特長
既存のアフィニティータグとの比較表 PA tag System
TARGET tag System
1 1 2 3 タンパク質精製 ウエスタンブロット 免疫細胞化学染色 フローサイトメトリー 6 9 10 11
新規アフィニティータグ
目次
アフィニティータグシステムは、ペプチドタグとそれに対する抗体を用いて目的タンパク質を検出する技術です。 既に実用化されているアフィニティータグとしてDYKDDDDK、 6×His、c-Myc、HA、V5等が知られていますが、特異性、親和性、アプリ ケーションそしてランニングコストといった点でそれぞれに長所と短所があるため、実験に応じて使い分ける必要がありました。 PA tagおよびTARGET tagは、これらいずれの点においても非常に高い性能を持つ、日本発の新規アフィニティータグシステムです。 PA tagまたはTARGET tagを導入することで、タンパク質精製、免疫細胞化学染色、フローサイトメトリー、ELISAといった様々な実験で の使用が可能です。さらに、PA tagおよびTARGET tagは、中性条件下 (pH6.0～8.0) でタグペプチドと抗体を解離できるというユニークな特長を持ってお り、タンパク質精製実験におけるランニングコストの低減も可能です。
本書では、PA tagおよびTARGET tagの特長と、各種実験における使用方法、ポイントについて紹介します。
専用website
http://www.wako-tag.jp
P A タグ ・ T A R G E T タグの特長
PA tag ・ TARGET tagの概要
高い特異性
抗PA tag抗体、抗TARGET tag抗体 は高い特異性で抗原ペプチドに結合し ます。PA tag・TARGET tagの使用によ り従来のタグよりも目的タンパク質の精 製純度、検出特異性を向上することがで きます。 低いランニングコスト 動物細胞を用いてタンパク質を精製する場合、タンパク質回収のランニングコストが大きな問題となります。 His tag融合タンパク質をニッケルカラム等で精製する場合、ランニングコストは低減できますが、培養上清など血清存在下では、精製量、純 度が著しく低下します。
抗PA tag抗体と抗TARGET tag抗体は中性条件下で抗体ビーズを再生できるため (40回～60回)、ランニングコストを低く抑えることができます。
アフィニティータグ PA TARGET 6xHis FLAG c-Myc HA GST
配列 GVAMPGAEDDVV (YPGQ)₅V HHHHHH DYKDDDDK EQKLISEEDL YPYDVPDYA
-残基数 12 21 6 8 10 9 218
分子量(kDa) 1.16 2.34 0.84 1.01 1.20 1.10 26 等電点（pI） 3.49 5.52 7.21 3.97 4.00 3.56
-リガンド 抗PA tag抗体 抗TARGET tag抗体 Ni, Co, Zn, Cu抗His tag抗体 抗FLAG tag抗体 抗c-Myc tag抗体 抗HA tag抗体 抗GST tag抗体Glutathione レジン（抗体結合ビーズ） 再利用法 3M MgCl₂, MES （pH6.0） 40% Propylene glycol , 1×TBS （pH7.5） 0.5M Imididazole （pH7.4） Tris-HCl, Glycine Buffer （pH2～3.5） Tris-HCl, Glycine Buffer （pH2～3.5） Tris-HCl, Glycine Buffer （pH2～3.5） Glutathione, Tris-HCl, Glycine Buffer （pH2～3.5） モノクローナル抗体結合力 （KD(M)） 4.9x10-¹⁰ 1.0x10-⁸ 1.0x10-⁵~⁶Ni-NTA: 2.8x10-⁸ 2.2x10-⁹ 2.8x10-⁹ Glutathione:1.0x10-⁵~⁶ モノクローナル抗体クローン
No.（免疫動物） NZ-1（Rat） （Mouse）P20.1 （Mouse）HIS. H8 M2（Mouse） 9E10（Mouse）3F10（Mouse）HA-7（Rat） （Mouse）5A7 アフィニティー +++++ ++++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ 組換えタンパク質精製コスト + + + ++ ++ ++ + ペプチド溶出 +++ +++ Imidazole +++ ++ ++ Glutathione 動物細胞外（培地）タンパク 質との非特異結合 + + +++++ ++++ +++ +++ ++++ 動物細胞内タンパク質との 非特異結合 + + ++++ ++++ ++++ +++ ++++
既存のアフィニティータグとの性能比較表
和光純薬工業では多数のアフィニティータグ関連製品を 取り揃えています。ラインアップはP.13をご覧ください。 詳しくはアフィニティータグシリーズパンフレットをご参照ください。 本比較表は当社独自調査によるものです。サンプル、検出方法および手法によって特異性が変化いたしますので、各アフィニティータグの性能を保証するものではございません。 TARGET tag 融合タンパク質を精製した例 TARGET tag、もしくはDYKDDDDK tagを C末端に融合したProteinXをそれぞれの抗体ビーズで 培養上清中から精製した例です。※詳細はP.7図4をご覧ください。 強い結合力＝低いKD(M)
抗PA tag抗体-PA tag : KD (M)=4.9×10-¹⁰
抗TARGET tag抗体-TARGET tag : KD (M)=1.0×10-⁸
これらの結合力を利用して目的タンパク質を効率的に精製・検出することができます。 Lane M: マーカー Lane 1: インプット Lane 2: フロースルー Lane 3: ペプチド溶出 Lane 4: ペプチド溶出後ビーズの酸溶出 (0.1M Glycine-HCl) 矢頭: 目的タンパク質
P A タグ ・ T A R G E T タグの特長
PA tagラインアップ
モノクローナル抗体 タグペプチド 洗浄溶液 HRP標識抗体 抗体結合アガロースビーズ TransientベクターPA tag System
エピトープ配列 GVAMPGAEDDVV 抗体クローンNo. NZ-1 (ラットモノクローナル抗体) 使用実績 タンパク質精製、免疫細胞染色、表面プラズモン共鳴法、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、ELISA、ChIP 参考文献1) Fujii, Y. et al., Protein Exp. Purif., 95, 240-247(2014). 2) Kato, Y. et al., Biochem. Biophys. Commun., 433, 374-378(2013).
3) Kaneko, MK. et al., Monoclon. Antib. Immunodiagn. Immunother., 32, 224-228(2013). 4) Liu, X. et al., Cancer Med., 2, 803-814(2013).
5) Ogasawara, S. et al., Monoclon. Antib. Immunodiagn. Immunother., 32, 377-381(2013). 6) Kato Kaneko, M. et al., Cancer Sci., 105, 744-748(2014).
品名 クローンNo.サブクラス 適応 規格 コードNo. 容量 希望納入価格（円）
Anti PA tag, Monoclonal Antibody (NZ-1) ラットIgG2a NZ-1 FC, ICCIP, WB, 免疫化学用 016-25861 200μg 30,000
012-25863 1mg 98,000
品名 備考 規格 コードNo. 容量 希望納入価格（円）
PA tag Peptide 含量 (HPLC) 95%以上 遺伝子研究用 167-25501 5mg 20,000
163-25503 25mg 80,000
品名 備考 規格 コードNo. 容量 希望納入価格（円）
PA tag Washing Solution フィルター滅菌済み 遺伝子研究用 169-27261 50ml 12,000
品名 クローンNo.サブクラス 適応 規格 コードNo. 容量 希望納入価格（円）
Anti PA tag, Monoclonal Antibody (NZ-1)
Peroxidase conjugated ラットIgG2aNZ-1 WB 免疫化学用
015-25951 200μl 45,000
011-25953 1ml 150,000
品名 クローンNo.サブクラス 規格 コードNo. 容量 希望納入価格（円）
Anti PA tag Antibody Beads ラットIgG2aNZ-1 免疫化学用
012-25841 2ml (Net 1ml) 65,000
018-25843 10ml (Net 5ml) 250,000
016-25844 50ml (Net 25ml) 照会
品名 選別マーカー 規格 コードNo. 容量 希望納入価格（円）
大腸菌 動物細胞
pCAG-Ble PA tag-C Bleomycin 遺伝子研究用 161-26861 20μg 65,000
pCAG-Ble PA tag-N Signal Plus Bleomycin 遺伝子研究用 168-26871 20μg 65,000
pCAG-Bsd PA tag-C Blasticidin S 遺伝子研究用 165-26881 20μg 65,000
pCAG-Bsd PA tag-N Signal Plus Blasticidin S 遺伝子研究用 162-26891 20μg 65,000
pCAG-Hyg PA tag-C Hygromycin B 遺伝子研究用 165-26901 20μg 65,000
pCAG-Hyg PA tag-N Signal Plus Hygromycin B 遺伝子研究用 162-26911 20μg 65,000
pCAG-Neo PA tag-C Kanamycin G418 遺伝子研究用 169-26921 20μg 65,000
pCAG-Neo PA tag-N Signal Plus Kanamycin G418 遺伝子研究用 166-26931 20μg 65,000
pCAG PA tag-N Signal Plus pCAG PA tag-C N末タイプ ： 細胞外分泌シグナル挿入済 C末タイプ SV40 PolyA Hygromycin BR pUC ori Secretory Signal CAG Promoter MCS PA tag 6,015bp SV40 PolyA SRα Promoter Hygromycin BR pUC ori CAG Promoter MCS PA tag 5,958bp SRα Promoter
P A タグ ・ T A R G E T タグの特長
TARGET tag System
タグペプチド 洗浄溶液 抗体結合アガロースビーズ モノクローナル抗体 HRP標識抗体 Transientベクター Episomalベクター
TARGET tagラインアップ
エピトープ配列 (YPGQ)₅V 抗体クローンNo. P20.1 （マウスモノクローナル抗体） 使用実績 タンパク質精製、ウエスタンブロット、表面プラズモン共鳴法 参考文献1) Tabata, S. et al., J. Proteomics, 73 (9), 1777-85(2010), 2) Nagae, M. et al., Acta Crystallogr. D., 64, 1138-1145(2008), 3) Nogi, T. et al,. Nature, 467, 1123-1127(2010), 4) Nishimasu, H. et al., Nature Struct. Mol. Biol., 18, 205-212(2011)
品名 クローンNo.サブクラス 適応 規格 コードNo. 容量 希望納入価格（円）
Anti TARGET tag, Monoclonal Antibody (P20.1) マウスIgG1P20.1 IP, WB 免疫化学用 016-25481 200μl 30,000
012-25483 1ml 98,000
品名 クローンNo.サブクラス 適応 規格 コードNo. 容量 希望納入価格（円）
Anti TARGET tag, Monoclonal Antibody (P20.1)
Peroxidase conjugated マウスIgG1P20.1 WB 免疫化学用
015-25571 200μl 45,000
011-25573 1ml 150,000
品名 備考 規格 コードNo. 容量 希望納入価格（円）
TARGET tag Peptide 含量 (HPLC) 95%以上 遺伝子研究用 200-19673 5mg 20,000
208-19674 25mg 80,000
品名 備考 規格 コードNo. 容量 希望納入価格（円）
TARGET tag Washing Solution フィルター滅菌済み 遺伝子研究用 208-19831 50ml 12,000
品名 クローンNo.サブクラス 規格 コードNo. 容量 希望納入価格（円）
Anti TARGET tag Antibody Beads マウスIgG1P20.1 免疫化学用
018-25561 2ml (Net 1ml) 65,000
014-25563 10ml (Net 5ml) 250,000
012-25564 50ml (Net 25ml) 照会
品名 選別マーカー 規格 コードNo. 容量 希望納入価格（円）
大腸菌 動物細胞
pCAG-Ble TARGET tag-C Bleomycin 遺伝子研究用 165-26381 20μg 65,000
pCAG-Ble TARGET tag-N Bleomycin 遺伝子研究用 162-26391 20μg 65,000
pCAG-Bsd TARGET tag-C Blasticidin S 遺伝子研究用 165-26401 20μg 65,000
pCAG-Bsd TARGET tag-N Blasticidin S 遺伝子研究用 162-26411 20μg 65,000
pCAG-Hyg TARGET tag-C Hygromycin B 遺伝子研究用 169-26421 20μg 65,000
pCAG-Hyg TARGET tag-N Hygromycin B 遺伝子研究用 166-26431 20μg 65,000
pCAG-Neo TARGET tag-C Kanamycin G418 遺伝子研究用 163-26441 20μg 65,000
pCAG-Neo TARGET tag-N Kanamycin G418 遺伝子研究用 160-26451 20μg 65,000
品名 選別マーカー 規格 コードNo. 容量 希望納入価格（円）
大腸菌 動物細胞
pEBMulti-Ble TARGET tag-C Bleomycin 遺伝子研究用 167-26461 20μg 65,000
pEBMulti-Ble TARGET tag-N Bleomycin 遺伝子研究用 164-26471 20μg 65,000
pEBMulti-Bsd TARGET tag-C Blasticidin S 遺伝子研究用 161-26481 20μg 65,000
pEBMulti-Bsd TARGET tag-N Blasticidin S 遺伝子研究用 168-26491 20μg 65,000
pEBMulti-Hyg TARGET tag-C Hygromycin B 遺伝子研究用 161-26501 20μg 65,000
pEBMulti-Hyg TARGET tag-N Hygromycin B 遺伝子研究用 168-26511 20μg 65,000
pEBMulti-Neo TARGET tag-C Kanamycin G418 遺伝子研究用 165-26521 20μg 65,000
pEBMulti-Neo TARGET tag-N Kanamycin G418 遺伝子研究用 162-26531 20μg 65,000
pEBMulti-Puro TARGET tag-C Ampicillin Puromycin 遺伝子研究用 169-26541 20μg 65,000
pEBMulti-Puro TARGET tag-N Ampicillin Puromycin 遺伝子研究用 166-26551 20μg 65,000
TARGET tag Transient ベクター TARGET tag Episomal ベクター
C末タイプ N末タイプ C末タイプ N末タイプ SV40 PolyA SRα Promoter Hygromycin BR 6,014bp pUC ori CAG Promoter MCS TARGET tag SV40 PolyA SRα Promoter Hygromycin BR 6,012bp pUC ori CAG Promoter MCS TARGET tag 11,097bp SV40 PolyA SRα Promoter Hygromycin BR oriP pUC ori CAG Promoter TK Promoter EBNA1 MCS TARGET tag 11,089bp SV40 PolyA SRα Promoter Hygromycin BR pUC ori oriP CAG Promoter TK Promoter EBNA1 MCS TARGET tag
P A タグ ・ T A R G E T タグの特長
発現プラスミドの設計について
エピトープタグの挿入位置 PA tagとTARGET tagは、N末端、C末端いずれにも挿入することができます (図1)。N末端またはC末端へのタグの挿入にはPA tagもしくはTARGET tagの発現ベクターもご用意しています。
また、PA tagは、タンパク質のループ領域でよく見られるⅡ型のβターン構造を形成することが判明しており、タンパク質のループ領域内に 直接挿入してタンパク質精製に応用された実績もあります。
目的タンパク質の構造や機能によりタグペプチドをN末端やC末端に融合したくない場合、PA tagのループ領域への融合をご検討ください。
目的タンパク質を細胞外に分泌させる
PA tagシリーズのpCAG PA tag-N Signal Plusはマルチクローニングサイトの5’末端側に細胞外分泌シグナルをコードする遺伝子を組み 込んでいるため、目的タンパク質を培地中に分泌させることが可能です。 安定発現株を樹立する TARGET tagシリーズでは、Episomal型ベクターpEBMultiベクターをご用意しています。pEBMultiベクターを用いることにより目的タンパ ク質を長期的に発現する細胞を容易に樹立することが可能です。 Lane M: マーカー Lane S: 培養上清 Lane F: フロースルー Lane W: 洗浄画分 Lane 1～10: ペプチド溶出画分 矢頭: 目的タンパク質 ペプチド溶出: 0.1 mg/ml PA tag ペプチド M S F W 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M S F W 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Protein X (PA tag N末融合型) Protein X (PA tag C末融合型)
Protein X (PA tag N末融合型)、およびProtein X (PA tag C末融合型) をHEK293T細胞の培養上清からアフィニティー精製した例です。トランスフェクション後48～72時 間後の培養上清420 mlに抗PAタグ抗体ビーズ8 ml (Net 4 ml) を加え、2時間2-4℃でインキュベートします。抗体ビーズの4倍量のTBS (20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl) で5回洗浄し、その後抗体ビーズと等量のPA tagペプチド (0.1 mg/ml) を10回添加して溶出しています。PA tagの挿入位置に依存することなく目的タンパク質を高純度かつ 効率的に精製できています。 図1. HEK293Tの培養上清からPA tagを用いてアフィニティー精製を行った例 pEBMultiベクターとは？ 図2. pEBMultiベクターを用いた簡易的安定発現株の樹立 TARGET tagシリーズには、一過性発現用のpCAGベクターに加え、Episomal型安定発現用のpEBMultiベクターもご用意していま す。pEBMultiベクターは霊長類 (ヒト、サル) やイヌなどの導入細胞内でホストゲノムDNAへの組込みなしに、安定的に複製・維持さ れ、目的遺伝子を長期間発現させることが可能なベクターです。目的タンパク質を高発現する安定発現株樹立及び複数の遺伝子導 入が容易になりますので、ご検討ください。 細胞内に取り込まれたpEBMultiベクターは、EBNA1タンパク質を介して配列内のoriPと染色体を結合させます。染色体と結合したベ クターは細胞分裂時に染色体と共に複製され娘細胞へ分配されます。これにより、遺伝子をゲノムへ組込むことなく簡易的に細胞を安 定発現株状態にできます。 pEBMulti 目的遺伝子 染色体 EBNA1タンパク質 oriPを介した 染色体とベクターの結合 データ提供：大阪大学 蛋白質研究所附属蛋白質解析先端研究センター 分子創製学研究室 高木淳一先生、東北大学大学院医学系研究科 地域イノベーション分野 藤井勇樹先生
P A タグ ・ T A R G E T タグの特長
宿主の選択について
動物細胞PA tagまたはTARGET tagの発現ベクターを使用することにより、動物細胞（HEK293, HEK293T, CHOなど）でPA tagまたはTARGET tag融合タンパク質を発現できます。 PA tagは、ヒトポドプラニンのPLAG領域内の配列を使用しているため、HEK293、COS-1、COS-7といったポドプラニンを発現する細胞株で 作製したライセートを用いて抗PAタグ抗体でウエスタンブロットを行った場合、わずかに37 kDa付近に内在性のポドプラニンのバンドが現れま す。ポドプラニンは膜タンパク質であり分泌や切断が起こらないため、目的タンパク質を分泌させて精製する場合には全く問題ありません。また、 ポドプラニンはライセート中において抗PA tag抗体によりキャプチャーされないことから、細胞膜タンパク質や細胞内タンパク質も精製できます。 抗PA tag抗体は、霊長類以外のポドプラニンは認識しないため、げっ歯類由来の細胞株においては問題なく使用できます。 大腸菌・昆虫細胞
大腸菌や昆虫細胞など動物細胞以外の宿主を用いたタンパク質発現系においてもPA tag、TARGET tagを使用することが可能です。 ただし、弊社から販売しているベクターは動物細胞でのタンパク質発現用に設計しているため、大腸菌や昆虫細胞をご使用の場合には、 専用のベクターにタグ配列を組み込んでいただく必要があります。
使用実績のある細胞種
■TARGET tag : HEK293 (Human embryonic kidney)、 HEK293T、 CHO(Chinese hamster ovary)、
E. coli
BL21 (DE3)、昆虫細胞(SF+, Sf9, Sf21, High Five)■PA tag : HEK293、 HEK293T、 CHO、 U-2 OS (Human osteosarcoma)、
E. coli
BL21 (DE3)、昆虫細胞(SF+, Sf9, Sf21, High Five)抗PA tag抗体ビーズによる精製 抗TARGET tag抗体ビーズによる精製
大腸菌で発現させたPA tag、 TARGET tag融合タンパク質を精製し、質量分析により解析した例です。
大腸菌を用いたタンパク質発現系においてもPA tag、TARGET tagでタンパク質を高純度で精製することが可能です。
図3. 大腸菌を用いた発現系でPA tagシステム、TARGET tagシステムを使用した例
実験例Ⅰ
実験方法
実験例Ⅰ
タンパク質精製
動物細胞発現系でタンパク質を精製する場合、目的タンパク質の精製量と純度が大きな問題になります。
PA tagとTARGET tagは、既存のアフィニティータグに比べて特異性と親和性が高いことから、ワンステップで目的タンパク質を高純度 に大量精製することが可能です (Fujii et al., 2014; Tabata et al., 2010)。
さらに、免疫沈降後の抗体ビーズが中性条件下 (pH6.0～8.0)で 再生できるため、抗体ビーズを繰り返し使用することができ、免疫沈降 によるタンパク質精製のランニングコストを大幅に低減できます。 ここでは、動物細胞発現系を用いたタンパク質精製方法、抗体ビーズの再生方法など、実験のポイントについて紹介します。 分泌タンパク質の精製 ❶目的遺伝子をトランスフェクションした培養細胞を37 ℃、5 %CO₂条件下で約72時間培養する。 ❷培養上清をチューブに回収する。 ❸8,000 rpmで20分間遠心する。 ❹1 M Tris-HCl (pH8.0) を終濃度10 mMとなるように培地に添加して中和させる。 ❺孔径約0.45μmのフィルターに培養培地を通し、夾雑物を除去する。 ❻培養上清の1/50～1/100量の抗体結合ビーズを加え、4℃で2時間ゆっくりと混和する。 ❼目的タンパク質をキャプチャーさせた抗体結合ビーズをタンパク質上清ごとオープンカラムへ移す。 この時、抗体結合ビーズの取りこぼしがないように数回フロースルー液でチューブを洗う。 ❽抗体ビーズの4倍量のTBS溶液を加え、抗体結合ビーズを洗浄する。この操作を3～5回繰り返す。 ❾TBSに希釈したタグペプチド溶液 (0.1 mg/ml) を抗体ビーズの等量添加し、溶出されたタンパク質を回収する。この操作を10回繰り 返すことにより9割以上のタンパク質を回収できる。 細胞膜タンパク質・細胞内タンパク質の精製 ❶目的遺伝子をトランスフェクションした培養細胞を37 ℃、5 %CO₂条件下で約24～72時間培養する。 ❷シャーレを氷上に移し、細胞の培地をアスピレーターで吸引する。 ❸冷えたPBSをシャーレに添加する。 ❹アスピレーターでPBSを吸引する。❸-❹の操作を3～5回行う。 ❺セルスクレイパーもしくは0.5 mM EDTAを含むPBSを用いて細胞をチューブに回収する。 ❻1,000 rpmで5分間遠心し、PBSを除去する。 ❼タンパク質抽出バッファーを添加し、ピペッティングやタッピングで混和して5分～30分氷上で静置する。 ❽15,000 rpmで15分間遠心し、上清 (細胞ライセート) を回収する。 ❾細胞ライセートの1/50～1/100量 (net) の抗体結合ビーズを加え、4℃で2時間ゆっくりと混和しながらインキュベートする。 ❿タンパク質抽出バッファーを用いて抗体結合ビーズを3～5回洗浄する。 ⓫TBSに希釈したタグペプチド溶液 (0.1 mg/ml) を抗体結合ビーズの等量添加し、溶出されたタンパク質を回収する。この操作を10回繰り 返すことにより9割以上のタンパク質を回収できる。 タグ配列を除去する
・TEVプロテアーゼ 認識配列：Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-↓-Gly（GlnとGlyの間を切断） ・Turbo3Cプロテアーゼ 認識配列：Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-↓-Gly-Pro （GlnとGlyの間を切断）
実験例Ⅰ
抗体結合ビーズの再生
PA tagとTARGET tagは、専用の洗浄溶液を用いることにより、中性条件下 (pH6.0～8.0) で、免疫沈降後の抗体からタグペプチドを除 去して抗体結合ビーズを再生することが可能です。通常、抗体結合ビーズの再生には酸性バッファー(pH2.5～3.5)が用いられますが、酸性 バッファーは抗体にダメージを与えるため、再生の繰り返しによりタンパク質精製効率が低下します。 PA tagとTARGET tagの結合ビーズは、中性条件下でそれぞれ60回、40回再生でき、タンパク質精製効率が低下しないことを確認して います。 ただし、洗浄溶液で完全に抗体からタグペプチドを除去できない場合もありますので、異なるタンパク質を精製する場合にはコンタミ ネーションに注意してください。 抗体結合ビーズの再生方法 ➡従来タグと比較して、ペプチド溶出による目的タンパク質画分に含まれるバックグラウンドを低減させることができ、 高純度のタンパク質が得られました。TARGET tag、もしくはDYKDDDDK tagをC末端に融合したProteinXをそれぞれの抗体結合ビーズで培養上清中から精製した例です。培養7日目の培養上清10 mlを回収 し、そこに抗体結合ビーズ0.1 ml (net 0.05ml) を加えて4℃で2時間インキュベートしました。その後0.2 mg/mlのタグペプチドを添加し4℃で30分間反応させて溶出していま す。さらに、ペプチド溶出後の抗体結合ビーズに0.1 M Glycine-HCl (pH 2.7) を添加し、室温で5分間反応させて残存タンパク質を確認しました。各サンプルをSDS-PAGEで 分離し、銀染色を行いました。 図4. 培養上清からTARGET tag融合タンパク質を精製した例 TARGET tag融合タンパク質をキャプチャーした抗体結合ビーズの洗浄 TARGET tagは抗体とタグペプチドの解離速度が速いため、目的タンパク質をキャプチャーした抗体結合ビーズを洗浄する際は バッファーをゆっくりと添加してください。バッファーを激しく添加した場合、タンパク質の収量が低下する可能性があります。 PA tag融合タンパク質の溶出 PA tagは抗体とタグペプチドの解離速度が遅いため、タグペプチドを用いて競合溶出を行う際は毎回タグペプチド溶液を染み込 ませた状態で5分間以上インキュベートすることが必要です。フラクションごとにインキュベーションせずに連続的に溶出を行った 場合、低濃度の目的タンパク質が広範囲にわたって溶出されることがあります。
実 験 の ポ イ ン ト
❶抗体ビーズの量に対し10倍量の洗浄溶液を加え、 室温で10分間ゆっくりと混和する。 ❷洗浄溶液を交換しながらこの操作を3回繰り返す。 ❸TBSでよく洗浄する。 Lane M: マーカー Lane 1: インプット Lane 2: フロースルー Lane 3: ペプチド溶出 Lane 4: ペプチド溶出後ビーズの酸溶出 (0.1M Glycine-HCl) 矢頭: 目的タンパク質実験例Ⅰ
X線結晶構造解析のサンプル調製
X線結晶構造解析を行う場合、高純度のタンパク質を大量に精製する必要があります。通常、タンパク質の純度を上げるためには複数の カラム手法を組み合わせる必要があります。また、必要量のタンパク質を得るために精製を繰り返さなければなりません。ワンステップで 目的タンパク質を高い純度で大量に精製することが可能なPA tagとTARGET tagは、X線結晶構造解析のサンプル調整に有効なツー ルです。
図6. TARGET tagシステムを用いてX線結晶構造解析用のサンプル調整が行われた例 ①Spondin 1
Nagae, M. et al., Acta Crystallogr. D., 64, 1138-1145(2008)
②Sema6A-Plexin A2複合体 (TARGET tagシステムはPlexin A2の精製に使用)
Nogi, T. et al,. Nature, 467, 1123-1127(2010) ③ENPP1
Kato K et al., Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. , 68, 778-782 (2012)
Kato K et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 109 (42), 16876-16871 (2012) ④ENPP2
Nishimasu, H. et al., Nature Struct. Mol. Biol., 18, 205-212(2011)
Kato K et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 109 (42), 16876-16871 (2012)
バックグラウンドの低減方法
PA tagでは、高濃度のNaCl (0.15～1.0 M) を含むTBS溶液で前洗浄を行うことにより夾雑物を除去することが可能です。 M: I: P: 1: 2: 3: 4: 5: 6: 7: 8: 9: 10: 11: 12: 13: 14: Marker input 100ng分 精製前サンプル wash画分① wash画分② wash画分③ wash画分④ wash画分⑤ wash画分⑥ wash画分⑦ wash画分⑧ wash画分⑨ 酸溶出分画① 酸溶出分画② 酸溶出分画③ 酸溶出分画④ 酸溶出分画⑤ 1) 20mlの昆虫細胞の細胞溶解液に1.0mg/lになるように精製したProtein Z-PAを添加後、抗PAタグ抗体ビーズ200μl（net 100μl）を添加し、4℃、3hr撹拌しました。 2) 塩濃度が異なるTBS溶液（各0.15M, 0.5M, 1.0M NaCl）をそれぞれ調整し、ビーズの50倍量を用いて洗浄操作（9回）を行いました。 3) 回収した各ビーズに0.1M Glycine-HCl (pH2.7)を0.5ml添加し、室温で5min穏やかに振とうし、溶出を行いました。 4) 遠心分離後、上清を回収し1M Tris-HCl (pH9.0)で中和処理を行いました。3）,4）を5回繰り返しました。 5) 各サンプルを用いてSDS-PAGE後に銀染色を行い、塩濃度の違いによる夾雑タンパク質除去結果を比較しました。 ➡高濃度のNaClを含むTBS溶液で前洗浄を行うことにより、バックグラウンドを低減できました。 図5. 高濃度のNaClを含むTBS溶液での前洗浄によりバックグラウンドを低減した例①Spondin ②Semaphorin6A-PlexinA2複合体 ③ENPP1 ④ENPP2
データ提供：大阪大学 蛋白質研究所附属蛋白質解析先端研究センター 分子創製学研究室 高木淳一先生、東北大学大学院医学系研究科 地域イノベーション分野 藤井勇樹先生 Protein Z (c-PA tag)
Wash Elution
0.15M NaCl 0.5M NaCl 1.0M NaCl kDa M I P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314 1011121314 1011121314 250 150 100 75 50 37 25 20 15 10
実験例Ⅱ
実 験 の ポ イ ン ト
実験例
一次抗体反応時間の短縮 PA tagは、抗PA tag抗体（NZ-1）を一次抗体として用いた場合、わずか5分間の抗体反応を行 うだけで目的タンパク質を高感度で検出できます。Lane 1 一次抗体 : 抗IDH1抗体（RcMab-1）, 1μg/ml 二次抗体 : 抗ラットIgG-HRP標識, 1000倍希釈 Lane 2 一次抗体 : 抗PAタグ抗体, 1μg/ml 二次抗体 : 抗ラットIgG-HRP標識, 1000倍希釈 Lane 3 一次抗体 : 抗DYKDDDDKタグ抗体, 3.5μg/ml 二次抗体 : 抗マウスIgG-HRP標識, 1000倍希釈 サンプル量 : 各10μg 露光時間 : 10分 図8. 抗PA tag抗体のインキュベーション時間の検討結果 一次抗体に 1μg/ml 抗PA tag抗体を、二次抗体に抗ラットIgG HRP標識を用いて一次抗体のインキュベーション時 間の検討を行った結果です。１分程度のインキュベーション時間でも明確なバンドを確認することができ、５分程度 のインキュベーション時間でバンドの濃さは既に飽和していることが確認できました。 データ提供 :東北大学大学院医学系研究科 地域イノベーション分野 加藤 幸成先生, 金子 美華先生 サンプル: IDH-PA-DYKDDDDK
実験例Ⅱ
ウエスタンブロット
PA tag・TARGET tagは、ウエスタンブロットにも使用可能です。 PA tag、TARGET tag共に高い親和性を有しているため、目的タンパク質を高感度で検出することができます。また、特異性も高いため、 バックグラウンドを低減することが可能です。ここでは、PA tagおよびTARGET tagを用いたウエスタンブロット法について紹介します。
❶適量のサンプルにSDS-PAGEサンプルバッファーを加え、95℃で5分間煮沸する。 ❷SDS-PAGE用ポリアクリルアミドゲルにサンプルをアプライし、泳動する。 ❸SDS-PAGEで分離したタンパク質をSDS-PAGE用ポリアクリルアミドゲルからメンブレンに転写する。 ❹5 %スキムミルクを含むTBS-T (pH8.0) を用いてブロッキングを行う。ブロッキング溶液でメンブレンを浸し、室温で15分間振盪する。 ❺TBS-T (pH8.0) に交換して5分間振盪し、洗浄を行う。この操作を4回繰り返す。 ❻HRP標識抗体を1μg/mlとなるようにTBS-T (pH8.0) で希釈して添加し、室温で1時間振盪する。 ❼TBS-T (pH8.0) に交換して5分間振盪し、洗浄を行う。この操作を4回繰り返す。 ❽HRP検出用発光試薬を用いて検出する。 C端末側にDYKDDDDKタグとPAタグをタンデムに付加したイソクエン酸脱水素酵素/IDH1（IDH1-PA-DYK）を骨肉腫細胞株で発現させ、その細胞のライセートをサンプル としSDS-PAGEを行った後、各抗体を用いてウエスタンブロットにて検出しました。 図7. PAタグ/抗PA tag抗体(NZ-1）を用いたウエスタンブロットの例 データ提供 :東北大学大学院医学系研究科 地域イノベーション分野 加藤 幸成先生, 金子 美華先生
➡抗PA tagラットモノクロナール抗体（NZ-1）は抗DYKDDDDK tag抗体よりも高い感度、特異性で検出できました。
抗PA tag抗体（NZ-1）を1次抗体とし て使用した場合のIncubation time (min) 1 5 30 60 抗PA tag抗体（NZ-1）を一次抗体として使用
一次抗体反応時間
わずか5分！
！
（通常60分）
実験例Ⅲ
実 験 の ポ イ ン ト
実験例Ⅲ
免疫細胞化学染色
PA tagは免疫細胞化学染色に使用できます。 PA tagが有する特異性、結合力により、目的タンパク質を高感度で特異的に検出できます。ペプチドタグに塩基性アミノ酸のリジンやア ルギニンを含まないため、ホルマリンやパラホルムアルデヒドの影響を受けにくいです。 ここでは、PA tagを用いた免疫細胞化学染色の例を紹介します。 発現細胞の選択 抗PA tag抗体はHEK293、COS-1、COS-7といった細胞株の内在性のポドプラニンに反応します。 霊長類由来の細胞株の免疫細胞染色にPA tagシステムを使用する場合は、ポドプラニンの発現が認められない細胞株を使用してく ださい。霊長類以外のポドプラニンには抗PA tag抗体は反応しないため、CHO細胞などのげっ歯類由来の細胞株は使用可能です。実験例
IDH2-PAを発現したCHO-K1細胞を抗PA tag抗体により検出しました。抗PA tag抗体 (1μ g/ ml) を30分間反応させ、その後、Alexa488標識抗ラットIgG抗体を30分間反応させ、蛍光顕微 鏡で検出しました。 緑：IDH2-PA、青:DAPI データ提供：東北大学大学院医学系研究科 地域イノベーション分野 加藤幸成 先生 図9. PAタグシステムを免疫細胞化学染色に使用した例 ❶トランスフェクションから24～48時間後に培養細胞を3.7 %ホルムアルデヒドを含むPBSで処理し、10～30分程度静置する。 ❷PBSで3回洗浄する。 ❸0.1 %Triton Xを含むPBSで処理し、10分間静置する。 ❹1 %ヤギ血清、0.1 %Triton Xを含むPBSを細胞に添加し、30分～1時間静置する。-ブロッキング
❺抗PA tag抗体（1μg/mL）を1 %ヤギ血清、0.1 %Triton Xを含むPBSで希釈し、細胞に添加して1時間静置する。
❻2次抗体（抗ラットIgG抗体）を1 %ヤギ血清、0.1 %Triton Xを含むPBSで希釈し、細胞に添加して1時間静置する。2次抗体の希釈倍率は 製品説明書に記載された数値を参考にする。蛍光二次抗体を使用する場合はアルミホイル等を用いて遮光する。 ❼PBSを用いて3回洗浄する。 ❽蛍光顕微鏡を用いて観察する。 二次抗体で検出する Jackson社では、高品質な二次抗体を多数取り揃えています。 カタログをご用意しております。 弊社営業員もしくは販売代理店までお申し付け下さい。
実験例Ⅳ
実験例Ⅳ
フローサイトメトリー
タグ抗体を標識する PA tagは、生細胞条件下で抗体を反応させることも可能です。この特長を利用しフローサイトメトリーを行った例を紹介します。 同仁化学Labeling Kitを使用してタグ抗体を標識することができます。 Labeling Kitは活性化試薬とフィルトレーションチューブにより、抗体等を簡単に標識するためのキットです。 前処理‐反応‐精製まで全て１つのフィルトレーションチューブで行うことができ、3時間以内に標識体が得られます。 品名 メーカー コードNo. 容量 希望納入価格（円）Peroxidase Labeling Kit-NH2
同仁化学
348-90821 3回用 17,600
Peroxidase Labeling Kit-SH 345-90831 3回用 17,600
Biotin Labeling Kit-NH2 347-90891 3回用 12,400
Biotin Labeling Kit-SH 348-90941 3回用 12,400
Fluorescein Labeling Kit-NH2 347-90911 3回用 21,600
HiLyte Fluor™ 555 Labeling Kit-NH2 348-91041 3回用 21,600
HiLyte Fluor™ 647 Labeling Kit-NH2 345-91051 3回用 21,600
HiLyte Fluor™ 750 Labeling Kit-NH2 346-91221 3回用 49,000
ICG Labeling Kit-NH2
341-91433 1回用 20,600
345-91431 3回用 46,400
Allophycocyanin Labeling Kit-NH2 349-90971 3回用 44,200
R-Phycoerythrin Labeling Kit-NH2 347-91011 3回用 44,200
実験例
抗PA tag抗体を用いてPA-ラビットポドプラニンを発現したCHO-K1細胞をフ ローサイトメトリーにより検出しました。細胞に抗PA tag抗体を30分間反応させ、 その後Oregon Green標識抗ラットIgG抗体を30分間反応させました。 (※抗PA tag抗体はラビットポドプラニンは認識しません) 図10. PA tagをフローサイトメトリーに応用した例 データ提供：東北大学大学院医学系研究科 地域イノベーション分野 加藤幸成 先生 プロトコルも ご用意しております。 ご請求下さい。 Control 抗PA tag抗体 ❶細胞をチューブに回収し、5％FCSを含むDMEMで再懸濁する。 ❷5%FCSを含むDMEMに抗PA tag抗体を加え、細胞に添加する。濃度の目安は0.01-10μg/ml。 ❸30分間氷上でインキュベートする。 ❹PBSで細胞を洗浄する。（1回） ❺フローサイトメーターで解析する。実験例Ⅴ
参考文献
●"A rapid screening method for cell lines producing singly-tagged recombinant proteins using the" TARGET tag" system." Tabata S. et al., J. Proteomics, 73(9):1777-85(2010)
●"PA tag: A versatile protein tagging system using a super high affinity antibody against a dodecapeptide derived from human podoplanin."
実験例Ⅴ
表面プラズモン共鳴(SPR)法への応用
タンパク質精製に安定発現株を使用する場合、発現量が多い細胞株を選別することが必要です。 表面プラズモン共鳴法 (SPR法) は、相互作用を調べたいタンパク質の一方をセンサーチップに固定化し、もう一方のタンパク質を液相に 流してその結合と解離をセンサーチップ表面の質量変化として検出する技術です。 分子間相互作用をリアルタイムに計測する技術を使用することにより、目的タンパク質の発現量が多い細胞株をスクリーニングすること が可能です。ここではPA tag 融合タンパク質、TARGET tag 融合タンパク質をSPR法により検出する方法を紹介します。
実験例
実 験 の ポ イ ン ト
SPR法では、一度センサーチップに固定化した抗体を繰り返して使用することが望まれます。 PA tagやTARGET tagを用いたSPR法では、洗浄溶液をインジェクトしてセンサーチップに固定した抗体から目的タンパク質を解 離できるため、一度センサーチップに固定化した抗体で細胞株のスクリーニングを繰り返すことが可能です。 図11. PAタグシステムを表面プラズモン共鳴法に使用した例 センサーチップに抗PAタグ抗体を固定化し、その後PA tag 融合T4Lを10 nM (赤)、3 nM (青)、1 nM (緑) でインジェクトした例です。 データ提供：大阪大学 蛋白質研究所附属蛋白質解析先端研究センター 分子創製学研究室 高木 淳一先生、東北大学大学院医学系研究科 地域イノベーション分野 藤井勇樹先生 ❶カルボキシメチルデキストラン薄膜でコーティングされたセンサーチップを用意する。 ❷ランニングバッファーを流す。 ❸N-ヒドロキシスクシンイミドとN-エチル-N’- (3’-ジメチルアミノプロピル) カルボジイミドを等量で混合した溶液をインジェクトする (カルボキシメチル基の活性化)。 ❹抗体を希釈した溶液をインジェクトする (カップリング反応により抗体をセンサーチップに固定化)。 ❺メタノールアミンをインジェクトする (残存する活性基の不活性化)。 ❻ランニングバッファーで希釈した目的タンパク質をインジェクトする。 ❼インジェクション終了後、3分間解離させる。 ※センサーチップに固定化する抗体量、インジェクトを行うタンパク質量、流量、流速、バッファー組成は使用する機器に適したものを選 んでください。関連製品一覧
DYKDDDDK
tag
6xHis tag
GFP tag
HA tag
c-Myc tag
GST tag
V5 tag
MBP tag
アフィニティータグ ラインアップ
品名 コードNo. 容量 希望納入価格（円）Anti DYKDDDDK tag,Monoclonal Antibody
018-22381 200μg 24,000 014-22383 1mg 48,000 012-22384 5mg 77,000
Anti DYKDDDDK tag,Monoclonal Antibody,Rat 018-23621 200μg 40,000
Anti DYKDDDDK tag,Monoclonal Antibody, Peroxidase Conjugated
015-22391 200μl 45,000 019-22394 1ml 95,000
Anti DYKDDDDK tag Antibody Beads
012-22781 2ml (Net 1ml) 48,000 018-22783 10ml (Net 5ml) 90,000 016-22784 50ml (Net 25ml) 290,000
Anti DYKDDDDK tag Antibody Magnetic Beads 017-25151 2.5ml 50,000
013-25153 2.5mlx5 200,000
DYKDDDDK Peptide 044-30951 5mg 18,000
040-30953 25mg 80,000
Anti 6xHistidine,Monoclonal Antibody(9F2) 010-21861 200μg 30,000
014-21864 1mg 65,000
Anti 6xHistidine,Monoclonal Antibody(9C11) 011-23091 200μg 40,000
015-23094 1mg 65,000
Anti 6xHistidine,Monoclonal Antibody(21-48) 017-23211 200μg 35,000
011-23214 1mg 95,000
Anti 6xHistidine,Monoclonal Antibody (28-75) 014-23221 200μg 40,000
018-23224 1mg 95,000
Anti 6xHistidine,Monoclonal Antibody(9F2), Peroxidase Conjugated
013-23171 100μl 36,000 017-23174 500μl 75,000
Anti 6xHistidine,Monoclonal Antibody(9C11), Peroxidase Conjugated
010-23181 100μl 45,000 014-23184 500μl 75,000
Anti 6xHistidine Antibody (28-75) Beads 019-23391 2ml (Net 1ml) 65,000
015-23393 10ml (Net 5ml) 200,000
6xHistidine Peptide 087-09251 5mg 20,000
083-09253 25mg 80,000
Anti Green Fluorescent Protein,Monoclonal Antibody(mFX73) 012-20461 100μl 30,000
Anti Green Fluorescent Protein,Monoclonal Antibody(mFX75) 012-22541 100μl 30,000
Anti Green Fluorescent Protein,Rabbit Polyclonal IS 013-23811 20μg 45,000
Anti Hemaggluthin,Monoclonal Antibody 014-21881 200μg 30,000
018-21884 1mg 66,000
Anti Hemagglutinin,Monoclonal Antibody, Peroxidase Conjugated
011-21911 100μl 33,000 015-21914 500μl 75,000
Anti HA Antibody Beads 014-23081 2ml (Net 1ml) 65,000
010-23083 10ml (Net 5ml) 150,000
HA Peptide 088-09161 5mg 30,000
Anti c-Myc,Monoclonal Antibody 017-21871 200μg 30,000
011-21874 1mg 66,000
Anti c-Myc, Monoclonal Antibody, Peroxidase Conjugated
014-21901 100μl 33,000 018-21904 500μl 75,000
c-Myc Peptide 132-16361 5mg 25,000
138-16363 25mg 100,000
Anti Glutathione S-transferase, Monoclonal Antibody
013-21851 200μg 30,000 017-21854 1mg 66,000
Anti Glutathione S-transferse,Monoclonal Antibody, Peroxidase Conjugated
011-21891 100μl 33,000 015-21894 500μl 75,000
Anti V5 tag,Monoclonal Antibody (6F5) 011-23591 200μg 35,000
015-23594 1mg 65,000
Anti V5 tag, Monoclonal Antibody(6F5), Peroxidase Conjugated 019-24371 100μl 35,000
Anti V5 tag Antibody Beads 016-24381 2ml (Net 1ml) 65,000
012-24383 10ml (Net 5ml) 150,000
