IRUCAA@TDC : 口腔粘膜上皮下組織から多能性幹細胞の単離と培養法の確立

Posted at the Institutional Resources for Unique Collection and Academic Archives at Tokyo Dental College,

Available from http://ir.tdc.ac.jp/

Title

口腔粘膜上皮下組織から多能性幹細胞の単離と培養法の

確立

Author(s)

佐竹, 良之; 比嘉, 一成; 松村, 真太郎; 山根, 源之;

島﨑, 潤

Journal

歯科学報, 113(5): 509-515

URL

http://hdl.handle.net/10130/3206

Right

抄録：口腔粘膜上皮下組織から多分化能を持った間

葉系幹細胞の分離・培養法を確立し，培養上皮シー

ト作製に使用するフィーダー細胞の代替細胞として

の有用性を検討した。口腔粘膜の上皮下組織から単

離した細胞をメチルセルロース内で培養した。増殖

した細胞はフローサイトメーターで間葉系幹細胞

マーカーを発現し，骨芽細胞，脂肪細胞，軟骨細胞

への分化を示した。また，培養上皮シート作製への

応用のため，口腔粘膜上皮下細胞をフィーダー細胞

として上皮シートを作製したところ，透明性の高い

重層化した上皮シートが作製できた。培養上皮シー

トの免疫染色においても従来の培養方法で作製した

シートと同様の染色像を示した。口腔粘膜上皮下組

織から単離増殖した細胞は多分化能を示し，上皮

シート作製に必要なフィーダー細胞としても有用で

あると考えられた。

緒 言

様々な組織に存在する間葉系幹細胞は，骨芽細

胞，脂肪細胞，軟骨細胞などへ分化可能な多能性幹

細胞であり，組織の恒常性の維持や創傷治癒過程で

重要な働きをしていると考えられている

１−３）

。近年

この間葉系幹細胞の中には，胚葉を超えて神経や皮

膚（外胚葉），肝臓（内胚葉）の細胞へ分化可能な幹細

胞が存在することが報告され

４）

，口腔領域でも歯髄

由来や口腔粘膜由来の幹細胞の報告もされるように

なった

５−７）

。口腔粘膜を利用した臨床応用として，

我々は以前から眼表面再生のため，口腔粘膜上皮

シートを作製・移植を行ってきたが

８）

，これ以外の

口腔粘膜を利用した臨床応用の報告は少ない。我々

はこれまでに顎骨再生の細胞源の一つとして，口腔

粘膜組織から間葉系幹細胞に類似した細胞の分離を

行ってきた

９）

。分離した細胞には骨芽細胞，軟骨細

胞，脂肪細胞へ分化可能な細胞が含まれており，さ

らに神経堤由来細胞や神経細胞のマーカーがすでに

発現している細胞が含まれていることが解ってき

た。しかし，多分化能を持った幹細胞であることを

示すには単一細胞から分化誘導して解析を行う必要

がある。

今回我々は口腔粘膜由来間葉系幹細胞をより詳し

く検討するため，単離培養法を確立するとともに，

臨床への一つの応用として，培養上皮シート作製時

に共培養を行っているフィーダー細胞の代替えとし

ての有用性についても検討した。

材料および方法

ヒト口腔粘膜組織の採取はヘルシンキ宣言を遵守

し，東京歯科大学市川総合病院の倫理委員会の承認

（受付番号４１）を得て行った。口腔粘膜は患者の齲歯

処理と口腔内の洗浄による衛生管理をおこなった

後，耳下腺開口部を避けた第１，第２臼歯部頬粘膜

を８mm 生検トレパン（KAI Industries Co）で 採 取

した。得られた口腔粘膜組織は抗生剤入り（５μg/ml

ゲンタマイシン（Wako），０．

２５

μg/ml アンフォテリ

シン B）DMEM/F１２

（Invitrogen）ならびに PBS（−）

で洗浄後，１．

２U/ml Dispase Ⅱ（Roche，３７℃，１時

原 著

口腔粘膜上皮下組織から多能性幹細胞の単離と培養法の確立

佐竹良之

１）２）＊）

比嘉一成

１）２）＊）

松村真太郎

１）３）

山根源之

１）３）

島

潤

１）２） キーワード：間葉系幹細胞，口腔粘膜，培養上皮シート， フィーダー細胞，多分化能 １）_{東京歯科大学口腔科学研究センター hrc８} ２）_{東京歯科大学市川総合病院眼科} ３）_{東京歯科大学オーラルメディシン・口腔外科学講座} ＊）_{共同筆頭者} （２０１３年５月３１日受付） （２０１３年７月２９日受理） 別刷請求先：〒２７２‐８５１３ 千葉県市川市菅野５−１１−１３ 東京歯科大学市川総合病院眼科 比嘉一成 ５０９ ― ２５ ―

間）処理で口腔粘膜培養上皮シート作製用に上皮を

剥離し，残った口腔粘膜上皮下組織から２mg/ml

Collagenase（Wako，３７℃，一昼夜）処理により口腔

粘膜上皮下細胞を分取した。

口腔粘膜上皮下細胞の単離と培養

細胞を単離し培養するため，口腔粘膜上皮下細

胞（８０００個/ml）を０．

８％メ チ ル セ ル ロ ー ス（Sigma

Aldrich），１０％牛胎児血清存在下 DMEM

培地（In-vtrogen）で培養した。１∼２週間培養後，単 一 細

胞から増殖した細胞塊を実態顕微鏡下でマイクロ

ピペットを用いて分取し，１０％牛胎児血清存在下

DMEM 培地で接着培養にて増殖させた。細胞の継

代 は TripLE（Invitrogen，３７℃，７分）で 剥 離 し，

１０％牛胎児血清存在下 DMEM 培地で洗浄した後，

２．

５×１０

３

cell/cm

２

の 密 度 で１０％牛 胎 児 血 清 存 在 下

DMEM 培地中に播種し，３７℃，５％CO２存在下で

培養した。４∼６継代目において以下の実験に使用

した。

フローサイトメトリー

口腔粘膜上皮下細胞は TripLE（３７℃，７分）で剥

離し，１０％牛胎児血清存在下 DMEM 培地で洗浄し

た。回収した口腔粘膜上皮下細胞は，４％パラホル

ムアルデヒド溶液で固定し，０．

１％アジ化ナトリウ

ム（Wako）添加 PBS（−）で洗浄後，１×１０

６

_{個/ml の}

濃度で各種マーカー（表１）を４℃，３０分反応させ

た。必要に応じて２次抗体を４℃，３０分反応させ，

フローサイトメーター（XL, Beckman Coulter）で測

定し，解析ソフト（FlowJo，トミーデジタル）にて

解析した。

分化誘導

口腔粘膜上皮下細胞の多分化能を確認するため，

４継代目の細胞を分化誘導培地（Lonza 社）で３週間

培養し，骨芽細胞，軟骨細胞，脂肪細胞への分化誘

導を行った。軟骨細胞への分化誘導においては２．

５

×１０

５

個の口腔粘膜上皮下細胞を遠心によりペレッ

トにし，１５ml チューブを用いて３次元的に培養し

た。分化誘導の確認は，骨芽細胞ではアルカリフォ

スファターゼ（Roche）とアリザリンレッド（Wako），

脂肪細胞ではオイルレッド O（Sigma Aldrich），軟

骨細胞では軟骨ムチ ン を 染 色 す る サ フ ラ ニ ン O

（Chroma）の染色性で比較した。

家兎口腔粘膜上皮シート作製と組織学的解析

家兎口腔粘膜組織から１．

２U/ml DispaseⅡ

（Roche，

３７℃，１時間）処理により口腔粘膜上皮を剥離し，

０．

０５％ Trypsin-EDTA（Invitorogen，３７℃，１０分）に

て口腔粘膜上皮細胞を分離した。上皮細胞は先に報

告したように市販されている生体組織接着剤（BOL-HEAL，化血研）の４０mg フィブリノーゲン，０．

１８U

トロンビンを７．

５ml 生理食塩水で希釈した混合液を

３００

μl コートしたインサート（Coster Corning）上に

播種し

１５）

_{，下層の培養皿には４μg/ml マイトマイシ}

ン C（Sigma Aldrich，３７℃，２時間）処理したマウス

表１ フローサイトメトリーで使用した抗体 １次抗体 クローン アイソタイプ 会 社 名 Adhesion molecules

CD４４ hyaluronate receptor ２C５ Ms-IgG２a R&D Systems, Inc. CD１４６ MCAM １２８０１８ Ms-IgG１ R&D Systems, Inc. CD１６６ alcam １０５９０２ Ms-IgG１ R&D Systems, Inc. Hematopoietic

markers

CD１４ LPS receptor RMO５２ Ms-IgG２a-FITC IOTest

CD３４ Hematopoietec stem cell marker ５６３ Ms-IgG１-PE Becton Dickinson CD４５ leukocyte antigen ２D１ Ms-IgG１ R&D Systems, Inc.

Others

CD７３ ５ -terminal nucleotidase AD２ Ms-IgG１-PE Becton Dickinson CD９０ Thy-１ Rhy-１A１ Ms-IgG２a R&D Systems, Inc. CD１０５ endoglin １６６７０７ Ms-IgG１ R&D Systems, Inc. STRO-１ bone marrow stromal cells, erythroid

precursors and dental pulp Stro-１ Ms-IgGM R&D Systems, Inc. ２次抗体 FITC-conjugated anti-Mouse IgG Donkey Jackson

５１０ 佐竹，他：口腔粘膜上皮下組織から間葉系幹細胞の分離

由来のフィーダー細胞（NIH３T３細胞）もしくは口

腔粘膜上皮下細胞から作製したフィーダー細胞と共

培養した。２週間後インサートのメッシュごとシー

トを O. C. T. compound（Sakura）に包埋し，凍結切

片を作製した。両シートの組織切片は H-E ならび

に免疫染色を行った。

免疫染色

２％パラホルムアルデヒド溶液（４℃，５分）で固

定した家兎口腔粘膜上皮シートの組織切片を，それ

ぞれの一次抗体，ケラチン３（AE５，１／１０００，Pro-gen），ケ ラ チ ン４（６B１０，１／３０，Progen），Ⅳ 型

コラーゲン（polyclonal goat IgG，１／３００，Southern

Biotec），p６３

（４A４，１／５０，SantaCruz）を 室 温９０

分反応させた後に，二次抗体（FITC，Rhoda mine

または Cy３標識抗体，Jacks または Chemicon）室

温３０分反応させた。核染染色は４

,６-diamidino-２-phenylindole（DAPI，室温５分）を用いて染色した。

染色した組織は退色防止封入剤（Fluoromount/Plas,

Diagnostic

BioSystems）で封入し，蛍光顕微鏡（Ax-ioplan２ imaging, Carl Zeiss）を用いて観察した。

結 果

口腔粘膜上皮下細胞の単離・培養と解析

ヒト口腔粘膜上皮下組織から単離増殖させた細胞

の５継代または６継代目においてフローサイトメ

トリーでの解析を行ったところ，間葉系幹細胞で

認 め ら れ る CD４４

（９９．

０％），CD７３

（９９．

３％），CD９０

（９９．

２％），CD１０５

（９１．

９％），CD１４６

（１１．

８％），CD

１６６

（９７．

８％），STRO-１（８１．

３％）が発現していた（図

１）。血球系で発現が認められる CD１４，CD３４，CD

４５の発現は認めなかった。増殖させた細胞の４継代

目を用いて骨芽細胞へ分化誘導を行ったところ，ア

ルカリフォスファターゼならびにアリザリンレッド

染色で陽性を示した（図２Ａ，Ｂ）。また，脂肪細胞

への分化誘導では，オイルレッド陽性の脂肪滴を観

察することができた（図２Ｃ）。さらに，軟骨細胞へ

の分化誘導では軟骨ムチンを染色するサフラニン O

の陽性像を確認できた（図２Ｄ）。

口腔粘膜上皮下細胞の培養上皮シート用フィーダー

細胞への応用

次に，口腔粘膜上皮下細胞をフィーダー細胞とし

て共培養し，上皮シートを培養したところ NIH３T

３フィーダー細胞使用時と同様の細胞形態，透明性

図１ 間葉系幹細胞で発現が認められるマーカーのフローサイトメトリーによる発現解析 Ａ）CD４４，Ｂ）CD７３，Ｃ）CD９０，Ｄ）CD１０５，Ｅ）CD１４６，Ｆ）CD１６６，Ｇ）STRO-１ 白）Isotype Control。グレー）それぞれの発現ピーク。縦軸）細胞数。横軸）蛍光強度。数値）陽性率 歯科学報 Vol．１１３，No．５（２０１３） ５１１ ― ２７ ―

を示すことが出来た（図３）。さらに口腔粘膜上皮で

発現するケラチン３，４，基底膜成分であるⅣ型コ

ラーゲンやラミニン，未分化な細胞で発現する p６３

が基底細胞で確認できる等，口腔粘膜由来のフィー

ダー細胞を使用しても現行の作製方法に類似した上

皮シートを作製することができた（図４）。

考 察

今回単離した口腔粘膜上皮下細胞を単一細胞から

培養・増殖させ，骨芽細胞，脂肪細胞，軟骨細胞へ

分化誘導することが可能であった。これまで間葉系

幹細胞は様々な組織からまた様々な方法で分離され

ており，ヒトの間葉系幹細胞を定義するために，細

胞治療を行うための最小限の基準が設けられた

１０）

。

Dominici らは間葉系幹細胞のマーカー発現は９５％

以上が望ましいと報告しているが，今回分離した口

腔粘膜上皮下細胞のでは，STRO-１においては非

常に高い発現率を示したものの，CD１０５では９５％に

満たない発現であった。発育中の歯組織から分離さ

れた神経堤由来前駆細胞は多分化能を示している

が，CD１０５の発現は９５％に達していない報告もあ

る

１１）

。また，繊維芽細胞において多分化能を示す

図２ 骨芽細胞，脂肪細胞，軟骨細胞への分化誘導 Ａ）骨芽細胞への分化誘導前後におけるアルカリフォスファターゼ（ALP）染色。Ｂ）骨芽細胞への分化誘導前 後におけるアリザリンレッド S（ARS）染色。Ｃ）脂肪細胞への分化誘導前後におけるオイルレッド O（Oil Red O） 染色。Ｄ）軟骨細胞への分化誘導前後におけるサフラニン O（Safranin O）染色。上段）分化誘導前。下段）分化誘 導後。Scale bar：５０μm 図３ ３T３または口腔粘膜由来細胞をフィーダーとして培養した培養上皮シート 上段）３T３細胞を用いて作製した上皮シート（３T３ feeder）。下段）口腔粘膜上皮下細胞由来フィーダー細胞 を用いて作製した上皮シート（hOS feeder）。Ａ）培養中の位相差顕微鏡像。Ｂ）培養２週間後の上皮シート。 Ｃ）インサートから剥離したＢの上皮シート。Ｄ）H.E. 像 ５１２ 佐竹，他：口腔粘膜上皮下組織から間葉系幹細胞の分離 ― ２８ ―

STRO-１の発現はその神経堤由来前駆細胞におい

て殆ど観察されていなかった

１１，１２）

。この様に組織ま

たは分離法の違いによって間葉系幹細胞マーカーの

発現に影響を与えている可能性が考えられる。メチ

ルセルロースを使用した培養方法は細胞の単離方法

としては有用である。幹細胞を増殖させる方法とし

て浮遊培養系の報告があり

１３，１４）

，今回参考にした論

文でも粘性の高いメチルセルロース培養法を用いる

ことでシングルセルから増殖した細胞塊を分離する

ことが可能である

４）

。今回我々が口腔粘膜から分離

した細胞はメチルセルロースを使用したことによっ

て，表面抗原の割合が変化した可能性も考えられ

る。

培養上皮シート作製時に共培養を行う

８，１５，１６）

_NIH３

T３細胞はマウス胎児皮膚由来の細胞で，異種の細

胞を使うリスクをともなう。このリスクを減らすた

め，NIH３T３細胞に代わる細胞の探索が必 要 で

あった。これまでにヒト由来の骨髄幹細胞から誘導

したフィーダー細胞や，脂肪幹細胞から誘導した

フィーダー細胞を用いた培養上皮シート作製が報告

され，ヒト由来の細胞をフィーダーとした培養が可

能であることが示唆されている

１７）

。我々はこれまで

に NIH３T３細胞をフィーダー細胞として共培養し

ながら培養上皮シートの開発ならびに作製を行って

きた

８，１５，１６）

。ウサギ由来の上皮シートはこれまでの

経験からヒトへの臨床応用を考慮した上で，有用な

研究用ツールであると考えられる。今回ウサギ口腔

粘膜上皮シートの作製においてではあるが，ヒト由

来口腔粘膜上皮下細胞は NIH３T３細胞の代替え細

胞として使用できる可能性が考えられた。

図４ ウサギ口腔粘膜上皮シートにおける免疫染色の比較 Ａ）ケラチン（K）３，Ｂ）K４，Ｃ）Ⅳ型コラーゲン（CollⅥ），Ｄ）ラミニン（Laminin），Ｅ）p６３。左図）３T３ 細胞をフィーダーとして作製した上皮シート（３T３ feeder）。右図）口腔粘膜由来細胞をフィーダーとして作製した 上皮シート（hOS feeder）。核はすべて DAPI にて染色。Scale bar：５０μm

歯科学報 Vol．１１３，No．５（２０１３） ５１３

神経堤由来の因子を示す間葉系幹細胞は皮膚乳

頭や毛包からも報告され，高い分化能を示してい

た

１８，１９）

。口腔領域においても，歯髄から神経堤由来

因子を含んだ幹細胞の存在が認められ

１１）

，いわゆる

間葉系幹細胞とは少し異なる幹細胞が存在している

可能性が考えられる

１１）

。顎骨周辺の組織は発生過程

で神経堤由来の組織が多いことから口腔粘膜にも神

経堤由来の細胞が含まれている可能性が高い。今後

はさらに口腔粘膜から分化能の高い幹細胞の分離を

行う必要があるが，今回単離した口腔粘膜上皮下細

胞は顎骨の再生だけでなく，角膜実質再生等，再生

医療における細胞ソースとして期待される。

謝 辞

本研究は平成２２年度，２３年度東京歯科大学学長奨励研究助 成により行われた研究であり，本助成を頂きましたこと心よ り感謝致しますと共に，ご指導ご協力頂きました東京歯科大 学市川病院眼科並びに角膜センターの皆様に深く感謝致しま す。 本論文の要旨は平成２４年度東京歯科大学口腔科学研究セン ターワークショップ（２０１３年３月１日，千葉）におい て 発 表 し，一部は第１２回日本再生医療学会（２０１３年３月２１日，横浜） において発表した。 文 献

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５１４ 佐竹，他：口腔粘膜上皮下組織から間葉系幹細胞の分離

Establishment of an isolation and culture procedure for multipotent stem cells

from oral mucosal non-epithelial tissue.

Yoshiyuki SATAKE

１）２）

_{，Kazunari HIGA}

１）２）

_{，Shintaro MATSUMURA}

１）３）

Gen-yuki YAMANE

１）３）

_{，Jun SHIMAZAKI}

１）２） １）_{Oral Health Science Center hrc８, Tokyo Dental College}

２）_{Department of Ophthalmology, Ichikawa General Hospital, Tokyo Dental College} ３）_{Department of Oral Medicine, Oral and Maxillofacial Surgery, Tokyo Dental College}

Key words : mesenchymal stem cells, oral mucosa, cultivated epithelial sheet, feeder cells, multi-differential potency

Mesenchymal stem cells（MSCs）show self-renewal and multipotency． It is believed that MSCs exists in human oral mucosal non-epithelial tissue（hOMNET）． To characterize the oral mucosal MSCs （OMMSCs），we isolated MSCs from hOMNET and cultivated an oral mucosal epithelial sheet using OMMSC feeder cells． hOMNETs were prepared with dispase Ⅱ and separated from the oral mucosal epithelium． hOMNETs were also treated with collagenase and isolated human oral mucosal non-epithelial cells（OMNECs）． To proliferate them from a single cell，OMNECs were cultured with ０．８％ methylcel-lulose，forming sphere cells，which were subsequently expanded by amplifying adhesive culture．

Amplified OMNECs were analyzed by flow cytometry and immunohistochemistry． We also exam-ined the suitability of using a cultivated epithelial sheet feeder． Isolated OMNECs expressed mesenchy-mal stem cell markers such as CD４４，CD７３，CD９０，CD１０５，CD１４６，CD１６６，and STRO-１． OMNECs were able to differentiate into osteoblasts，adipocytes，and chondrocytes． Furthermore，we established a rabbit oral mucosal epithelial sheet using OMNEC feeder cells with remaining transparency and a well-stratified sheet． Keratin３，４，collagen type Ⅳ，laminin，and p６３ were expressed in the sheet using OMNEC as well as NIH３T３ feeder cells． OMNECs may be mesenchymal stem cells with multipotency and suitable for use with feeder cells as a substitute for NIH３T３ feeder cells which involve a xenogenic risk in the cultivated rabbit oral mucosal epithelial sheet． （The Shikwa Gakuho，１１３：５０９−５１５，２０１３）

歯科学報 Vol．１１３，No．５（２０１３） ５１５