〈原著〉天然高分子（フィブリン）と合成高分子（PGA）の複合化技術を導入した自家移植モデルにおける軟骨再生

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(1)ぎを近畿大医誌仙dJKinkiUniv). 第柏号 271~お2. 2 0 0 8. 2 7 1. 天然高分子(フィプリン)と合成高分子 (PGA)の複合化技術を導入した自家移植モデルにおける軟骨再生和田充弘近畿大学医学部形成外科学教室. 抄録本研究では，播種細胞の漏出を抑制して播種効率を向上させるため，生体吸収性の合成高分子 ( PGA)と天然高分子(フィプリン)を複合化する技術を開発した.複合化した分解性高分子を試用して自家移植モデルの軟骨再生を試み，異なる移植部位における複合化高分子の有用性について検討した(実験 A). さらに本モデルに塩基性線維芽細胞増殖因子 (b-FGF) 徐放システムを導入して， b-FGFによる軟骨再生の促進効果と軟骨再生における新生血管の役割について検討した(実験 B ) . 実験 Aでは，移植 3週日以降の軟骨組織において，正常耳介軟骨と極めて近似する組織構造が観察された.また，移植後 5週目から，軟骨紙織の周囲に明瞭な新生血管網が形成された.本法を導入した結果，大動物を用いた自家移植モデノレにおいて，軟骨の再生誘導は可能であることが示唆された.実験 Bでは， b-FGF徐放システムを複合化高分子(スカフォールド)に組み込んだ結果，軟骨再生は著しく促進した. また免疫組織化学的検討の結果， b-FGF徐放システムによって径の大きい血管から形成される血管網が誘導されることが判明した.生体吸収性の合成高分子と天然高分子を複合化することにより，力学的強度と生体親和性をかね備えたスカフォールドを作製することが可能と考えられた.今後，本技術を用いてヒト耳介に特有な 3次元形状を有する軟骨組織の再生誘導実験を予定している. Keyw o r d s :生分解性高分子，自家移植，軟骨再生， b-FGF，徐放システム. 緒言. た.その結果，細胞操作技術細胞供給源の探索生分解性高分子の改良軟骨再生における形態形成. 1 9 8 8年，幹細胞を用いた革新的な組織再生技術が V a c a n t i，Langerらによって考案された.この技術. 制御機構と成長因子の関与 5 などの基盤技術の開発や臨床応用化に関する研究が系統的に数多く報告さ. は，組織・臓器の性質や形状に合わせて成形した生. れてきた.これら一連の研究結果 2-7から，弾性軟骨. 分解性高分子に幹細胞を播種して，体外もしくは体. の組織性状と複雑な 3次元形状を有する薄い軟骨再. 内で人工的に三次元組織を再生誘導する技術， t i s -. 生は可能であり，ヒト耳介特有の 3次元形状は長期. i s s u e s u ee n g i n e e r i n g法，として報告されたにこの t e n g i n e e r i n g法は，高度な機能をもっ 3次元組織・臓器再生を可能とする 2 1世紀の新しい治療法として，. 間維持されうることが判明した.さらに，細胞外マ有の柔らかい性状を保持していることがわかった.. 今後の発展が注目されている.. しかし，臨床応用を目指して行った大動物(例えば，. トリックスに含まれる弾性線維によって，耳介は特. “耳介の再生"では，高度な 3次元形状の再現を必. プタ，羊など)実験において，ヒト耳介形状軟骨の. 要とするが，比較的単純な組織構造が単一化細胞(弾. 再生誘導が試みられた 8，9が，未だにに成功例は報告. 性軟骨細胞)によって構築されているため， t i s s u e. されていない.. e n g i n e e r i n gのモデルケースとして理想的であると. 近年，大動物もしくはヒトにおいて，生分解性高. 考えられてきた.この耳介軟骨の再生誘導を実現す. 分子と細胞を制御して，勝脱および大血管の 3次元. るため，これまで主に小動物(ヌードマウス)を用. 構築を組織誘導した臨床応用例が報告された.. いてヒト耳介形状軟骨の再生誘導が試みられてき. A t a l aらは，合成高分子 PGAにヒト勝脱細胞を播. 大阪府大阪狭山市大野東 3 7 7 2( 干5 8 9 8 5 1 1 ) 受付平成2 0年 8月2 6日，受理平成2 0年 1 0月 7日.

(2) 2 7 2. 和田充弘. 種して作成した細胞・高分子複合体を，ヒト腹腔に. 検討した.. 移植して勝脱再生を試みた.この複合体をヒト腹腔. 実験動物. 内に移植する際に，複合体と大網を天然高分子フィプリンで接着させた結果，勝腕の再生誘導が可能と. h i n ' o k aらは，合成高なったと報告した 10 また， S. ビーグル犬 ( 6 0匹，. 4~6 週齢，雌，浜口動物，. 兵庫)を用いた.飼育は，個別ゲージ(室温2 3C， 0. 分子 PGA/P( LA-CL) に骨髄幹細胞を播種して，. 2時間明暗サイクル)で行った.飲料用湿度 50%，1. ヒト体内で大血管を作成した.大血管を天然高分子. 水は制限せず，飼育繁殖固形飼料 CD55α(日本クレ. フィプリンで補強した後に血管移植した結果，肺動. ア株式会社，東京)を 1日 1回約 3 0 0g与えた.. 脈の再生誘導が可能となったと報告した il このよ. 生分解性合成高分子. うに，生体吸収性の合成高分子と天然高分子を複合化することにより，大動物もしくはヒトにおいて組. シート状(長さ 2cm ，幅 2cm ，厚さ 1 5 0ルm) に. 織の再生誘導が可能となることが示唆された.しか. 加工した PGA不織布(ネオベール@，線維径 1 5ぃ m，. し，その複合化に関する基本技術および組織再生の. グンゼ株式会社，京都)を用いた.. 機序は明らかとされていない.. 軟骨細胞の単離. 播種細胞の足場となる高分子(スカフォールド) には，高い細胞親和性，力学的強度，多子L 性，連通. 5mg/kg，三共まず塩酸ケタミン(ケタラール@， 1. 性，設計した 3次元形状に成形できる加工性，組織. 株式会社，東京)の殿部筋肉注射にて睡眠導入を行. 形成に伴って分解される生体吸収性が要求され. い，次に，ペントパルビタール(ネンブタール@， 2 5. る12 生分解性高分子の中でも特に合成高分子. mg/kg，大日本製薬株式会社，大阪)を用いて静脈. (PGA， PLA，PCLなど)は，力学的強度が高く加. 麻酔を行った.イヌ耳介を切断後，耳介より皮膚，. 工性に優れている.しかし，疎水性であるため，細. 皮下組織，筋肉，軟骨膜を除去し，耳介軟骨を無菌. 胞がスカフォールド内部に浸透しにくく，いったん. 的に採取した.K lagsbrunの方法に準じて 13，採取軟. 浸透した播種細胞はスカフォールドに接着すること. 骨は， 2X2mmの大きさに細切し， 0.3%コラゲネー. なく漏れ出すため，播種効率が低下する点が大きな. ス( c o l l a g e n a s et y p eI I，Wo r t h i n g t o n，Lakewood， NJ) にて酵素処理 (3TC，1 2時間)を開始した.ナ p o r es i z e:3 0 0J . 1 m) を用いてろ過イロンメッシュ ( した後， 10%仔牛胎児血清 ( F e t a lBovineSerum， FBS，Sigma-Aldrich，S t .L o u i s，MO) を含む F 1 2，G i b c o，GrandI s l a n d， 1 2培養液 (Ham'sFNY)を用いて酵素反応を停止させた. Ca++，Mg++ 不含リン酸緩衝液 ( D u l b e c c o ' sp h o s p h a t e b u f f e r e d i b c o，GrandI s l a n d，NY) を用いて，単 s a l i n e，G 離した軟骨細胞を 3回洗浄および遠心 ( 4 C，2 ， 0 0 0 0分)した.細胞数の測定には，色素排除法を rpm，1 用いた. 0.4%トリパンブルー液 ( G i b c o，Grand I s l a n d，NY)を用いて細胞を染色した後，倒立顕微鏡 ( ModelTMS，Nikon，東京)を用いて，血球計. 問題として残されている.一方，天然高分子であるフィプリンは，高い細胞接着性と細胞増殖活性を持つが，力学的強度と加工性の点で劣っている.そこで，これらの弱点を克服するために，両方の高分子を複合化する新技術を開発した. 本研究では，播種細胞の漏出を抑制して播種効率を向上させるための高分子複合化技術について報告し，本法を導入して大動物の異なる移植部位において軟骨組織の再生誘導を試みた.さらに，塩基性線. b-FGF) を複合化高分子(スカ維芽細胞増殖因子 ( フォールド)に組み込むことにより軟骨再生が促進されうる可能性について組織学的に検討した. 材料および方法本研究では，自家移植モデルにおいて軟骨再生を可能とする目的で，天然高分子フィプリンと生分解. 0. 算盤上の細胞数を算定した. 実験 A:異なる移植部位における複合化高分子の有用性(図1). 性合成高分子から構成される複合化高分子を試用し. 細胞・高分子複合体の作成:ピペットにて，イヌ. て自家移植モデ、ルの軟骨再生を試み，異なる移植部. 耳介軟骨細胞を PGA不織布に播種して，細胞・高分. 位における複合化高分子の有用性について検討した. 子複合体を作成した.軟骨細胞の播種濃度は， 100X. (実験 A). さらに，自家移植モデルにおける軟骨再生を促進するための至適技術を開発する目的で，実. 1 06個 /mlに調節した.複合体をインキュベーター内 (3TC， 5%CO 時間静置して，軟骨細胞 2) に 4. 験 Bを行った.実験 Bでは，本モデルに b-FGF徐放. を生分解性高分子に接着させた.. システム 5 を導入して， b-FGFによる軟骨再生の促. 天然高分子フィプリンによる複合化:フィプリン. 進効果と軟骨再生における新生血管の役割について. (ボルヒール只化学及血清療法研究所，熊本)を散.

(3) 2 7 3. 天然高分子と合成高分子を用いた軟骨再生布して，細胞・高分子複合体を複層化した.フィプ. 送気圧を 0.75kgf /cm2 に調整し，複合体から 30cm. リンの散布には，スプレーキット(ボルヒールスプ. 離してフィプリンを散布した.その結果，複合体は，. レーキット，化学及血清療法研究所，熊本)を用い，. 均一な厚さ(約 100~120 ぃm) のフィプリン膜によっ. て複合化された(図 2). また，走査電顕像によって， E x p e r i m e n t al p r o t o c olA. . . . I. ・・ I t .. 着する様子が観察された(図 3). e u g n n. b n. 抑制. r + e. 向+. 一叫. ‘. a. ‘.2. f心. A. 圃園圃惨. Polymer +cell. Group 1. at-. 圃圃争￨令τ令. 国圃. い∞川G阿川》. -企. ノー. Seeding. D唱e s t i o n. Polymer. I. 企企 +cell. Harvest @1，3， 5，1 0咽蜘. 田・・. 4. Groupm. … ‘ ・ .. 筋肉注射による睡眠導入の後，ペントパルビタール 5mg/kg，大日本製薬株式会社， (ネンブタールベ 2. 大阪)による静脈麻酔を行った.移植部位を剃毛し. olymer .. ' 企 P + c e l l +f i b r i ng l u e. 凹，plV. G. 企回1. 複合体の移植:複合化された複合体は，細胞採取を行った同一個体に自家移植した.塩酸ケタミン(ケ 5mg/kg，三共株式会社，東京)の殿部タラール円 1. I n t r a f a s α a li m p l a n t a t i o n. いよパ. 天然高分子フィプリンによる複合化処理を施した後には，合成高分子 PGA内に数多くの播種細胞が接. Subcutaneousi m p l a n t a t i o n. 圃企園。. セー-3. 8tudygroupsbyimplanta tions i t e. ロ伽吋l u e0 . 3剛. 図 1 実験プロトコール A. た後，ポピドンヨード(イソジンベ明治製薬株式会社，東京)にて消毒した.設定した切開線に沿って 1 0万倍希釈エビネプリン添加塩酸リドカイン(エピ. レナミン含有キシロカイン l%E円アストラゼネカ株式会社，大阪)による局所麻酔を行い，皮膚切聞を加えて複合体を移植した.移植部位は，皮下(出径部)および筋膜間(浅および深側頭筋膜の間)の. 2部位を選択した.移植後， 5-0ナイロン縫合糸(シグマ，東京)にて閉創した. 実験群の設定:移植部位および複層化の有無によ図 2 天然高分子フィプリンによる複合化 A:肉眼所見 (Bar=lcm) B:走査電顕像 (Bar=10仲m) B a r=100μm) C :t o l u i d i n eb l u e染色 ( D :t o l u i d i n eb l u e染色(Ba r=1 0 0いm) スプレーキットの使用により，合成高分子 (PGA) は，均一な厚さ(約 100 ~ 120 ぃm) の. ブィプリン膜によって複合化された.. って，次の 4つの実験群を設定した. Group 1 (細胞・高分子複合体を皮下移植した群， n 3 ) 二. GroupI I (複合化した細胞・高分子複合体を皮下移. 植した群， n=3) GroupI I I (細胞・高分子複合体を筋膜聞に移植した. 群， n=3) GroupI V (複合化した細胞・高分子複合体を筋膜聞. f i b r i ng l u e(一). f i b r i ng l u e(+). に移植した群， n=3) 移植した複合体は，移植後，週目. 3週目. 5週日. および 1 0週日に標本採取し，組織学検討および免疫組織学的検討をおこなった. 実験 B :塩基性線維芽細胞増殖因子 (b-FGF) 含有徐放化ゼラチン微粒子が軟骨再生に及ぼす影響(図. 4) ゼラチン微粒子の作成:b-FGF徐放システムでは，生体内分解吸収性高分子微粒子としてゼラチンを使用した .オリーブオイル 5ml (40C) に，あら 0. かじめ作成した 10%ゼ、ラチン水溶液 0.2ml (等電点. 5，牛骨ゼラチン，新田ゼラチン株式会社，大阪) 図 3 細胞・高分子複合体 o l u i d i n eb l u e染色 ( B a r=1 0 0怜m) 上段:t 下段:走査電顕像 ( B a r=1 0いm) 天然高分子フィプリンによる複合化処理を施した後には，合成高分子 PGA内に数多くの播種細胞が接着する様子が観察された .. 加え，静置 (40C， 1時間)した.揖枠後 4 Cで冷 0. 0. 蔵し粒子化したゼラチン周囲に付着したオリーブオイルをアセトンl.5mlにて洗浄した.得られた溶液をフアルコンチューブ (BectonDickinson，Frank. l i nLakes，NJ) に回収し，遠心分離 (4 C，5， 0 0 0 0.

(4) 2 7 4. 和田充弘. E x p e r i m e n t a lp r o t o c o lB. Studygroups. いJバ P叫 mer. ‘. Seeding n凶.....哨. Digestion. G r o u p1. V( bFGF徐放システムおよびフィプリン GroupI. 叫吋. •. 胞・高分子複合体を移植した群， n=3). 国叩. I. GroupI I I (フィプリンによる複合化処理を施した細. I.企企+cell. による複合化の両処理を施した細胞・高分子複合体. C. を移植した群， n=3) 移植した複合体は，移植後 5週日に標本採取し，組織学的検討および免疫組織学的検討をおこなった. 組織学的検討. H a r v e s t C'叫. 採取した標本は 10%ホルマリンで固定し，パラフイン包埋後， 4仲m の厚さで薄切した.切片には，. 図 4 実験プロトコール B. t o l u i d i n eb l u e染色(キシレン: 5分 x3回， 1 0 0% エタノール. rpm， 5分間)を行った.再度，アセトンにて洗浄 0. (4 Cにて 3回洗浄)した後，冷蔵庫内(4 C) で 1 0. 5分間 x5回， 90%エタノール: 3分. 間， 80%エタノール: 3分間，流水水洗および純水. o l u i d i n eb l ue液 :1 5分，水洗，イソプ水洗， 0.05%t. 週間乾燥させ，沈殿物であるゼラチン粒子を得た .. 0秒 x3回，キシレン :1 0分ロピルアルコール :3. 次にゼラチン粒子の架橋を行うため，ゼラチン粒子. 間 x4回)を施し，組織性状および異調染色性(メ. 1mgに対し， 0.1%polyoxyethylene s o r b i t a n. タクロマジー)の有無について検討した.. 25%g lu t a r a l d e h y d eを 5ぃ l 加 monooleateを 1ml，. l a s t i c aVanGieson染色 (70%エタノさらに， E. え，捜枠 ( 4O Cにて 2 4時間)した .溶液を遠心分離. ，レソゃルシン・フクシン液:3 0分間，流ール : 3回. ( 5， 0 0 0rpm， 5分間 ) し，沈査のゼラチン粒子に. 水水洗 : 2分間， 70%エタノール. gl y ci ne溶液を加え，常温にて 1時間撹持した.その. 0分間，流水水洗:1 0分間，のへマトキシリン液:3. 5回，カラッチ. 後，蒸留水を加えて遠心分離 ( 5， 0 0 0rpm， 5分間). ピクリン酸: 3回，ワンギーソン液. を 3回行い，洗浄した . 得られたゼラチン粒子に超. 0秒間 X4回，キシレン:3 0 プロピルアルコール:3. 純水を加え，液体窒素で凍結させた.真空凍結乾燥. 秒間 x7回)を施し，弾性線維および腰原線維につ. を行い，直径約 10μmのゼラチン微粒子を作成し. いて検討した.. た.凍結乾燥したゼラチン微粒子は，エチレンオキサイドガスを用いて滅菌した.. b-FGF徐放システム :b-FGF1 0 0~m ( t r a f e r .. 5分間，イソ. 免疫組織化学染色. b-FGF徐放システムの導入による軟骨再生の促. min，科研製薬，東京)を Ca+ +，Mg+ +不合リン酸. 進効果と血管新生の関係を検討するため，第 8因子. 緩衝液6 0~l ( D u l b e c c o ' s phosphate-b u f f e r e d. illebrandF a c t o r ) の免疫関連抗原 (vWF，vonW. s a l i n e， G i b c o )に溶解した後，ゼラチン微粒子 1 0ぃ. 染色を行った. 10%ホルマリンで固定した標本のパ. gと混和し， 4C下に静置して bFGF含有徐放化ゼ. ラフィン包埋後に， 4仲m の切片を薄切した.脱ノ fラ. 0. ラチン微粒子を作成した .. G i b c o )に0.5mgプロテアフィン後， 1mlの PBS(. 複合体の移植:実験 Aと同様に，シート状に加工し. p r o t e a s eTypeXXIV ，Sigma-Aldrich，S t . ーゼ (. た PGA不織布に，イヌ耳介軟骨より単離した軟骨. Louis，MO) を溶解(室温， 1 0分間)して調整した. 細胞を播種した.さらに， b-FGF含有徐放化ゼラチ. プロテアーゼ溶液にて，タンパク分解酵素処理を行. ン微粒子を複合体へ直接塗布させた後，フィプリン. った.次に， 0.3%過酸化水素加メタノールを用いて，. による複合体の複合化を行った .b-FGF徐放システ. 3 0分間). 一内因'性ペルオキシダーゼを不活化した (. ムを導入して複合化された複合体は，細胞採取を行. 次抗体は，抗ヒト第 V I l 困子関連抗原ウサギポリクロ. った同一個体の浅および深側頭筋膜聞に自家移植し. A0082，DAKOcytometion，C a r p i n t e r . ーナル抗体 (. た.. 1 ，0 0 0倍希釈して反応させた(4C， 8時 i a， CA)を 0. 実験群の設定:b-FGF徐放システムおよびフィ. 間).非標識の一次抗体を検出するため，二次抗体と. プリンを用いた複合化処理の有無によって，次の 4. 0 0倍希釈したビオチン化坑ウサギイムノグロして， 5. 群を設定した.. 4 3 2，DAKO) プリン・ヤギポリクローナル抗体(E0. Group 1 (細胞・高分子複合体を移植した群， n=3 ). を反応させた(室温， 3 0分間).ストレプトアビジン/. GroupI I( bFGF徐放システムを施した細胞・高分. P 0 3 9 7，DAKO)を用いて標識(室ペルオキシダーゼ (. ) 子複合体を移植した群， n=3. 0分間 ) させた後， DAB溶液 ( 組成 : 温， 3.

(5) 天然高分子と合成高分子を用いた軟骨再生. 2 7 5. diaminobenzi d i ne 20mg， 30%過酸化水素水，. 乏しい組織に変化した .組織学的検討から，移植 5. PBS100mJ )にて発色させ(室温. 週目に観察された島状領域は消失していた. 5分間)，へマト. キシリンで核染色した . 統計処理. El as -. t i c aVanGieson染色を用いた組織学的検討より，複合体内部の島状領域は，勝原線維によって置換されていた . Group 1 (細胞・高分子複合体を皮下移. 採取組織の断面 1 0箇所を無作為に選択して，軟骨. 植した群)では，全ての観察時期において，組織学. 様組織および線維性被膜の厚さを測り，その平均 ±. 的に異調染色性は観察されず，軟骨再生は認められ. f a c t o r 標準誤差を求めた .計測したデータは， OneANOVAおよび Kruskal-Wal l ist e s tをf 子った後，多重比較検定 ( P o s t -hoct es t ) を行い，統計学的有意差を検討した .. 結果実験 A: 異なる移植部位における複合化高分子の有用性. D. 皮下移植群 ( Group 1および I I ) における経時的変化 :GroupI I (フィプリンを用いて複合化処理した細胞・高分子複合体を皮下移植した群)では，移植後 5週自において，白色，半透明を呈する，薄い. 情 ' " '. o l u i d i neb l ue染色による軟骨様組織が観察された .t 摘出標本断面における組織学的検討では，移植 1および 3週目において異調染色性は観察されなかったが，移植 5週目(図 5)において，複合体内部に散在性異調染色を示す島状領域が出現した . 島状領域は，細胞形状の異なる大小不同の軟骨細胞によって. 図 6 複合化した細胞・高分子複合体を皮下移植した群(移植 1 0週目)における肉眼所見および組織所見 A:肉眼所見 ( Bar=lcm) r=5 0 0仙m) B :t o l u i d i neb l u e染色(Ba C :El as t i c a Van G i巴son染色(Bar=500 仲. 0週目(図 6)において，構成されていた .移植後 1. m). D :vW F免疫組織化学染色 ( B a r=1 0 0いm) 移植 5週目に観察された島状領域は消失し，複合体内部の島状領域は，謬原線維によって置換されていた.. 採取組織はさらに薄く脆弱となり，支持性が極めて. 日. 1wk. 嗣. 3wk. 5wk. 10wk. 図 5 複合化した細胞・高分子複合体を皮下移植した群(移植 5週目)における肉眼所見および組織所見 A:肉眼所見 (Ba r=lcm) B a r=5 0 0問 1 ) B :t o l u i d i neb l u e染色 ( C :E l as t i c a Van G i e s o n染色(Ba r=5 0 0 いm) D:vW F免疫組織化学染色 (Bar=100μm) 複合体内部に，細胞形状の異なる大小不同の軟骨細胞が認められた .また，散在性異調染色を示す島状領域が認められた .. 」笠9囲網. 1ロn. ー H μ. 図 7 細胞・高分子複合体を筋膜聞に移植した群の肉眼所見および組織所見 B a r=1cm)，t ol u id i n eb l ue染色肉眼所見 ( (Bar=500仲m)，E l as ti c aVanG i e s o n染色 ( Bar=1 0 0I 川 1 ，Bar=100~m) を示す . 移植 3週自において，白色で薄い軟骨様組織が観察された.複合体は全体が強い異調染色性を示し，軟骨形成を認めた .形成された軟骨組織は経時的に厚く変化した ..

(6) 2 7 6. 和田充弘. なかった . これらの結果から，皮下(胤径部)は移植部位として不適切であることが示唆された . P. 筋膜聞に移植した群 ( GroupI I IおよびI V ) におけ. 摘出標本断面における組織学的検討では，移植 l週目において異調染色性を示す島状領域が出現し，複合体内部において部分的な軟骨形成が認められた.. る経時的変化 :Gr oupI I I (細胞・高分子複合体を筋. さらに移植 3， 5， 1 0 週目において，強い異調染色. 膜聞に移植した群，図7)では，移植 3週目におい. 性を示す領域は複合体全体に拡大し，形成された軟. て，白色で薄い軟骨様組織が観察された.軟骨様組. 骨組織は経時的に厚く変化した .移植 3週目以降に. 織は，薄い被膜に覆われていた .t ol u i d i neb l ue染色. おいて，複合体の表層では小型扇平な軟骨細胞が配. による摘出標本断面における組織学的検討では，移. 列し，深層では規則的な柱状配列が認められた . こ. 植 3週目において，複合体全体が強い異調染色性を. の所見は，正常耳介軟骨の組織構造と極めて近似し. 示し，軟骨形成を認めた .複合体の表層に位置する. ていた .El a st icaVanGi eson染色を用いた組織学. 軟骨細胞は，小型で紡錘形の細胞が層状に配列して. 的検討では，移植 l週自において複合体内部に勝原. いた .一方，複合体深部では，軟骨小腔が観察され. 線維を認めた .移植 3週目以降では，Gr oup凹と同. た. また，その中には，大きな細胞質を有する円形. 様に，軟骨組織の形成とともに高分子は分解・吸収. の軟骨細胞が一つないし数個認められた . El a s ti c a. され，勝原線維は著明に減少した .複合体周囲では，. VanGi eson染色を用いた組織学的検討では，移植. 移植 5週目以降に線維性組織の厚さが増加し，新生. 1， 3， 5週目において，新生軟骨の形成とともに. 軟骨組織と密に接触していた .また GroupI I Iおよび. 高分子は分解・吸収された . この経時的変化に伴い，. I Vの両群において，形成された軟骨組織の内部には. 複合体内部に認められた腰原線維は急激に減少し. 弾性線維が認められ，軟骨細胞を取り巻く網状構造. た.複合体周囲では，しだ、いに成熟する線維性組織. として観察された .. が観察された .一方，Gr oupI V (フィプリンを用い. 新生軟骨の定量的評価(図 9 ):標本摘出時期にお. て複合化処理を施した細胞・高分子複合体を筋膜聞. ける軟骨の厚さを検討した . その結果，全ての観察. に移植した群，図 8)では，移植 l週目において，. 時期において， GroupI I Iに比較して GroupI Vの軟骨. 白色で薄く脆弱で，部分的に不透明な軟骨様組織が. 組織は統計学的有意に厚いことが判明した ( p<. 観察された .軟骨様組織は，半透明の薄い被膜に覆. 0 . 01 ).このため，フィプリンを用いて複合化処理を. われていた .移植 3週目では，より支持性の高い軟. 施した細胞・高分子複合体では，軟骨形成が促進さ. 骨膜様組織が観察された .t ol u i d inebl ue染色による. れることが判明した .さらに， GroupI I IおよびI Vにおける軟骨の厚さの経時的変化を比較検討した . その結果，両群において，移植 3週自に比較して移植. 1wk. 1 0 週目の軟骨組織の厚さは有意に増加していた ( p<O. 0 5 ) . 軟骨形成過程における新生血管の関与(図 1 0):血. 3wk. 管系マーカーである von Wi l lebr and Fa c t o r. . .. 5 wk. e•. 9 0 0. ∞ 7 ∞ 6 ∞. 8 10wk. 「ー「. 「ー「. 3wk. 5wk. E 500. '400. ミ. 図 8 複合化した細胞・高分子複合体を筋膜聞に移植した群の肉眼所見および組織所見 B a r=1cm)，t ol u i d i neb l ue染色肉眼所見 ( (Ba r=5 0 0問 1 ) ，El a s ti c aVanGi e s on染色 (Bar=1 00μm，Bar=1 0 0ぃ m) を示す. 移植 1週目において，白色で薄く脆弱で，部分的に不透明な軟骨様組織が観察された .複合体内部には部分的な軟骨形成が認められた.移植 3， 5，1 0 週目において，複合体全体に強い異調染色性を示す領域が認められた.形成された軟骨組織は経時的に厚く変化した .. 3 0 0 2 0 0. ∞. 1. 。 lwk. 10wk pく 0 .0 1 ・・P<0.05 •. 図 9 新生軟骨の定量的評価. GroupI I Iに比較して GroupI Vの軟骨組織は，全ての観察時期において，統計学的有意に厚いことが判明した (p<O.Ol ) .両群において，移植，週目に比較して移植 1 0 週目の軟骨組織 p<0 . 0 5 ) . の厚さは有意に増加していた (.

(7) 2 7 7. 天然高分子と合成高分子を用いた軟骨再生. P o l y m e r+c e l l b F_ G F (一) _ . .. 1wk. (+). e l l+f i b r i ng l u e P o l y m e r+c ( ー). bFGF U'~'. ( + ). $u p e r f l c i al. ・. ︺︺. depzone. 3wk. ， = -. ー士一\ ~司. 5wk 1同 μ m. 図1 0 新生軟骨における新生血管の経時的変化 E l as t ic aVanG i e s on染色(Bar=1 0 0仲m)，右側 :vWF免疫組織化学染色 ( B a r=1 0 0 いm) ( 各 Gro up ) を示す. Gr o upI I Iでは，移植 l週目において，複合体の表層部および深部では，径が大小不同の血 Vでは，管が数多く観察された .一方， GroupI 移植，週目において，複合体の表層部では比較的径が大きい血管が数多く観察されたが，深部では径の小さい血管が少数観察された.. (vWF)の免疫組織化学染色を行い，軟骨再生過程における新生血管の関与について検討した .GroupI I I では，移植 1週目において，複合体の表層部および. -. 100um. 図1 1 筋膜聞に移植した群における肉眼所見および組織所見上段:肉眼所見 ( B a r=lcm) 中断:t ol u id i neb l u e染色 ( B a r=5 0 0ぃ m) 下段:E l a s t i c aVanG i e s on染色 ( B a r=1 0 0. m). 仲. b-FGF徐放システムを施さなかった群 (Group 1および I I I)に比較して，bFGF徐放システムを施した群 ( Gr oupI Iおよび I V ) は薄い被膜に覆われ，厚みおよび支持性が著しく増加していた .組織学的検討では，すべての群において軟骨形成が認められ，複合体周囲には線維性組織が観察された.. 深部では，径が大小不同の血管が数多く観察された.. 胞・高分子複合体における軟骨再生促進作用を検討. 移植 3週目において，複合体では軟骨形成とともに. するため，Gr oupI I I (フィプリンによる複合化処理. 残存する高分子が観察された.軟骨形成部位におい. を施した細胞・高分子複合体を移植した群 ) と. て血管浸潤は認められなかったが，残存高分子の周. Gr oupI V( b-FGF徐放システムおよびフィプリン. 囲では明瞭な血管浸潤を認めた .移植 5週目におい. による複合化の両処理を施した細胞・高分子複合体. て，複合体に形成された軟骨組織を取り囲む薄い線. を移植した群)を比較検討した.その結果， bFGF. 維性組織内に，径の小さな血管が多数観察された .. 徐放システムを施した群 (Gr oupI IおよびI V ) の摘. 一方， Gr oupI Vでは，移植 l週目において，複合体. 出標本は，薄い被膜に覆われていた . また， bFGF. の表層部では比較的径が大きい血管が数多く観察さ. 徐放システムを施さなかった群 (Group1および. れたが，深部では径の小さい血管が少数観察された .. I I I) に比較して，b-FGF徐放システムを施した群. 移植 3週日において，複合体に形成された軟骨を取. (GroupI IおよびI V ) では厚みおよび支持性は著し. り囲む薄い線維組織内に，径の大きな血管が観察さ. く増加していた .t ol u idi neb l ue染色による摘出標本. れた .移植 5週目以降では，厚い線維性組織の周囲. 断面における組織学的検討では，すべての群におい. に，径の大きな血管からなる血管網が認められた .. て複合体全体に強い異調染色性が観察され，軟骨形. いずれの実験群においても，軟骨組織内には明らか. 成が認められた . El a s ti ca VanGieson染色を用い. な血管形成は認められなかった .. た組織学的検討では，すべての群において複合体周. 実験 B :塩基性線維芽細胞増殖因子 ( b-FGF)含有. 囲に線維性組織が観察された .. 徐放化ゼラチン微粒子が軟骨再生に及ぼす影響. 複合体の軟骨組織性状(図 1 2 ) :すべての群におい. b-FGF徐放化システムによる軟骨再生促進作用. て，複合体の表層では小型肩平な軟骨細胞が層状配. ( 図1 1):細胞・高分子複合体における b-FGF徐放. 列していた . また，深層では軟骨小腔が観察され，. システムによる軟骨再生促進作用を組織学に検討す. その内部に大型，円形の軟骨細胞が規則的な柱状配. るため， Gr oup 1 (細胞・高分子複合体を移植した. 列を示していた .bFGF徐放システムを施さなかっ. 群)と Gr oupI I( b-FGF徐放システムを施した細. た群 (Group 1および I I I)に比較して， bFGF徐放. 胞・高分子複合体を移植した群)を比較検討した .. システムを施した群 (GroupI IおよびI V ) では細胞. また，フィプリンを用いて複合化処理を施した細. 密度が高い傾向を示した . これらの結果から，正常.

(8) 2 7 8. 和田充弘. ふ￨ . . . ‘ D I : l ー . l r z 開 ιI -. b F G F. (+). (一). G 附置. P o l y m e r+c e l l. c;. ( + ). (一). G r o u pI. ，て~‘。、必. -...・-=‘. P o l y m e r+c e l l+f i b r i ng l u e. P o l y m e r+c e l l b F G F. G r o u pn. b F G F (一). ( + ). G r o u pm. G r o u pW. nm~. 、 ‘ ・ * -・ゐ. P o l y m e r+c e l l +f i b r i ng l u e. 、マ、. P J Z 1 11 喜多番-三、. 1 旦比旦. l. 図1 2 複合体の軟骨高田裁性状(El a s t i c aVanGi e s o n. 染色 ( Bar 1 0 0ぃ m) ) すべての群において，複合体の表層では小型扇平な軟骨細胞が層状配列していた . また，深層では規則的な柱状配列を示していた. b FGF徐放システムを施さなかった群 ( Group Iおよび1 I l)に比較して，bFGF徐放システムを施した群 ( GroupI IおよびI V ) では細胞密度が高い傾向を示した .. -. '00μm. 図1 3 新生軟骨における新生血管(移植 5週目) 上段:E l a s t i c aVanGi e s on染色 (Bar=1 0 0 いm ) 下段 :vWF免疫組織化学染色 ( Bar 1 0 0 いm). 二. 二. b-FGF徐放システムを施さなかった群 (Gr o up 1およびI I I) では，複合体を取り囲む線維性組織の内部もしくは外部に，比較的径の小さな血管からなる血管網が形成されていた.一方， bFGF徐放システムを施した群 ( Gr ou pI Iおよび I V) では，複合体を取り囲む線維性組織の周囲に，明らかに径の大きい血管からなる血管網の形成が観察された .. 表1. s tudygr o u p s. t h i c k n e s s ( μ m ). e l l 2 2 6 .4 : t2 1 .8 寸.寸 G r o u p1: PGA十c G r o u pI: PGA+c e l l+b F G F 1 15 8 . 6土3 1 .7 . . J 1 * G r o u pI I: PGA+c e l l + f i b r ing l u e 6 5 8 . 8土4 1 .9 ..J G r o up IV :PGA+c e l l + b F GF+f i br ing l u e1 1 1 6 .4: t9. 0 . . J. ， .. Val ue sweregi vena smean: tS.E . .. *P<O.Ol. I I (フィプリンによる複合化処されていた .GroupI 理を施した群)において観察された血管は， Group. 1 (細胞・高分子複合体を移植した群)に比較して， FGF徐放システやや大きな血管径を有していた .bGroupI IおよびI V ) では，複合体をムを施した群 ( 取り囲む線維性組織の周囲に，明らかに径の大きい. 耳介軟骨と同様な組織構造を示す軟骨再生は可能で. 血管からなる血管網の形成が観察された .再生軟骨. あり，b-FGF徐放システムの導入によって，再生誘. 組織内では，いずれの実験群においても明らかな血. 導過程を著しく促進できうることが判明した.. 管網の形成は認められなかった .. 新生軟骨の定量的評価(表1) :各実験群における. 考察. 軟骨の厚さを比較検討した .その結果， b-FGF徐放システムを施さなかった群 (Group 1およびII)に. 本研究では，播種細胞の漏出を抑制して播種効率. 比較して b-FGF徐放システムを施した群 (Group. を向上させるため，生体吸収性の合成高分子 (PGA). I IおよびI V) では，統計学的有意に厚い軟骨組織が. と天然高分子(フィプリン)を複合化する技術を開. 形成されることが判明した ( p<O.01).また，ブイ. ，発した .生体吸収性合成高分子として， PGA. プリンによる複合化処理を施さなかった群 (Group. PLLA， PCLなどが広く知られている .特に PGA. I) に比較してフィプリンによる複合化処理を施し. は，高い力学強度と細胞接着性を示し，早い分解・. GroupI I I)では，統計学的有意に厚い軟骨組た群 (. 吸収によって優れた生体適合性を有している.この. 織が形成されることが判明した ( p<0. 01).しかし，. ため，小動物を用いた種々の 3次元組織の再生誘導. b-FGF徐放システムを施した GroupI Iと Group. 実験において，理想的な支持体として応用されてい. I Vの聞には，軟骨組織の厚さにおいて統計学的有意. る.しかし，大動物を用いた自家移植モデルでは，. 差は認められなかった.. vonWillebrandFactor (vWF) の免疫組織化学. PGA含有量と炎症反応の強さは正の相闘を示し，惹起された強い炎症反応によって，軟骨組織の再生誘. 染色を用いた新生血管の関与(図 1 3 ):b-FGF徐放. 導は阻止されることが近年報告された 14 そこで本. システムを施さなかった群 (G roup 1およびI I I)で. 0mg と低く設定し，軟骨研究では， PGA含有量を 2. は，複合体を取り囲む線維性組織の内部もしくは外. の再生誘導過程の初期に生ずる炎症反応を抑制し. 部に，比較的径の小さな血管からなる血管網が形成. 7 こ..

(9) 天然高分子と合成高分子を用いた軟骨再生. 2 7 9. 一方，天然高分子としては，コラーゲン，ヒアル. 反応のないヌードマウスを用いたこれらの小動物異. ロン酸，フィプリンなどの生体内組織が知られてい. 種移植実験では，移植初期におけるフィプリンの炎. る.この中で，フィプリンは，血液凝固機序として. 症反応や組織再生への関与について，詳細に調べる. 生ずるフィブリノーゲンとトロンビンによるフィプ. ことは困難であった.本研究では，フィプリンをス. リン形成作用を利用している.フィプリンは，注入. カフォールドとして使用せず，至適量のフィプリン. 充填が可能なハイドロゲルスカフォールドとして有. . 3ml/高分子)をスプレー散布し (フィプリン量:0. 用であり，すでに 3次元培養用スカフォールドとし. て合成高分子を被覆した後，大動物に自家移植した.. i s s u ee n g i n e e r i n gに用いて試用されている.一方， t. このフィプリンによる複合化処理によって，移植早. るスカフォールドは，種々の形状への成形が可能で. 期から軟骨再生誘導が生じ，厚い軟骨が形成された.. あり，その複雑な 3次元形状が生体内で維持されな. これらの結果から，大動物もしくはヒトにおいて軟. くてはならない.ブイプリンは，生体内分解速度が. 骨組織の再生誘導を行う上で，フィプリンによる複. 数日. 数週間と早い特徴がある.そのため単一のス. 合化処理は極めて有用な方法であると考えられた.. カフォールドとして試用する場合，物理的強度の不. 今後，本技術の導入により，スカフォールドに最適. 足，短い吸収期間，体積減少などの問題点を補う必. な 3次元形状を持たせ，同時に，天然高分子によっ. 要がある.そこで本研究では，フィプリンの欠点を. て播種細胞の播種効率や増殖・分化に配慮、した高性. 補う目的で合成高分子と組み合わせて複合化した.. 能スカフォールドの作成が可能となることが示唆さ. 複合化された高分子では，合成高分子の支持性によ. れた.. りスカフォールドの 3次元構造が維持され，その表. 血管網の発達は，軟骨形成に密接に関連している. 面をフィプリンで被覆することによって，生体親和. と考えられるが，これまで再生誘導された軟骨にお. 性，細胞接着性，細胞増殖促進活性などの付加が可. ける血管網の形成過程を明らかにした報告は認めら. 能となった.. れない.内軟骨性骨化では，通常，骨形成の前段階. この場合，合成高分子に強固に天然高分子を固定. として，間葉系組織から軟骨細胞が分化し軟骨形成. 化する技術，さらには固定化した天然高分子機能を. が生ずる.間葉系組織には毛細血管網が多数分布し. 充分に発揮できる固定化の手段が必要と考えられ. ているが，軟骨分化に先立つて血管網は退縮し，無. る.本研究では，合成高分子表面にフィプリンを強. 血管の軟骨性骨原基が形成されることが報告されて. 固に固定する目的で，スプレーキットの送気圧を. いる 18 軟骨性原基が形成された後には，血管侵入を. 0 . 7 5kg f / cm に調整してフィプリンを散布した.こ. 阻止する種々の抑制因子 (ChM1，TIMPなど)が. の結果，合成化高分子 PGAを，均一な厚さ(約. 放出され，周囲に発達した血管網があるにも関わら. のフィプリン膜によって強固に複合. ず，軟骨は無血管に保たれることが知られてい. 化することが可能となった.また，天然高分子ブイ. る19-21 骨化する際には，血管新生の抑制因子と促進. プリンによる複合化処理を施すことにより，播種細. 因子のバランスは変化し，主に肥大軟骨細胞から発. 2. 100~120 J . . L m). 胞はスカフォールドから漏れ出すことなく，高濃度. 現される促進因子 (VEGF)によって，軟骨性原基は. の細胞接着が可能となった.. onW i l l e b r a n dF a c t o r 骨へ置換する 2口本研究の v. フィプリンによる生体炎症反応および組織再生に及ぽす影響に関する報告は様々であり，一定の見解. (vWF) を用いた免疫組織化学的検討から， t i s s u e e n g i n e e r i n gによって再生誘導した軟骨において. a l l e r sらの報告によると，フィプリを見ていない.H. も，同様な血管網の形成過程が生じると考えられた.. ンは生体炎症反応を遷延させ，反応の終息後には厚. すなわち，移植早期には大小不同の新生血管が複合. い線維性被膜が残存すると報告した 15 一方， M u r i r p o l yO a c t i c c o g l y c o l i c a c i d ))に ahらは， PLGA( nv i t r oにおいフィプリンを含浸させて複合化し， i. 体内部に形成されるが，軟骨形成に伴い複合体内部の新生血管は退縮する.その後，形成された軟骨の内部に新生血管は存在しないが，軟骨を取り巻く厚. て軟骨の再生誘導を試みた.その結果，複合化処理. い線維性組織の周囲には，径の大きな新生血管網が. によって，軟骨の再生誘導過程が促進されることを. 形成される機序が示唆された.また，フィプリンを. 報告した 16 さらに，同様の方法を用いて，移植実験. 用いて複合化処理を施した細胞・高分子複合体では，. (ヌードマウス)を行ったところ，移植 2週目で炎症. 移植後早期から軟骨周囲に明瞭な新生血管網が形成. 反応は生じることなく，軟骨形成が認められたと報. された.フィプリンによる血管誘導作用については. 告した 17 この結果から，フィプリンによる複合化処. 極めて興味深いと考えられ，今後検討していく予定. 理によって，生体炎症反応は生じず，軟骨再生誘導. である.. が促進されることが示唆された.しかし，免疫応答. 本研究では，塩基性線維芽細胞増殖因子 ( b-FGF).

(10) 2 8 0. 和田充弘. を複合化高分子(スカフォールド)に組み込むこと. 複合体を移植した群)の聞には，軟骨組織の厚さに. により軟骨再生が促進されうる可能性について組織. おいて統計学的有意差は認められなかった.この理. ， i nvivo環境下に長期学的に検討した. b-FGFは. 由として， b-FGF徐放システムに用いるゼ、ラチン微. 間，安定して供給するため，生体吸収性高分子であ. 粒子の物質性状の関与が考えられた.ゼラチン微粒. e l i v るゼラチンを用いた薬物送達システム (drugd. 子は，含水ゲルの性質を持つためゲル膜を形成する.. erysystem，D DS) を応用した.ゼラチンは，グル. そのため，合成高分子の表面はゼ、ラチンゲル膜で被. タールアルデヒドを用いて化学架橋させ分解速度を. 覆され，フィプリン膜と同様の組織再生効果が促進. 調整した.次に， b-FGFをゼラチンに含侵させて b. 的に生じたと推測された.. FGF含有徐放ゼラチン微粒子を作成した.これま. 一般に，軟骨は間葉細胞が軟骨芽細胞に分化する. での研究から，等電点 9_5で正電荷を持つ b-FGF. ことによって発生する.軟骨芽細胞は増殖・分化し，. と，等電点 5 _ 0で負電荷を持つ酸性ゼラチンは静電的. その結果，軟骨基質と軟骨間質が産生される.軟骨. に相互作用して収着するため， b-FGFはゼラチンに. 芽細胞は，しだいに細胞間質によって 1個ずつ取り. 固定化されることがわかっている 24ペまた，ゼラチ. 固まれ，軟骨小腔と呼ばれる区画の中に閉じこめら. ンに固定化された b-FGFの徐放は，ゼラチンの分. れる.こうして成熟した細胞は軟骨細胞と呼ばれ，. i t r o 解速度に一致することが報告されている 26 Inv. その機能は軟骨基質の維持とされている 33 一方，間. において，軟骨細胞増殖を促進する b-FGF濃度は 1 0ng/mlと報告されている 27， 28 一方， Tabataら24. 葉細胞は線維芽細胞にも分化し，これが軟骨を包む軟骨膜を形成する.軟骨膜の構造については，層構. 血管新生が認められることを報告した.そこで本研. 造が 1層とするものから 3層とするものまで様々な報告がみられる 34-40 軟骨膜には，軟骨芽細胞に分化. 究では，軟骨細胞増殖作用と新生血管誘導作用を同. しうる軟骨形成細胞が存在する.軟骨形成細胞は，. 時に引き出すため， b-FGF濃度は 1mg/mlに設定. 軟骨芽細胞に分化し軟骨の付加成長に関与する.こ. した.. れまで t i s s u eengineeringによって再生誘導された. は， b-FGF濃度を 1mg/mlとしたときに最も強い. 軟骨再生において細胞増殖因子として働く. b -. 軟骨の成長に関する報告はない.現在，再生軟骨の. FGFは，同時に，強力な血管新生因子として機能す. 周囲を覆う軟骨膜様線維性組織内に軟骨芽細胞が存. ることが知られている 24. 血管新生には，組織血流. 在しうる可能性について検討している.また，今後，. の回復に寄与しない未熟な新生血管と組織血流の回. 成長を可能とする軟骨再生を行うため，軟骨膜を再. 復に寄与する成熟した「機能的」新生血管があるこ. 生誘導する技術開発が重要であると考えている.. とが知られている 31 b-FGFは，血管内皮細胞と血. 本研究では，自家移植モデルにおいて軟骨の再生. 管平滑筋に同時に働き，これらを増殖させ，さらに，. 誘導を試みた.生体吸収性の合成高分子と天然、高分. VEGF， HGFの両因子の発現を調節して血管新生. 子を複合化処理する技術にか FGF徐放システムを. をおこす.この b-FGFによって誘導される血管は，. 組み合わせて生体内に導入することによって，軟骨. 通常の血管新生 angiogenesisによって形成される. 再生誘導を促進し，再生軟骨組織を栄養する機能的. 血管よりも，さらに太く，裏打ち構造のある，比較的構造の整った血管と考えられている 29-32 実験 B. 血管を同時誘導する効率的な手法を確立することが. において b-FGF徐放システムを施した群 (Group. 元形態を特徴とするヒト耳介形状軟骨の再生誘導を. I IおよびI V ) では，再生軟骨組織は著しく厚く変化. 予定している.. していた.また，複合体を取り囲む線維性組織の周囲に，明らかに径の大きい血管からなる発達した血管網の形成が観察された.この組織学的検討結果から， b-FGFは軟骨組織の増殖因子のみでなく，機能的血管を誘導する強力な血管新生誘導因子として作用したと考えられた.このことは， b-FGFが組織還流能を持つ機能的血管の形成を促進する，とするこれまでの報告と一致した.また，実験 B において， b-FGF徐放システムを施した群 GroupI I (b-FGF. 徐放システムを施した細胞・高分子複合体を移植し V(b-FGF徐放システムおよびフィた群)と GroupI. プリンによる複合化の両処理を施した細胞・高分子. できた.今後，本法を応用して，薄くて複雑な 3次. 謝. 辞. 本稿を終えるにあたり，御指導，御校閲を賜りました磯貝典孝教授に深謝いたします.. 文献 1 .V a c a n t iJP，MorseM A，S a l t z m a nW M，DombA， J P e r e z A t a y d eA，L a n g e rR ( 1 9 8 8 )S e l e c t i v ec e l lt r a n s -. p l a n t a t i o nu s i n gb i o a b s o r b a b l ea r t i f i c i a lp o l y m e r sa s 3 :3 9 m a t r i c e s . JP e d i a t rS u r g2 2 . CaoY，V a c a n t iJP，P a i g eKT，Upton， JV a c a n t iCA ( 1 9 9 7 )T r a n s p l a n t a t i o no fc h o n d r o c y t e su t i l i z i n gap o l y m e r c e l lc o n s t r u c tt op r o d u c et i s s u e e n g i n e e r e dc a r t i l a g ei nt h es h a p eo fahumane a r .P l a s tR e c o n s t rS u r g.

(11) 天然高分子と合成高分子を用いた軟骨再生. 1 0 0 :2 9 7 3 0 2 3 .I s o g a iN， KusuharaH，I k a d aY， OhtaniH， ] a c q u e t， R H i l l y e r， ] LowderE，L a n d i sWJ ( 2 0 0 6 ) Comparisono f d i f f e r e n tc h o n d r o c y t e sf o ru s ei nt i s s u ee n g i n e e r i n go f c a r t i l a g emodels t r u c t u r e s .T i s s u eEng1 2 :6 9 1 7 0 3 i g a s h iT，IkadaY，M o r i t aS， 4 .I s o g a iN，AsamuraS，H H i l l y e rJ ， J a c q u e tR，L a n d i sW]( 2 0 0 4 )T i s s u ee n g i n e e r i n go fana u r i c u l a rc a r t i l a g emodelu t i l i z i n gc u l t u r e d c h o n d r o c y t e p o l y( L I a c t i d e e p s i l o n c a p r o l a c t o n e )s c a f f o l d s .T i s s u eEng1 0 :6 7 3 6 8 7 5 .I s o g a iN，MorotomiT，HayakawaS，MunakataH， Tabata Y，I k a d a Y，K a m i i s h iH ( 2 0 0 5 ) Combined c h o n d r o c y t e c o p o l y m e ri m p l a n t a t i o nwiths l o wr e l e a s e o fb a s i cf i b r o b l a s tgrowthf a c t o rf o rt i s s u ee n g i n e e r i n g t . ]BiomedMaterRes ana u r i c u l a rc a r t i l a g ec o n s t r u c 7 4 :4 0 8 4 1 8 a c a n t iMP， AminuddinBS，]acksonMJ， 6 . Kamil5H，V VacantiCA，EaveyRD ( 2 0 0 4 )T i s s u ee n g i n e e r i n go fa humans i z e dandshapeda u r i c l eu s i n gam o l d .L a r y n g o s cope1 1 4 :8 6 7 8 7 0 a c q u e tR，Hi l Iy e rJ，LowderE，L a n d i s 7 . KusuharaH，] s o g a iN ( 2 0 0 8 )T i s s u ee n g i n e e r i n gamodelf o rt h e WJ，I shape，morphologyand humane a r :Assessmento fs i z e， gene e x p r e s s i o nf o l l o w i n gs e e d i n go fd i f f e r e n tc h o n d r o c y t e s . WoundR e p a i rRegen( a c c e p t e d ) 羽TengY，ChangCN，V a c a n t iM A， 8 . SaimAB，CaoY， VacantiCA，EaveyRD ( 2 0 0 0 )E n g i n e e r i n ga u t o g e n o u s c a r t i l a g ei nt h eshape o fah e l i xu s i n g ani n j e c t a b l e h y d r o g e ls c a f f o l d .L a r y n g o s c o p e1 1 0 :1 6 9 4 1 6 9 7 a c a n t iJP ( 2 0 0 4 )T i s s u ee n g i 9 .S h i e hS J，TeradaS，V n e e r i n ga u r i c u l a rr e c o n s t r u c t i o n :i nv i v oandi nv i t r o s t u d i e s .B i o m a t e r i a l s2 5 :1 5 4 5 1 5 5 7 BauerSB，Soker5， Yoo]]，R e t i kAB( 2 0 0 6 ) 1 0 . AtalaA， T i s s u e e n g i n e e r e da u t o l o g o u sb l a d d e r sf o rp a t i e n t s n e e d i n gc y s t o p l a s t y .L a n c e t3 6 7 :1 2 4 1 1 2 4 6 MaPX，TanelRE ， I s o g a iN， 1 1 . ShinokaT，Shum-TimD， LangerR，V a c a n t i]P，Mayer]EJ r( 1 9 9 8 )C r e a t i o no f v i a b l epulmonarya r t e r ya u t o g r a f t sthrought i s s u ee n g i 3 6 5 4 5 n e e r i n g . JThoracC a r d i o v a s cSurg1 1 5・5 Vunjak-NovakovicG， BironR]， E a g l e sDB， 1 2 . FreedLE， LesnoyDC，BarlowSK，L a n g e rR ( 1 9 9 4 )B i o d e g r a d a b l e polymers c a f f o l d sf o rt i s s u ee n g i n e e r i n g .B i o t e c h n o l o g y 1 2 :6 8 9 6 9 3 1 3 .K l a g s h u r nM ( 1 9 7 9 )L a r g e s c a l ep r e p a r a t i o no fc h o n d r o c y t e s . MethodsEnzymol5 8 :5 6 0 5 6 4 2 0 07)ヒト耳介形状軟骨の再生誘導における 1 4 . 森贋政 ( PGA-P (LA-CL) ポリマーの有用性.近畿大医誌3 2:2 3 3 2 4 1 a n s e n JA，Marres HA，R a k h o r s t G， 1 5 .H a l l e r s EJ，J VerkerkeGJ( 2 0 0 7 )H i s t o l o g i c a la s s e s s m e n to ft i t a n i u m and p o l y p r o p y l e n ef i b e rmeshi m p l a n t a t i o nw i t h and w i t h o u tf i b r i nt i s s u eg l u e . JBiomedMaterResA 8 0: 3 7 2 3 8 0 KimSH， I d r u sRB， KhangG ( 2 0 0 8 )F i b r i n 1 6 .S h a ' b a nM， andp o l yO a c t i c c o g l y c o l i ca c i d )h y b r i ds c a f f o l dp r o motese a r l yc h o n d r o g e n e s i so fa r t i c u l a rc h o n d r o c y t e s :. 2 8 1. 1 7 ani nv i t r os t u d y . JOrthopSurg3・3 2 0 0 8 ) 1 7 . MunirahS，KimSH，RuszymahBH，KhangG ( The u s eo ff i b r i n and p o l yO a c t i c c o g l y c o l i ca c i d ) h y b r i ds c a f f o l df o ra r t i c u l a rc a r t i l a g et i s s u ee n g i n e e r i n g :ani nv i v oa n a l y s i s . EurC e l lMater1 5 :4 1 5 2 lmannR， F e i n b e r gRN，L a t k e rCH，Sasse]，R i s a u 1 8 . HaI W ( 1 9 8 7 )R e g r e s s i o no fb l o o dv e s s e l sp r e c e d e sc a r t i l a g e t .D i f f e r d i f f e r e n t i a t i o nd u r i n gc h i c kl i m bdevelopmen e n t i a t i o n3 4 :9 8 1 0 5 n o u eH，IyamaK，KamizonoA，O c h i a iM， 1 9 .H i r a k iY，I ShukunamiC， I i j i m aS， S u z u k iF， KondoJ( 1 9 9 7 )I d e n t i f i c a t i o no fchondromodulin1a san o v e le n d o t h e l i a lc e l l .P u r i f i c a t i o nandi t sl o c a l i z a t i o ni nt h e growthi n h i b i t or io lChem a v a s c u l a rzoneo fe p i p h y s e a lc a r t i l a g e . JB 2 7 2 :3 2 4 1 9 3 2 4 2 6 u d h a l t e r， JL angerR ( 1 9 9 0 )I d e n t i f i c a 2 0 . MosesM A，S t i o no fani n h i b i t o ro fn e o v a s c u l a r i z a t i o nfromc a r t i・ l a g e .5 c i e n c e2 4 8 :1 4 0 8 1 4 1 0 u z u k iF，His aT，Taka 2 1 . OhbaY，GotoY，KimuraY，S 1 9 9 5 )P u r i f i c a t i o no f an an h a s h i K，Takigawa M ( g i o g e n e s i si n h i b i t o rfromc u l t u r emediumc o n d i t i o n e d l byahumanc h o n d r o s a r c o m a d e r i v e dc h o n d r o c y t i cc eI l i n e，HCS-2/8. BiochimB i o p h y sActa1 2 4 5( l ):1 8 l s e nBR( 2 0 0 5 )M u l t i p l er o l e so fv a s c u l a r 2 2 .Z e l z e rE，O e n d o t h e l i a lgrowthf a c t o r (VEGF) i ns k e l e t a ld e v e l o p e p a i r .C u r rTopDevB i o l6 5 :1 6 9 ment，growth，andr 1 8 7 Mamluk， RF e r r a r aN， JohnsonRS， S c h i p a n i 2 3 .Z e l z e rE， E， O l s e nBR( 2 0 0 4 )VEGF Ai sn e c e s s a r yf o rc h o n d r o c y t e s u r v i v a ld u r i n gboned e v e l o p m e n t . Development1 3 1 : 2 1 6 1 2 1 7 1 i j i k a t a S，I k a d aY ( 19 9 4 ) Enhanced 2 4 . Tabata Y，H v a s c u l a r i z a t i o nandt i s s u eg r a n u l a t i o nbyb a s i cf i b r o b l a s tgrowthf a c t o ri m p r e g n a t e di ng e l a t i nh y d r o g e l s .J C o n t r o lR e l e a s e3 1 :1 8 9 1 9 9 1 9 9 8 )P r o t e i nr e l e a s efromg e l a 2 5 . TabataY，IkadaY ( t i nm a t r i c e s . AdvDrugD e l i vRev3 1 :2 8 7 3 0 1 k a d aY ( 1 9 9 9 )B i o d e g r a d a t i o n 2 6 . TabataY，NaganoA，I o fh y d r o g e lc a r r i e ri n c o r p o r a t i n gf i b r o b l a s t growth f a c t o r .T i s s u eEng5 :1 2 7 1 3 8 a c a n t i M，Weng Y， 2 7 .A r e v a l o S i l v a CA，Cao Y，V V a c a n t i CA，Eavey RD ( 2 0 0 0 )I n f l u e n c eo f growth f a c t o r sont i s s u e e n g i n e e r e dp e d i a t r i ce l a s t i cc a r t i l a g e . ArchO t o l a r y n g o lHeadNe c kSurg1 2 6 :1 2 3 4 1 2 3 8 a c a n t iM，Ro 2 8 .A r e v a l o S i l v aCA，CaoY，WengY，V a c a n t iCA，EaveyRD( 2 0 01 ) Thee f f e c to f d r i g u e zA，V f i b r o b l a s t growth f a c t o r and t r a n s f o r m i n g growth f a c t o r b e t a on p o r c i n e c h o n d r o c y t e s and t i s s u e e n g i n e e r e da u t o l o g o u se l a s t i cc a r t i l a g e .T i s s u eEng7: 8 1 8 8 ，YonemitsuY，YamashitaA，5 a t aS，T a n i i 2 9 . Masaki1 M，KomoriK，NakagawaK，HouX，NagaiY，Hasegu e i s h iK ( 2 0 0 2 )A n g i o g e n i cgene awaM，SugimachiK，S t h e r a p yf o re x p e r i m e n t a lc r i t i c a ll i m bi s c h e m i a :a c c e l e r a t i o no fl i m bl o s sbyo v e r e x p r e s s i o no fv a s c u l a re n d o t h e l i a lgrowthf a c t o r1 6 5b u tn o to ff i b r o b l a s tgrowth.

(12) 2 8 2. 和田充弘. f a c t o r 2 .C i r cR e s9 0 :9 6 6 9 7 3 3 0 . OnimaruM，YonemitsuY，T a n i iM，NakagawaK， Masaki1 ， OkanoS， I s h i b a s h iH， S h i r a s u n aK， Hasegawa u e i s h iK ( 2 0 0 2 )F i b r o b l a s tgrowthf a c t o r 2gene M，S t r a n s f e rcans t i m u l a t eh e p a t o c y t egrowthf a c t o re x p r e s . s i o ni r r e s p e c t i v eo fh y p o x i a . m e d i a t e dd o w n r e g u l a t i o n i ni s c h e m i cl i m b s .C i r cRes9 1:9 2 3 9 3 0 1 . Yo n e n i t s u Y，S u e y o s h iK ( 2 0 0 4 ) FGF2r e g u l a t i n g 3 m u l t i p l ea n g i o g e n i cf a c t o r si nh i e r a r c h i a l mode o f a c t i o n . JJ pnC o l lA n g i o l4 4 :1 5 1 1 5 6 19 9 9 )B i o d e g r a d a t i o n 3 2 . TabataY，NaganoA，IkadaY ( o fh y d r o g e lc a r r i e ri n c o r p o r a t i n gf i b r o b l a s t growth .T i s s u eEng5 :1 2 7 1 3 8 f a c t or 3 3 .V i c t o rP .E r o s c h e n k o ( 2 0 0 0 )d iF i o r e ' sA t l a so f H i s t o l o g yw i t hF u n c t i o n a lC o r r e l a t i o n s. n i n t he d i t i o n i p p i n c o t tW i l l i a m s& W i l k i n s，p4 4 Canada，L a r n e i r o1 .Contopoulos AN ( 19 7 7 ) 3 4 .J u n q u e i r a LC，C a s i ch i s t o l o g y( 2 n dE D ) . LosA l t o s，Lange C a r t i l a g e，B M e d i c a lP u b l i c a t i o n spp1 1 1 1 1 8 1 9 8 0 )O s t e o l o g y，G r a y ' s 3 5 . Wi 1 liamsP W，Warwick R ( Anatomy ( 3 6 t hED ) ， Edinburgh，C h u r c h i l lL i v i n g s t o n e， pp2 4 5 2 5 2. 19 9 3 )P a t h 3 6 .S h i nDH，MarkEJ，SuenHC，G r i l l oHC( o l o g i cs t a g i n go fp a p i l l a r y carcinoma o ft h et h y r o i d w i t hairwayi n v a s i o nbasedont h eanatomicmannero f 1i n i c o p a t h o l o g i cs t u d y e x t e n s i o nt ot h et r a c h e a :a c basedon2 2p a t i e n t swhounderwentt h y r o i d e c t o m yand airwayr e s e c t i o n . HumP a t h o l2 4 :8 6 6 8 7 0 3 7 . Lopez Aguado D，Monserrat JR，P e r e zP i n e r o B， u t i e r r e zR，D i a zF l o r e sL ( 1 9 9 2 ) CamposB a n a l e sME，G Ne o c h o n d r o g e n e s i si nt h es e p t a la r e aa f t e rsubmucous c a r t i l a g i n o u sr e s e c t i o n . ActaO t o l a r y n g o l1 1 2 :5 3 9 5 4 4 a s t a c a l d iP， YormukE， J u h l i n 3 8 .E n g k v i s t0，SkoogV，P R( 1 9 7 9 ) Thec a r t i l a g i n o u sp o t e n t i a lo ft h ep e r i c h o n driumi nr a b b i te a randr i b . Ac o m p a r a t i v es t u d yi n 7 5 v i v oandi nv i t r o . ScandJP l a s tR e c o n s t rSurg1 3・2 2 8 0 1 9 7 9 ) R e c o n s t r u c t i o n o f p a t e l l a r 3 9 .E n g k v i s t 0 ( a r t i c u l a rc a r t i l a g ew i t hf r e ea u t o l o g o u sp e r i c h o n d r i a l g r a f t s . Ane x p e r i m e n t a ls t u d yi nd o g s . ScandJP l a s t R e c o n s t rSurg1 3 :3 6 1 3 6 9 1 9 8 3 )Thee a r l ydevelopment 4 0 .O h l s e nL，WidenfalkB ( o fa r t i c u l a rc a r t i l a g ea f t e rp e r i c h o n d r i a lg r a f t i n g ScandJP l a s tR e c o n s t rSurg1 7 :1 6 3 1 7 7.

(13)