TitleInterleukin-1 and 6-induced calcium channelcurrent modulation in MC3T3-E1 cellsAuthor(s), Journal, (): -URLhttp://hdl.handle.net/10130/3405Right

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Title Interleukin‑1β and 6‑induced calcium channel current modulation in MC3T3‑E1 cells

Author(s) 小林, 弘史 Journal , (): ‑

URL http://hdl.handle.net/10130/3405

Right

氏名 小林 弘史

学位 博士（歯学）

学位記番号 第２０２７号（甲 第１２６１号）

学位授与年月日 平成２６年 ３月３１日 学位授与の要件 学位規則第４条第１項 論文審査委員 主査 井上 孝 教 授

副査 柴原 孝彦 教 授 副査 末石 研二 教 授 副査 田﨑 雅和 教 授 副査 東 俊文 教 授

学位論文名 Interleukin-1 and 6-induced calcium channel current modulation in MC3T3-E1 cells

学位論文内容の要旨

１．研究目的

インターロイキン(lL)は骨組織に対して骨形成を促進または抑制することが報告されており、特に炎症性 サイトカインと呼ばれる IL-1や6 は過剰分泌によって骨芽細胞などを介した骨吸収を起こすことが知ら れている。

骨芽細胞は骨形成機能だけでなく破骨細胞分化に必須な因子の産生機能も有しており、骨代謝の中心的 な役割を果たしている。骨芽細胞にはIL-1や6の受容体が存在し、ILが骨のリモデリングに関与してい ることが報告されているが、その分子メカニズムは明らかになっていない。

電位感受性カルシウムチャネル(VSCCs)は細胞内カルシウムイオンの濃度調整だけでなく細胞分化や増 殖、酵素活性の調整、遺伝子発現の調整など様々な作用が知られており、近年では骨芽細胞にVSCCsが存 在することが報告され、その働きが注目されている。しかしIL-1と6による骨芽細胞のVSCCsへの働き については明らかにされていない。

そこでこの研究では、骨芽細胞におけるIL-1 と6のVSCCsに対する作用について検討した。

２．研究方法

マウス培養骨芽細胞(MC3T3-E1)に全細胞膜記録型パッチクランプ法を適用し、電位固定法で膜電位を－

80mV に固定し、＋10mVへの脱分極刺激を与えることにより、全細胞膜を流れるカルシウムイオン電流 (I^Ca)を記録しVSCCs電流とした。本実験は細胞外液のCa²⁺をBa²⁺に置換し、I^Caに代わりバリウム電流(I^Ba) を記録した。電位刺激はアクソン社コンビュータ・ソフトウェア「pCLAMP ver 10」 を用い、ヘカ・エ

レクトロン社増幅器「L/M-EPC7」を介して細胞に与えた。イオン電流の解析は「pCLAMP ver 10」で行 った。IL- と6について50pM、500pM、5nM、50nMの4種類の濃度を、それぞれ謹流液を介して投 与し、その前後のVSCCs電流の変化について調査した。

３．研究成績および考察

IL-1および6は、灌流後VSCCs電流の促進を認めた。IL-1は50pMで22.8±4.0% (n=5)、500 pMで 21.7±2.0% (n=6)、5nMで34.1±3.9% (n=6)、50nMで56.7±5.1% (n=3)の促進が認められ、濃度依存性 に促進することが明らかとなった。IL-6でも50pMで15.8±2.7% (n=10)、500pMで22.9±4.5% (n=7)、

5nMで35.6±4.0% (n=8)の促進が認められ濃度依存性の促進を示すものの、50nMでは21.9±3.4% (n=3) の抑制を認めた。IL-1および6の5nMでは120秒間の灌流直後からVSCCs電流の促進が起こり、灌流 停止後は徐々に電流値の回復を示した。IL-6の50nMでは120秒間の灌流の問、徐々にVSCCs電流の抑 制が起こり、灌流停止後は速やかに電流値の回復を示した。電流電圧曲線にてIL投与前後を比較すると、

IL-1および6の5nM、IL-6の50nM 共通して+20mVで最大活性を示し、IL-1、6共にVSCCsの電位 感受性機能に変化をもたらさないことが判明した。

４．結論

IL-1は骨芽細胞に対して50pMから50nMにおいて濃度依存的にVSCCsを促進することが明らかにな った。またIL-6は、50pMから5nMにおいてVSCCsを促進し、50nMで抑制することが明らかになった。

最終試験の結果の要旨および担当者

報 告 番 号 甲 第１２６１号 氏 名 小林 弘史

最終試験担当者

主 査 井上 孝 教 授 副 査 柴原 孝彦 教 授 末石 研二 教 授 田﨑 雅和 教 授 東 俊文 教 授

最終試験施行日 平成２５年１１月 ６日

試 験 科 目 歯科矯正学

試 験 方 法 口頭試問

試 験 問 題 主題ならびに関連問題

結 果 の 要 旨

本審査委員会は主題ならびに関連問題について最終試験を行った結果、十分な学識を 有することを認め、合格と判定した。

学位論文審査の要旨

本研究は、インターロイキン（IL）のマウス前骨芽細胞 cell line（MC3T3-E1）に対する直接的な影響 を骨芽細胞の電位感受性カルシウムイオンチャネル（VSCCs）に注目し、パッチクランプ法を用いて検討 したものである。その結果、IL-1βにおいては濃度依存性にVSCCsの促進を認めた。またIL-6において は50 pMから5 nMにおいて濃度依存性にVSCCsを促進し、50 nMでは抑制を示した。

本審査委員会は、平成25年11月6日に行われ、まず小林弘史大学院生より論文内容の説明がなされた。

その後、各審査委員から本論文に対し次のような質問があった。1)IL 濃度の妥当性について、2)灌流方法 について、3)細胞分化度の程度について、4)高濃度ILによる細胞毒性の有無について。これらに対して1) 参考論文によるとIn vitro研究におけるIL濃度は、本研究の500 pM〜5 nMに相当し、50 pM〜50 nM の濃度設定は妥当なものと考えられる。2)2 mlのIL溶液を120秒かけて灌流投与しており、VSCCsのpeak 値が投与前の値に回復するまで記録を続けた。3)cell lineを定められた方法に従い培養したため、本研究に おける継代による細胞性質に変化はないと判断した。4)50 nMの濃度は本研究において妥当であると考え るが、仮に高濃度の設定だったとしても、灌流投与停止後にpeak値が投与前の値まで回復しており、細胞 毒性はないものと考えられる。と概ね適切な回答が得られた。IL濃度の妥当性や、より明快な考察となる よう追加記載を行うこと、実験対象を正確に表現した題名への変更や実験状況の説明、論文形式の整理な どの修正点が指摘され、後日修正を行った。また本研究に対しての今後の展望として、VSCCsの特定や細 胞内シグナルの特定についての検討等の提案がなされた。

以上より、本研究で得られた結果は今後の歯学の進歩、発展に寄与するところ大であり、学位授与に値 するものと判定した。