そ こで アス パ ラギ ン酸 脱 炭 酸 性 株 Z加Jopん 吻8D10株 の フ ァー ジ抵 抗 性 菌 株 の 育 種 を 試 み た。 は じめ に,現 場 由来 の フ ァー ジ存 在 下 で,プ レー ト上 に生 育 した コ ロニ ー を フ ァー ジ抵 抗 性 株 と して分離 した。 しか しな が ら,こ の方 法 で 得 られ た抵 抗 株 の 中 に は選 択 の た め に使 用 した フ ァー ジ(も し くはそ の遺 伝 子)が 乳 酸 菌 と共 存 して い る株 が含 まれ て お り,一 部 の抵 抗 性 株 か らの フ ァー ジの放 出 が見 られ た。 この よ うな フ ァー ジ 共 存 株 は,諸 味 中 で 溶 菌 した り,フ ァ ー ジ を放 出 した り す る可 能 性 が あ り,実 用株 と して は不適 当 と考 え られ た。 そ こで,フ ァー ジや フ ァー ジ遺 伝 子 を含 ま ない フ ァー ジ抵 抗 性 株 を 選 択 す るた め に,供 試 株 と フ ァー ジを 直 接 接 触 させ な い レプ リカ法 に よ る フ ァー ジ抵 抗 性 株 育 種 を 試 み た。 親 株 丁 んαZ(∼ρん勧8D10をNTGに よ り変 異 処 理 した 後,1次 ス ク リー ニ ン グ と し て,NTG処 理 し た 菌 の コ ロ ニ ーを,あ らか じめ フ ァー ジ溶 菌 液 を塗 布 して お いた 選 択 プ レー トに レプ リカ し,そ こで塗 育 した コ ロニ ー に 対 応 す る株 を,元 の コ ロニ ー よ り選 抜 した 。 約150,000 コ ロ ニ ーか ら1500株 の フ ァー ジ抵 抗 性 候 補 株 を選 抜 した が,こ れ らの株 に は フ ァー ジ抵 抗 性 の無 い株 や弱 い株 増殖 その もの が 弱 い株 が 含 ま れて い た。 そ こで,2次 ス ク リー ニ ン グ と して候 補 株 を フ ァ ー ジ 存 在下 で生 育 させ た時 の増 殖 曲 線 を調 べ,フ ァー ジ共 存 下 の親 株 と同等 の増 殖 曲 線 を 示 す 株 を フ ァー ジ抵 抗 性 株 と して選 抜 した。 そ の結 果No.1とNo.4の2株 が 選 抜 さ れ た。こ れ ら の 株 の増 殖 曲線 を図3に 示 した 。両 株 と も フ ァ ー ジ存 在 下 で も親 株 と同等 の生 育 を示 した 。 ま た ア スパ ラ ギ ン酸 脱 炭 酸 能 を確 認 したが 両 株 と も親 株 と同 様 の ア スパ ラ ギ ン 酸 脱 炭 酸 能 を有 して い た。 そ こで,両 株 を用 いて 実 際 に醤 油 諸 味 の 小 仕 込 み 試 験 を行 った。105PFU/エnlの フ ァー ジ共 存下 で も両 株 と も フ ァー ジ非 存 在 下 で の 親株 と 同 等 の 菌 数 増 加 とpH低 下 を示 した(図4)。 この 時 点 で諸 味 の 香 りを 官 能 的 に調 べ た と ころ,フ ァー ジ抵抗 性 変異 株 に よ る諸 味 は親 株 に よ
JapaneseJoumalofLacticAcidBacteriaVol.12,No。1 図3.φD-10共 存 下 で の フ ァ ー ジ 抵 抗 性 菌 株 の 成 長 曲 線 乳 酸 菌 は 約10℃FU/ml,フ ァ ー ジ は 約106PFU/m1で 接 種 し た 。 菌 の 生 育 は ○.D.600nmで 測 定 した 。 Symbols:○,DlO(親 株);△,No,1株; 口,No.4株;●,D10,フ ァ ー ジ 無 添 加 図4.フ ァー ジ抵 抗 性 菌 株 の 醤 油 諸 味 仕 込 試 験 にお け る 乳 酸 菌 の 生 育 と諸 味pH変 化 乳 酸 菌 は約10SCFU/m1,フ ァ ー ジ は約10SPFU/m1 で接 種 した。 Symbols:○,D10(親 株);△,No.1株; 口,No.4株;●,D10,フ ァ ー ジ無 添 加; 実 線,pH;破 線,乳 酸 菌 数 る もの と同等 で あ った 。 さ らに諸 味 の主 発酵(酵 母 発酵) 終了 後 あ る い は仕 込 み 後6ケ 月 の熟 成 諸 味 に お い て も, 親 株添 加 区 と フ ァー ジ抵 抗 性 変 異 株 添 加 区 との 問 で官 能 的 な違 い は 見 られ な か った 。ま た,変 異 株 を添 加 し た 諸 味 で も親 株 を添 加 した諸 味 同様,諸 味 中 の ア スパ ラギ ン 酸 は ほ ぼ消失 し,そ れ に相 当 す る モ ル数 の ア ラ ニ ンの増 加 が 見 られ た。 以 上 の 結果 よ り,フ ァー ジ抵 抗 性 変 異 株No.1,No,4 は醤 油 醸 造 に使 用 し うる,優 良 な ア スパ ラギ ン酸 脱 炭 酸 菌 株 で あ る と思 わ れ た。 な お,フ ァー ジ抵 抗 性 株 の多 くは細 胞 表 層 構 造 の 変 異 に よ り フ ァー ジが吸 着 で き な くな った変 異 株 で あ る こ と が 知 られ て い る11)が,No.1,4株 に 関 して は フ ァ ー ジ吸 着 能 の 低下 は観 察 され てお らず,フ ァー ジ吸 着後 の フ ァー ジ増 殖 過 程 の ど こか が阻 害 さ れて い る と考 え られ た 。 4.乳 酸 菌 の ア スパ ラ ギ ン酸 脱 炭 酸 に伴 う エ ネ ル ギ ー 獲 得12) と こ ろで,醤 油 乳 酸 菌 に と って ア スパ ラギ ン酸 を脱 炭 酸 して ア ラニ ンにす る こ と は,ど の よ う な意 味 が あ るの だ ろ うか? ワイ ン乳 酸 菌 の マ ロ ラ ク テ ィ ック発 酵 は リ ン ゴ酸 か ら 乳酸 へ の脱 炭 酸 反 亦 で あ る。 マ ロ ラ ク テ ィ ック発 酵 乳 酸 菌 の一 種 で あ る 五α砿oわαo認粥p♂ α舵 αr配肌 の マ ロ ラ ク テ ィ ッ ク発 酵 に お い て は,脱 炭 酸 に伴 い,細 胞 内ATP が増 加 す る こ とが 観 察 され た'3)。 我 々 は,醤 油 乳 酸 菌 で も同 様 の こ とが観 察 で き る ので はな い か と考 え,Asd+株 飢 肱Zopん`♂粥D10株 の飢 餓 菌 体 に ア スパ ラギ ン酸 を与 え,細 胞 内ATPの 変 化 を 測 定 した が,は っき り し た変 化 は と らえ られ なか っ た。 し か しな が ら,皿 んαZopん蜘8の ア ス パ ラ ギ ン酸 脱 炭 酸 活 性 は微 弱 な た め,ATP濃 度 変 化 と して捕 らえ られ な か っ た可 能 性 が考 え られ た 。 そ こで,よ り強 い ア スパ ラ ギ ン 酸 脱 炭 酸 活 性 を有 す る乳 酸 菌 にっ いて 同様 の実 験 を 行 っ た。 減 塩 した醤 油 や 醤 油 を ベ ー ス に した調 味料 は,乳 酸 菌 汚 染 に よ り発 泡 事 故 を起 こす こ とが あ る14)。こ れ らの 乳 酸 菌 は,醤 油 中 の ア スパ ラギ ン酸 も し く は グル タ ミン酸 を脱 炭 酸 す る こと に よ り,CO2を 発 生 させ て 発 泡 を 引 き 起 こす。 醤 油 諸 味 の ア スパ ラギ ン酸 を数 週 間 か けて 脱 炭 酸 す る醤 油 乳 酸 菌 に比 較 して,数 日で ガ ラ ス瓶 を破 裂 さ せ る ほ ど強 烈 な発 泡 を 引 き起 こす これ らの汚 染乳 酸菌 は, 格段 に強 い ア スパ ラ ギ ン酸 脱 炭酸 活性 を持 っ と推定 され る。 そ こで,こ の よ うな ア スパ ラギ ン酸 脱 炭酸 菌 の一 種 で あ る 五αo如6αc`ZZ認sp.M3株 で実 験 を行 った。 M3株 の菌 懸 濁液 を,飢 餓 状 態 に お い た 後,ア ス パ ラ ギ ン酸 を 与 え た と こ ろ,表1に 示 す よ う に,細 胞 内 ATP濃 度 の上 昇 が 観 察 され た。 この エ ネ ル ギ ー生 成 は 脱 共 役 剤carbonylcya捻ide一 隅一chlorophenylhydrazone (CCCP)や,細 胞 内外 のpH差 消 去 剤 バ リノ マ イ シ ン と 膜電 位 消去 剤 ナ イ ジェ ラ イ シ ンの同 時 添加 に よ り阻 害 さ
VoL12,No.1JapaneseJournalofLacticAcidBacteria 表1.Lactobacillussubsp.M3株 の ア ス パ ラ ギ ン 酸 脱 炭 酸 に 伴 うATP 生 成 と 各 種 薬 剤 の 影 響 *dicyclohexylcarbodiimide **carbonyl cyanide-m-chlorophenylhydrazone れ た 。 こ の 時,ア ス パ ラ ギ ン酸 脱 炭 酸 反 応 そ の も の は 阻 害 さ れ て い な か っ た こ と か ら,こ のATP生 成 に は proton-motiveforceが 関 与 し て い る と考 え ら れ た 。 こ の よ う なproton-motiveforce関 与 の エ ネ ル ギ ー 生 成 機 構 と し て,Anan七haramら に よ っ て 発 見 さ れ た, 電 気 的 に 不 等 価 な 交 換 輸 送 に よ るproton-motiveforce の 発 生 が 考 え ら れ る紛 。 彼 ら は0κ α励 αoオor ∫orz痂9εηθ8が シ ュ ウ酸 を 蟻 酸 に 脱 炭 酸 す る 時 に,電 気 的 に 不 等 価 な 交 換 輸 送 に よ り エ ネ ル ギ ー が 発 生 す る こ と を 示 し た 。 同 様 の こ と が 五αcオoろαo`ZJ粥sp.M3株 で も 起 こ っ て い る こ と を 確 認 す る た め に,M3株 の 膜 タ ン パ ク 質 を 抽 出 し,プ ロ テ オ リポ ソ ー ム に 再 構 成 し て,こ の 株 の ア ス パ ラ ギ ン酸 輸 送 の 性 質 を 調 べ た ◎ あ らか じめ ア ラ ニ ン を ロ ー ド して お い た プ ロ テ オ リ ポ ソ ー ム は ア ス パ ラ ギ ン酸 を 能 動 的 に 取 込 ん だ 。 プ ロ テ オ リポ ソ ー ム の 外 測 が 負 に な る よ う に 膜 電 位 を か け る と こ の 取 込 み は促 進 さ れ,外 側 を 正 に 膜 電 位 を か け る と抑 制 さ れ た 。 こ の こ とか ら,ア ス パ ラ ギ ン酸 の 輸 送 が ア ス パ ラ ギ ン酸 の 脱 炭 酸 生 成 物 で あ る ア ラ ニ ン と の 交 換 輸 送 で あ る こ と,ま た,こ の 交 換 輸 送 に よ り 電 荷 が 発 生 す る こ と,す な わ ち こ の 交 換 輸 送 が 電 気 的 に 不 等 価 で あ る こ と が 示 さ れ た 。 電 気 的 に不 等 価 な 交 換 輸 送 が 起 こ れ ば,膜 電 位 を 発 生 す る の で,結 果 的 に こ の 輸 送 系 は pro七〇n-motiveforceを 生 み 出 して い る こ と に な る 。 さ ら に 脱 炭 酸 反 癒 に よ り水 素 イ オ ンが ア ラ ニ ン分 子 に 固 定 さ れ る こ と に よ つ て も膜 内 外 にpH差 が 発 生 し,こ こ で もproton-motiveforceが 発 生 す る。 こ う した こ とか ら, 下 記 の よ う な 機 構 で ア ス パ ラ ギ ン酸 脱 炭 酸 に 伴 うATP 生 成 が 起 こ っ て い る こ とが 推 定 さ れ た(図5)。 1.ア ス パ ラ ギ ン酸 と ア ラ ニ ン の1:1対 向 輸 送 に よ り 細 胞 の 外 側 が 正 に 荷 電 す る よ う な 膜 内 外 の 電 位 差 (△ Ψ)が 生 じ る 。 2.細 胞 質 内 で の ア ズ パ ラ ギ ン酸 脱 炭 酸 に よ り ア ス パ ラ ギ ン酸 の α一carboxy1基 が 脱 炭 酸 さ れ,そ の 部 位 に 細 胞 質 の プ ロ トンが 入 る こ とで,細 胞 質 中 の プ ロ ト ンが 消 費 され,細 胞 内 が ア ル カ リ性 に な る よ う な 膜 内 外 のpH差(△pH)が 生 じる。 3.1,2で 生 じた プ ロ トン駆 動 力(△p)がFIF。-ATPase に よ りATP合 成 に利 用 され る。 4.diffusionに よ り細 胞 内 のcO,は 細 胞 外 に 出 て ゆ く。 この反 応 に お い て,ア スパ ラギ ン酸 の取 込 み エ ネルギ ー は反 応 生 成 物 の ア ラニ ンの細 胞 内外 の濃 度 差 で あ り,ア ラニ ンの放 出 に伴 い,反 応 基 質 で あ る ア スパ ラギ ン酸 は ます ます 細 胞 内 に供 給 され る。 しか も,反 応 に伴 い細 胞 内 外 の電 位差 と水 素 イ オ ン濃 度 差 が 蓄 積 し,ATP生 成 に使 わ れ る と い う,非 常 に効 率 の良 い シ ス テ ムで あ る。 減 塩醤 油 を 発泡 させ る乳 酸 菌 に は,M3株 に代 表 さ れ る ア スパ ラギ ン酸 脱 炭 酸 菌 の ほか に,グ ル タ ミン酸 を γ一 ア ミノ酪 酸(GABA)に 脱 炭 酸 す る乳 酸 菌 が知 られ て い る1の。 この グ ル タ ミ ン酸 脱 炭 酸 乳 酸 菌 で あ るLαo加 δ仏 c沼 酪sp.E1株 に関 して も,グ ル タ ミ ン酸 の 投 与 に よ り 菌 体 内ATP濃 度 が上 昇 す る こ と,こ のATP生 成 が イ オ ノ フ ォ ア に よ り阻 害 さ れ る こ と,外 部 に 高 濃 度 の GABAが 存 在 す る とATP生 成 が起 こ らな い こと か ら, ア スパ ラギ ン酸 脱 炭 酸 菌 と 同様 の機 構 で のATP生 成 が 推 定 され た16)。 先 に述 べ た よ う に,7加Zop瀦 粥D10株 に ア スパ ラ ギ ン酸 を 与 え て もATP生 成 は観 察 さ れ な か った が,ア スパ ラギ ン酸 脱 炭 酸 プ ラ ス ミ ドpD1の ア スパ ラギ ン酸 脱 炭 酸 を コ ー ドす る遺 伝 子 断 片 を,大 腸 菌 で発 現 させ て ア スパ ラギ ン酸 脱 炭 酸 を 行 わ せ た 時 に,細 胞 内ATP濃 度 の 上昇 が見 られ だ)。 す な わ ち,脱 炭 酸 に 共 役 し て何 ら か の エネ ル ギ ー生 成 は起 こ って い る こ とか ら,醤 油 乳 酸 菌 皿 んψ ρん翻8の ア スパ ラ ギ ン酸 脱 炭酸 に お い て も, Lαc孟oろ傭 〃認sp.M3株 の 場 合 と 同 様 の エ ネ ル ギ ー生 成 が起 こ って い る可 能 性 が高 い と考 え られ た。 5.ア スパ ラ ギ ン酸 脱 炭 酸 菌 利 用 技 術 の 将 来 の 展望
JapaneseJournalofLacticAcidBacteriaVol .12,No。1 図5.ア ス パ ラ ギ ン 酸 脱 炭 酸 に 伴 うATP生 成 モ デ ル ア ス パ ラ ギ ン 酸 はan七ipOrter(AspT)に よ り 細 胞 内 の ア ラ ニ ン と 交 換 輸 送 さ れ る 。 こ の electrogenicなantiportに よ り △ ψが 生 成 す る 。 細 胞 内 に取 込 ま れ た ア ス パ ラ ギ ン 酸 は 脱 炭 酸 さ れ て ア ラ ニ ン とCO・ を生 成 し、 こ の 時H"を 消 費 し て 細 胞 内 を ア ル カ リ化 して △pHが 発 生 す る 。 △ ψ と △pHはEF。-ATPaseに よ るATP生 成 に 利 用 さ れ る。 ア スパ ラギ ン酸 脱 炭 酸 性乳 酸 菌 株 の添 加 は,ま ろや か な 醤 油 を製 造 す るた め に有効 な手 段 で あ るが,醤 油醸 造 が 開 放 系 で あ るた め,フ ァー ジ汚 染 や野 生 乳 酸 菌 との競 合等 の た め,こ れ ま で は完 全 に添 加 菌 を コ ン トロー ルす るの は困難 で あ った◇ しか しなが ら,フ ァー ジ抵 抗 牲 株 育 種 に よ り フ ァー ジ汚 染 を防 ぐこ とが で き た。 こ こで 示 した フ ァー ジ抵 抗 性 株 育 種 の技 術 は,他 の 菌 株 に も芯 用 可 能 で あ ろ う。 ま た多 くの乳 酸 菌 で プ ラ ス ミ ドの 接 合 伝 達 が 観 察 され て い る こ とか ら,ア スパ ラギ ン酸 脱 炭 酸 を コー ドす る プ ラ ス ミ ドが 明 らか にな った こ とで,接 合 伝 達 や形 質転 換 よ り,増 殖 力 の 強 い菌 株 に ア ス パ ラギ ン酸 脱 炭 酸 性 を付 与 で き る可 能 性 も出 て きた。 ま た,こ の遺 伝 子 を ク ロ モ ゾー ム に組 み込 む こと に よ り,ア スパ ラギ ン酸 脱 炭 酸 性 の遺 伝 的不 安 定 性 も解 消 さ れ る こ とが 期 待 さ れ る。 さ らに,ア スパ ラギ ン酸 脱 炭 酸 に よ り エ ネ ル ギ ーが 生 成 して い る と考 え られ る の で,脱 炭 酸 活 性 を 上 げ る こ と で,菌 のATP生 成 力 を 増 強 し,野 生 乳 酸 菌 と の 競 合 に 有 利 な株 を 造 成 す る こ と も出来 る可 能 性 が あ る。 そ うな れ ば従 来,優 れ た 性 質 を 持 ち なが ら,増 殖 速 度 が遅 い た め,実 用 株 と して使 用 で きな か った よ うな菌 株 の増 殖 力 を 強 化 す る こ と も出来 る と期 待 され る。 この技 術 は,醤 油 醸造 以 外 の醸 造 や発 酵 に も応 用 可 能 な ので は な いか と 思 わ れ る。 文 献
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Aspartate
decarboxylation
of lactic
acid
bacteria
Takeshi HIGUCHI, Kinji UCHIDA, and Keietsu ABE
Research and development Division, Kikkoman Corporation,
399 Noda, Noda City, Chiba 278-0037, Japan
Aspartate in soy sauce morormi was sometimes decarboxylated into alanine by the strains of
soy sauce lactic acid bacteria, Tetragenococcus halophilus. Because this amino acid conversion
makes taste of soy sauce milder, aspartate decarboxylating strain (Asd+ strain) of T. halophilus is important strains in soy sauce manufacturing.
T. halophilus D10 is an Asd+ strain. Curing treatment of this strain generated derivative
strains that could not cause aspartate decarboxylation (Asd- strains). This trait was coded on
a 22kb plasmid named pD1. On this plasmid aspartate transporter and aspartate decarboxylase
genes formed operon.
Continuous usage of a single strain of lactic acid bacteria in large scale industrial
manufacturing cause bacteriophage infection, so phage insensitive strain of D10 strain was
prepared to use this Asd+ strain in the factory without phage infection.
Physiological reason of aspartate decarboxylation of T. halophilus is not clear yet. However,
another lactic acid bacteria which cause aspartate decarboxylation, Lactobacillus sp. M3, derive
energy as proton-motive force coupled with the decarboxylation. It is assumed that energy
production by similar mechanism occurred in Asd+ strain of T. halophilus.
