口腔癌化学療法の効果および副作用のリアルタイムPCR法を用いた評価法の検討

口腔癌化学療法の効果および副作用のリアルタイム

PCR法を用いた評価法の検討

著者

森川 秀広

口腔癌化学療法の効果および副作用の

リアルタイムPCR法を用いた評価法の検討

(許局番号13672077)

平成1 3年度∼平成14年度科学研究費補助金

く基盤研究(C)(2))研究成果報告書

平成15年3月

研究代表者 森川秀広

(東北大学大学院歯学研究科)

口腔癌化学療法の効果および副件用の

リアルタイムPCR法を用いた評価法の検討

(課題番号13672077)

平成1 3年度∼平成1 4年度科学研究費補助金

(基盤研究(C)(2))研究成果報告書

平成15年3月

研究代表者 森川秀広

(東北大学大学院歯学研究科)

次 はしがき 研究組織 研究経費 研究発表 研究成果 1 3 3 4 7

はしがき はじめに,本研究は,文部科学省科学研究費補助金,基盤研究(C)(2), 課題番号13672077の援助を得て行ったものであることを記して,ここ に謝意を表する. 口腔痛に対する癌化学療法の効果判定法は,従来より,化学療法後 2 -4週を経た時点での腫癌の縮小率,切除標本における病理組織学的効 果, NO 症例における後発リンパ節転移の頻度あるいは長期生存率等に より行われてきた.しかし,術前化学療法として化学療法の効果を期待 する場合,癌化学療法の効果が不十分であったり,骨髄抑制等の副作用 が著明であったりすること等により手術の直前になって,手術日程の変 更が余儀なくされ,そのしわ寄せが他の患者にも及び,各々の患者の治 療計画を大幅に変更せざるを得ない場合がしばしば経験される.特に, 術前化学療法を必要とする症例の腫癌切除術においては,一般に,組織 の切除量が大きい場合が多く,血管柄付き遊離皮弁等により再建する機 会が多いことから,手術の準備が大がかりとなり,手術直前の日程変更 は,患者およびその家族,さらには治療に関わる医療従事者の大きな負 担となる.このような場合,主治医としては,なぜもっと早い時点で術 前化学療法の効果や副作用を予測できなかったのかと自責の念に駆られ るのが常である. 本研究の目的は,口腔癌の術前癌化学療法の開始から手術までの間に, 腫癌組織から穿刺吸引した腫癌細胞や末梢血中の細胞から mRNA を抽 出し, cDNAを作製,抗癌剤による腫癌紳胞のアポトーシスを誘導する ことが知られているタンパクの mRNAや末梢血中の細胞が発現してい る骨髄細胞の分化,増殖に関わるタンパクや免疫担当細胞のアポトーシ スに関与するタンパクの mRNAの発現パt9-ンや発現量をリアルタイ ム RT-PCR法を用いて解析し,癌化学療法の効果や副作用の程度をリ アルタイムで評価するシステムを確立することである.このような癌化 学療法の効果および副作用の評価法の報告はこれまで成されておらず, これが実現すれば口腔癌患者の治療を円滑に進め,且つ癌化学療法に伴 う危険性を軽減することに大きく貢献できると考える. 本研究の結果については,本報告書の中で述べたいと思うが,今回の 限られた研究期間を考慮すれば,満足できる結果が得られたと思う.

本研究の成果は,東北大学大学院歯学研究科顔面口腔外科学分野,宮

下 仁先生,東北大学大学院歯学研究科顎外科攻合形成学分野,篠原文

明先生,国立仙台病院歯科口腔外科,佐藤 敦先生,山崎慎司先生,友

一1-寄泰樹先生をはじめ多くの方々の尽力によるものである.心から御礼を

申し上げる.

ー2-研究組織

研究代表者: 森川秀広 (東北大学大学院歯学研究科,助手) 研究分担者: 森 士朗

千葉雅俊

虞谷拓章

研究協力者: 宮下 仁

篠原文明

佐藤 敦

山崎慎司

友寄泰樹

(東北大歯学部附属病院,講師) (東北大学大学院歯学研究科,助手) (東北大歯学部附属病院,助手)

(東北大学大学院歯学研究科)

(東北大学大学院歯学研究科)

(国立仙台病院) (国立仙台病院) (国立仙台病院)

研究経費

平成13年度: 2,100千円(直接経費) 平成14年度: 1.500千円(直接経費) 計    3,600千円

ー3-研究発表

論文発表

1. Hitoshi Miyashita, Shiro Mori, Naoko Tanda, Kentaro

Nakayama, Atsuko Kanzaki, Atushi Sato, Hidehiro Morikawa, Katutoshi Motegi, Yuji Takebayashil, Manabu Fukumoto: Loss of heterozygosity of Nucleotide Excision Repair Factors in Sporadic Oral Squamous Cell Carcinoma Using Microdissected

Tisuuse. OncoI Rep 8: 1133-1138, 2001.

2. 佐藤 敦,友寄泰樹,山崎慎司,森 士朗,森川秀広,山口 泰: 口 腔京平上皮癌におけるcyclinDl, p16, cyclindependentkinase4, RB protein, Ki67 およびα-catenin の発現.東北大歯誌 20(1):17-26, 2001. 3. 森川秀広, 森 士朗, 篠原文明,他: 口腔京平上皮癌細胞にお ける癌化学療法によるアポトーシスの誘導.東北大歯誌 20(1):35-40, 2001. 4. 森川秀広,森 士朗,佐藤 敦,松田耕策,一迫 玲,他: 上顎 歯肉癌患者にみられた頚部リンパ節炎型トキソプラズマ症の1例. 日本口腔外科学会雑誌47 : 420-423, 2001.

5. Hitoshi Miyashita, Yuji Takebayashi, Yasutaka Nitta, Atsushi

sato, Hidehiro Morikawa, Fumihiro Fujimori, Arita Ohashi,

James F. Eliason, Katutoshi Motegi, Manabu Fukumoto, Shir°

Mori, Takafumi Uchida: Uridine Phosphorelase is a potential

prognostic factor in oral squamous cell carcinoma. Cancer

94: 2959-2966, 2002.

6. Hitoshi Miyashita, Yasutaka Nitta, Shir° Mori, Atsuko Kanzaki,

Kentaro Nakayama, Kunihiko Terada, Toshihiro Sugiyama,

Hiroshi Kawamura, Atsushi Sato, Hidehiro Morikawa,

Katutoshi Motegi, Yuji Takebayashi: Expression of

Copper-Transporting P-type Adenosine Triphosphatase (ATP7B) as a

_4-Chemoresistance Marker in Human Oral Squamous Cell Carcinoma Treated with Cisplatin. Oral Onco1 39(2):157-162,

2003.

講演発表

1.森川秀広,森 士朗,佐藤 敦,篠原文明,越後成志:口腔京平上 皮癌の組織化学的診断と頚部後発転移との関連一初回治療時 NOであ った症例について- (2C-205)第25回日本頭頚部腫癌学会. 2001年 6月 21-22日 札幌 2.篠原文明,森川秀広,森 士朗,橋元 亘,越後成志,山崎慎司, 佐藤 敦:口腔京平上皮癌の化学療法によるアポトーシスの誘導一抗 ssDNA抗体法とTUNEL法の比較検討- (P-04)第25回日本頭頚部 腫癌学会. 2001年6月 21-22日 札幌 3.佐藤 敦,森 士朗,山崎慎司,森川秀広,山口 泰   口腔癌 の遺伝子解析研究におけるインフォームド･コンセントの問題点 (P-71).第25回日本頭頚部腫疲学会.2001年6月21-22日 札幌 4.森川秀広,篠原文明,森 士朗,橋元 亘,越後成志:口腔癌化学 療法による骨髄抑制のリアルタイムでの評価法の検討(Al-ト1) 第46回日本口腔外科学会総会. 2001年10月25-26日 鹿児島 5.佐藤 敦,森 士朗,山崎慎司,森川秀広,山口 泰:口腔癌遺伝 子解析研究の倫理ガイドラインにおける問題点(P3-3-4) 第46回 日本口腔外科学会総会. 2001年10月25-26日 鹿児島 6.宮下 仁,新田康隆,後藤 哲,佐藤修一,長坂 浩,佐藤 実,川 村 仁,森 士朗,森川秀宏,佐藤 敦,竹林勇二: ATP7B is a cisplatin based chemoresistance marker in human oral squamous cellcarcinoma(2F-256)第26回 日本頭頚部腫癌学会

2002年6月13-14日 千葉

7.森川秀広,鈴木博美,谷口貴洋,村中淳哉,高橋正任,橋元 亘, 森 士朗,越後成志: 術前癌化学療法により重篤な副作用を生じた

-5-口腔癌の1例(2F-277) 第47回日本口腔外科学会総会.

2002年10月 31日-11月1日   札幌

-6-研究成果

本研究の目的は,口腔癌の術前癌化学療法の開始から手術までの間に, 腫癌組織から穿刺吸引した腫癌細胞や,末梢血中の紳胞から mRNAを 抽出し, cDNAを作製し,抗癌剤による腫癌細胞のアポトーシスを誘導 することが知られているタンパクの mRNAや末梢血中の細胞が発現し ている骨髄紳胞の分化,増殖に関わるタンパクや免疫担当細胞のアポト ーシスに関与するタンパクの mRNA の発現パターンや発現量をリアル タイム RT-PCR法を用いて解析し,癌化学療法の効果や副作用の程度 をリアルタイムで評価するシステムを確立することである.平成13年 度においては,ボランティアより採血した末梢血を用いて, in vitroの 系でのシスプラチンや5-FU等の抗癌剤処理前後の末梢血単核球細胞か ら mRNAを抽出し, cDNAを調整,アポトーシス関連タンパクに対応 したプライマーの選択および RT-PCR法の技術的問題点の検討等を行

なった.その結果, Fas, Ba∑, Caspase-2, 3, 8, 9等のアポトーシ

ス促進タンパクの mRNAの発現が増強した症例が認められた一方で, Bc1-2, Bcl-Ⅹし, C｣AP2, ⅩIAP等のアポトーシス抑制蛋白の mRNA の発現が増強した症例も認められた.以上より, in vitroの系で化学療 法の前後の抹消血細胞におけるアポトーシス関連タンパクの mRNAの 発現を RT-PCR法により検討を行ったところ, Fas介在性アポトーシ スの経路を介する介さないに関わらず,抗癌剤処理が,末梢血細胞にお けるアポトーシス関連タンパクの mRNAの発現に影響を及ぼすことが 明らかとなった.平成14年度は,癌化学療法の開始から手術に至る過 程の口腔癌患者の腫癌本体から,穿刺吸引により腫癌細胞の採取を行い, さらに臨床検査用に採血された末梢血の血球成分より免疫担当細胞を調 整し,アポトーシス関連タンパクあるい は細胞分化,増殖因子等の mRNA の発現量や発現パターンを検討中であり,さらに得られたデー タと,患者の臨床経過および手術時の切除標本における抗癌剤の病理組 織学的効果との比較検討を試みているところである. また近年, 5-FUの分解における律速酵素であるDihydropyrimidine dehydrogenase (DPD)が, 5-FU の感受性との関連に興味が寄せら れていることに着目し,腫療細胞中のDPD活性が高ければ5-FUの抗 腫癌効果は低く,腫癌細胞中のDPD活性が低ければ5-FUの抗腫疲効 果は高くなり,逆に,人体の正常細胞中の DPD活性が高ければ 5-FU の人体に対する副作用は軽く,人体の正常紳胞中の DPD活性が低けれ ば5-FUの人体に対する副作用は重くなるという仮定のもとに,口腔癌 一7_

の術前化学療法開始前の生検標本および採血した末梢血より,腫療細胞

中および末梢血単核球紳胞中のDPDのmRNAを抽出し, DPD活性を リアルタイム RT-PCR法を用いて解析する事も検討中であり,さらに DPD活性をELISAや radioenzymaticassayなどでも測定し, mRNA との関連も解析していく予定である. 以上,これまで本研究課題において,我々が得た研究成果の概要を述 べたが,さらに,これらの研究成果を論文としてまとめ次項以後に示し たので御参照頂ければ幸いである.

-8-Ⅰ. 口腔癌化学療法による骨髄抑制のリアルタイム

での評価法の検討

癌化学療法の副作用にはいろいろあるが,その治療は,副作用が 出現した段階で対症療法的に施行するかあるいは予防的に最初から 薬物投与などを行っているのが現状で,その副作用がいつ出現し, どの程度なのか,あるnはいつ軽快するのかについては明確に予測 できない状態である.しかし,癌化学療法の副作用の程度をリアル タイムで評価し,予測し得るシステムを確立することができれば, 口腔癌患者の治療計画をより円滑に進め,かつ癌化学療法に伴う危 険性を軽減することに少なからず責献できると考えた. そこで我々は,術前化学療法を施行中の口腔癌患者より経時的に 採血し,末梢血中の細胞が発現している骨髄系細胞の分化･増殖に 関わるタンパクや免疫担当細胞のアポトーシスに関するタンパクの mRNAの発現をRT-PCR法を用いて解析し,癌化学療法の副作用の 程度をリアルタイムで評価するシステムが確立できないかと考えた. 今回は,その前段階として,ボランティアより採血した末梢血を用 いて, in vitroの系で抗癌剤によって刺激した免疫担当細胞のアポ トーシスに関するタンパクの mRNAの発現を RT-PCR法を用いて 解析し,副作用の経時的な評価が可能かどうか検討した.

実験材料

実験材料は,健常成人ボランティアより末梢血を40-50ml採血 し,比重遠心法にて単核球を分離･回収し, 2時間preculture後に 回収した非接着性末梢血単核球紳胞(非接着性pBMC)とした. CDDPおよび5･FtJによるPBMCのアポトーシスの誘導

まず, PBMC (1×106cells/ml)をCDDPおよび5-FU (0.01-100 LLg/ml)で, 12, 24, 48, 72時間処理後,実際にアポトーシスが 起っているのかを FITC ラベルの Annexin Vで染色後, FACScan にて解析した. 図1左がcDDP刺激によるもの,図1着が5-FU刺激によるもので, CDDPでは24時間刺激, 10〟g/mlを境としてアポトーシスが誘導 されており, 5-FUでは, 48時間刺激, 10〝g/ml以上でアポトーシ スが誘導される傾向が認められた. アポトーシス誘導および抑制タンパク アポトーシス誘導の経路は図2に示した他にも様々あるが,今回 は,図2のごとく, Fas を介する経路,ミトコンドリア経路, TNF レセプターを介する経路に関して,アポトーシス誘導タンパクとし

てFas, Caspase-2, 3, 8, 9およびBaxを,抑制タンパクとしてBc1-2,

BcトⅩし, IAP群をターゲットとして, mRNAの解析を行った.

実験方法および結果

方法は, PBMCを図1のアポトーシスが生じる時間および濃度を 参考に,10〝g/mlのCDDPおよび5-FUで24時間刺激した後mRNA を抽出し,表1のような条件でRT-PCRを施行した. まず,細胞表面に発現するFasに関して検討した. PBMCを各抗 癌剤で24時間刺激後, pBMC表面のFasの発現をFACScanにて, FasのmRNAの発現の変化をRT-PCRでみたところ,図3左のよう に, 24時間刺激ではまだFasのタンパクの発現は認められていな いが,タンパクの発現に先行して,図3着のように mRNA レベル ではコントロールと比較して抗癌剤によってFasの mRNAの発現 の増強が認められた. 次に, RT-PCRによるアポトーシス促進タンパクのmRNAの解析

結果を示す.図4のごとく Bax, Caspase-2,3,8,9とも枠で囲んだド ナーのPBMCにおいて,コントロールに比べて各mRNAの発現の 増強が認められた. 一方,発現が減少すると思われたアポトーシス抑制タンパクも, 図5のように枠で囲んだドナーのPBMCにおいて,コントロール に比べてBcト2, Bcl-Ⅹし, 土AP-2, Ⅹ-IAPのmRNAの発現の増強が 認められた.

考察

In vitroの系で,抗癌剤で刺激したPBMCを用いアポトーシス関 連タンパクのmRNAの発現をRT-PCR法を用いて解析したところ,

アポトーシス促進タンパクであるFas, Ba又, Caspse-2, 3, 8, 9の

mRNAの発現が増強した例が認められ,一方で,アポトーシス抑 制タンパクであるBc1-2, BcトⅩし, IAP-2, Ⅹ-IAPのmRNAの発現 が増強した例も認められた.以上より, in vitroの系で癌化学療法 の前後のPBMCにおけるアポトーシス関連タンパクのmRNAの発 現をRT-PCR法により検討を行ったところ, Fas介在性アポトー シスの経路を介する介さないに関わらず,抗癌剤処理が,末梢血細 胞におけるアポトーシス関連タンパクのmRNAの発現に影響を及 ぼすことが明らかとなった. また, mRNA による副作用の経時的な評価が可能かどうかとい う点では, RT-PCRの手技上の問題の解決,ハード面の充実, man powerの確保,およびインフォームドコンセントの問題の解決など をクリヤーしていけば可能性も見えてくるのではないかと思われる. 現在,さらに症例を増やして検討を加え,実際の口腔癌患者の腰 癌本体から,穿刺吸引により腫癌細胞の採取を行い,また,臨床検 査用に採血された末梢血の血球成分より免疫担当細胞を調整し,ア ポトーシス関連タンパクあるいは細胞分化,増殖因子等のmRNA の発現量や発現パターンを検討中であり,さらに得られたデータと,

患者の臨床経過および手術時の切除標本における抗癌剤の病理組織

図1 ; CDDPおよび5-FUによるPBMCの

アポトーシス(Annexin V)誘導

* Actinomycin D

0  0.01 0.1 1 10 100

Conc. ( FLg/mI)

図2 ; Apoptosis Signals GranzymeB

0               0               0 6 4 2 ( % ) S [ p 3 ( + ) ^ u ! X a u u V O I J )         O L r 7           0 3 2 2 1 ( % ) S ニ a U ( + ) > u ! X a L J u V

表1 ; RT-PCR条件

アニーリング

温度

55℃ ; C-lAPl, i-lAPZ, XlAP

60℃

64℃

8 -actin

Caspase-3, Bcト2 65℃ ; Fas 69℃ ; Caspase-2, 8, 9, Bax, BcトXL

サイクル数:35

検出プライマー: (秩)日本遺伝子研究所に合成依頼

図3 ; PBMC表面でのFasの発現とFasのmRNAの発現

mRNA(RT-PCR)

cont. CDDP  5-FU CDDP+5-FU (1 0FLg/ml) (1 0FLg/ml) (各1 0LLg/ml) PBMC (l X1 06 cells/ml)を各抗癌剤にて24時間処理後､ FITCラベルのCD95で染色し､ FACScanにて解析 1 2 3 4 1 : control 2: CDDP 3: 5-FU 4: CDDP + 5-FU

( %

)

S ニ a U ( + ) ( S 6 凸 U ) S e j 0       0       0 6         4         2 0

図4 ;アポトーシス促進タンパクのmRNAの比較

Donor A Donor B Bax Casp-2 Casp-3 Casp-8 Casp-9 8 -actin Donor C Donor D 1 2 3 4  1 2 3 4  1 2 3 4  1 2 3 4

(l:control, 2:CDDP, 3:5-FU, 4:CDDP+5-FU)

堅_5 ;アポトーシス抑制タンパクのmRNAの比較

Donor A Donor B Donor C

Bcト2

BcトXL

-C-lAPl

C-[APZ

XIAP

β -actin 1 2 3 4 1 2 3 4  1 2 3 4

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