Colony
assay法
を 用 い た 肺 癌 化 学 療 法 に お け る
Anthracycline-anthraquinone系
薬 剤 の
有 効 性 に 関 す る 研 究
第1編 ヒ ト 肺 癌 細 胞 株 に 対 す る anthracycline-anthraquinone系 薬 剤 の 殺 細 胞 効 果 の 比 較 岡 山 大 学 医 学 部 第 二 内 科 学 教 室(指 導:木 村 郁 郎 教 授) 沼 田 健 之 (平 成4年11月17日 受 稿)Key words:肺 癌 細 胞 株, colony assay, anthracycline, anthraquinone
緒 言
Adriamycin (ADM)は, anthracycline-anthraquinone系 制 癌 剤 の 中 で 最 も重 要 な位 置 を 占 め て お り,そ の 開 発 は 癌 化 学 療 法 の 歴 史 に お い て 画 期 的 な こ とで あ っ た.ADMは,強 い 抗 腫 瘍 活 性 と 広 い 抗 腫 瘍 スペ ク トラ ム を有 し,悪 性 リ ンパ 腫 な どの 造 血 器 腫 瘍 な ら び に 卵 巣 癌, 肺 小 細 胞 癌 な どの 固 形 癌 の 治 療 成 績 を向 上 させ, 現 在 に お い て も各 種 悪 性 腫 瘍 に 対 す る 多 剤 併 用 療 法 の 中 で 重 要 な役 割 を担 っ て い る1).し か し, 強 い 抗 腫 瘍 活 性 を有 して い る 反 面,そ の 副 作 用 で あ る骨 髄 抑 制 や 蓄 積 性 の 心 毒 性 が 主 た るdose limiting factorと な っ て い る.そ の ため,近 年, 前 述 の 毒 性 が よ り少 な く,か つ 抗 腫 瘍 効 果 の よ り高 い 薬 剤 を指 向 し た 誘 導体 の 開 発 が 盛 ん に 行 な わ れ て き た.最 近,臨 床 に 導 入 され たADM の 誘 導 体 と し て は, anthracycline系 薬 剤 と し て aclarubicin (ACR)2),さ らに4'-0-tetrahydro pyranyl adriamycin (THP-ADM)3), anthrqui none系 薬 剤 と し てmitoxantrone (MIT)4)5)が
あ る.こ れ ら新 た に 臨 床 に 導 入 さ れ た 薬 剤 が, 癌 化 学 療 法 に お い て そ の 母 化 合 物 で あ るADM
との 比 較 に お い て,臨 床 的 に 有 用 で あ るか 否 か の 評 価 は い ま だ 明 らか で な い.
著 者 は,肺 癌 化 学 療 法 に お け るADMお よ び そ の 誘 導 体 で あ るACR, THP-ADM, MITの 有 効 性 を検 討 す る 目的 で,5種 類 の ヒ ト肺 癌 細 胞 株 を 用 い,こ れ ら薬 剤 のin vitroに お け る 殺 細 胞 効 果 をcolony assay法 に よ り比 較 検 討 し た の で 報 告 す る. 材 料 と 方 法 1. 薬 剤 今 回 実 験 に 用 い たanthracycline-anthraquinone系4薬 剤 の 化 学 構 造 式 をFig. 1 に 示 す. anthracycline系 薬 剤 で あ るADMは 協 和 発 酵 工 業 よ り, THP-ADMは 明 治 製 菓 よ り, ACRは 山之 内 製 薬 よ り,ま たanthraquinone系 薬 剤 で あ るMITは 日本 レ ダ リー よ り供 与 を 受 け た.い ず れ の 薬 剤 も実 験 で は生 理 的 食塩 水 で 希 釈 して 使 用 し た. 2. 肺 癌 細 胞 株 岡 山 大 学 第 二 内科 学 教 室 で 樹 立 培 養 し継 代 し て い る肺 扁 平 上 皮 癌 由 来 細 胞 株EBC-1,肺 腺 癌 由 来 細 胞 株ABC-1,中 間 細 胞 型 肺 小 細 胞 癌 由 来 細 胞 株SBC-1, SBC-2,燕 麦 細 胞 型 肺 小 細 胞 癌 由 来 細 胞 株SBC-3の5種 類 の 細 胞 株 を 用 い た.5種 類 の 細 胞 株 の 性 状 をTable 1に 一 括 し て 示 す6)7)8).5種 類 の 細 胞 株 は,い ず れ も転 73
移 巣 か ら得 られ た 腫 瘍 材 料 よ り樹 立 した もの で あ る が,EBC-1は 皮 膚 転 移 巣 よ り,ABC-1, SBC-1は 癌 性 胸 水 よ り,SBC-2, SBC-3は 転 移 陽 性 の 骨 髄 穿 刺 液 よ り樹 立 され た.ま た,EBC -1 , ABC-1, SBC-1, SBC-2は 各 種 化 学 療 法 に 対 し抵 抗 性 を示 した 患 者 か ら樹 立 され,SBC -3は 未 治 療 の 患 者 か ら樹 立 さ れ た な お 継 代 培 養 に は10%牛 胎 児 血 清, penicillin-G (100 units/ml), streptomycin (100μg/ml)加RPMI -1640を 使 用 し た
Fig. 1 Chemical structures of anthracycline-anthraquinone 4 drugs
Table 1 Characteristics of cell lines established from carcinoma of the lung
CPA: cyclophosphamide NCS: neocarzinostatin Ifo: ifosfamide VCR: vincristine MMC: mitomycin C VP-16: etoposide MTX: methotrexate ADM: adriamycin ACNU: nimustine PCZ: procarbazine VDS: vindesine 3. Colony assay法
colony assay法 の概 略 をFig. 2に 示 す.ま ず,対 数 増 殖 期 の 細 胞 を 採 取 し,単 一 細 胞 浮 遊 液 を作 製 し た.す な わ ち,浮 遊 増 殖 す るABC-1, SBC-るABC-1, SBC-2は,1500r.p.m.5分 間 遠 沈 し上 清 を捨 て た の ち に,ま た 培 養 器 内 の 底 面 に 付 着 増 殖 す るEBC-1, SBC-3で は培 養 液 を 除 い た の ち に,0.05%EDTA加0.25% Trypsin液(Gibco製)を 加 え,37℃ に て5分 間 作 用 させ た.ピ ペ ッ ト操 作 に よ り単 一 細 胞 浮
遊 液 を 作 製 し,こ れ を1500r.p.m. 5分 間 遠 沈 し, 培 養 液 に て2回 洗 浄 し た も の を 単 一 細 胞 浮 遊 液 と し て 用 い た.0.5%Trypan blue液 に て 細 胞 浮 遊 液 の 生 細 胞 数 を 算 定 後,1ペ ト リ デ ィ ッ シ ュ(1ml)あ た り の 生 細 胞 数 がEBC-1で は2× 104個,ABC-1, SBC-1, SBC-2, SBC-3で は1×105個 に な る よ う に 調 整 し た.種 々 の 薬 剤 濃 度 下 で37℃ 恒 温 槽 内 に て1時 間 接 触 させ た の ち,遠 沈 に て2回 洗 浄 し,二 層 法 軟 寒 天 培 地 を 用 い培 養 し た 。 す な わ ち,径35mmの グ リ ッ ド付 きプ ラ ス チ ッ ク製 ペ ト リデ ィ ッ シ ュ(Lux製, #5217)に あ らか じめ0.5%agar (Marine Col loids製)と15%牛 胎 児 血 清 を 含 むRPMI-1640(総 量1ml)に てfeeder layer(下 層)を Fig. 2 Human tumor clonogenic assay
Fig. 3 Antitumor activity of anthracycline-anthraquinone on cell lines from adenocarcinoma and epidermoid carcinoma of the lung
価 し た.
成 績
anthracycline-anthraquinone系4薬 剤 に 対 す る 肺 扁 平 上 皮 癌 由 来 細 胞 株EBC-1と,肺 腺 癌 由 来 細 胞 株ABC-1のdose respOnse curve
をFig. 3に 示 す.こ のdose response curveよ り70%殺 細 胞 濃 度(70% lethal dose; LD70)を 求 め,殺 細 胞 効 果 を 比 較 し た.EBC-1で は, THP-ADMとACRのLD70は そ れ ぞ れ32.0× 10-8M,36.0×10-8Mで あ り,ま たMITは86.0× 10-8M, ADMは280×10-8Mで あ っ た.し た が っ て,EBC-1に 対 す る 殺 細 胞 効 果 は, THP-ADM, ACR, MIT, ADMの 順 に 強 か っ た.
10-8Mと 最 も 低 く,っ い でTHP-ADMで は そ れ ぞ れ9.8×10-8M,9.2×10-8M, ADMで は そ れ ぞ れ19.0×10-8M,23.5×10-BM, MITで は そ れ ぞ れ21.0×10-8M,27.0×10-8Mで あ っ た. し た が っ て,SBC-1とSBC-2に 対 す る 殺 細 胞 効 果 は, ACR, THP-ADM, ADM, MITの 順 に 強 か っ た が,そ の 差 は わ ず か で あ っ た.ま た, SBC-3で はSBC-1, SBC-2の 場 合 と は 異 な り,MITとTHP-ADMのLD70が そ れ ぞ れ3.4× 10-8M,3-6×10-8Mと 最 も低 く,ACRとADM は そ れ ぞ れ6.0×10-8M,6.2×10-8Mで あ っ た. し た が っ て,SBC-3に 対 す る 殺 細 胞 効 果 は, MIT, THP-ADM, ACR, ADMの 順 に 強 い と
判 定 さ れ た.
Fig. 4 Antitumor activity of anthracycline-anthraquinone on cell lines from small cell carcinoma of the lung
Table 2 70% lethal dose (LD70) of adriamycin
(ADM),
aclarubicin
(ACR),
THP
-adrimycin (THP-ADM)
and
mitox
antrone (MIT) in five cell lines estab
lished from carcinoma of the lung
*
Concentrations which are achievable in the ƒÀ-phase of blood level with conventional dose in man
検 討 に 用 い た5種 類 の ヒ ト肺 癌 細 胞 株 に 対 す るanthracycline-anthraquinone系4薬 剤 の LD70をTable 2に 一 括 し て示 す.表 中 の 星 印 を 付 し た 数 字 は,ヒ トに お け る各 薬 剤 の 通 常 投 与 量 な い しは 臨 床 第 Ⅱ相 試 験 ヘ のrecommended doseをone shot静 注 し た 場 合, β-phaseに お
い て 到 達 可 能 な 濃 度 範 囲 内 の 濃 度 で あ る こ と を 示 す.各 肺 癌 細 胞 株 の 各 薬 剤 に 対 す る 感 受 性 を 全 般 的 に 比 較 す る と,SBC-3は 最 も高 い感 受 性 を有 して お り,つ い でSBC-1, SBC-2の 順 に 感 受 性 が 高 く,ABC-1は 各 薬 剤 に か な り低 い 感 受 性 しか 示 さ ず,EBC-1は 最 も低 い 感 受 性 を 示 し た.臨 床 的 に 到 達 可 能 な 各 薬 剤 の 血 中 濃 度 を 考 慮 し た 場 合,SBC-3は す べ て の 薬 剤 に 感 受 性 を示 し,EBC-1で は す べ て の 薬 剤 に 抵 抗 性 で あ っ た.ま た,ABC-1で はACRに 感 受 性 を 示 し,SBC-1, SBC-2で はACRとTHP-ADM に 感 受 性 を示 し た.つ ぎに,ADMと そ の 誘 導 体 の 各 肺 癌 細 胞 株 に 対 す る 殺 細 胞 効 果 を全 般 的 に 比 較 す る と,ACRとTHP-ADMの 効 果 が 強 く,ADMとMITはACRとTHP-ADM に 比べ て 弱 い とい う結 果 が 示 さ れ た. 考 察 ADMは,肺 癌,と くに 小 細 胞 癌 に 対 す る化 学 療 法 の 中 で 重 要 な役 割 を 受 持 っ て い るが,近 年,ADMに 比 べ て さ ら に 毒 性 が 少 な く,か っ 抗 腫 瘍 効 果 の 高 い 薬 剤 を指 向 し た 誘 導 体 の 開 発 が 盛 ん に 行 な わ れ て き た.新 し い 誘 導 体 が 存 在 意 義 を 持 つ た め に は,母 化 合 物 と の 比 較 に お い て 何 らか の 利 点 を 持 つ 必 要 が あ る.す な わ ち, ① 母 化 合 物 の 毒 性(と くに 致 死 的 毒 性)が 軽 減 して い る こ と,② 母 化 合 物 と交 叉 耐 性 を有 さ な い こ と,③ 母 化 合 物 が 有 効 で あ る腫 瘍 に 対 し母 化 合 物 よ り も有 効 で あ る こ と,④ 母 化 合 物 が 無 効 で あ る腫 瘍 に 対 し て も有 効 で あ る こ と,の い ず れ か を示 す こ とが 新 し い 誘 導 体 に 求 め ら れ る 条 件 と考 え られ る. 今 回,著 者 が 検 討 したADMお よ びACR, THP-ADM, MITの 場 合,ま ず,① の 母 化 合 物, す な わ ちADMの 毒 性,と くに 心 毒 性 に つ い て は,ACR2), THP-ADM9), MIT10)と もにADM に 比 べ て 低 い こ とが 証 明 され て い る.ま た,② の 交 叉 耐 性 に つ い て は,MITはADMと の 交 叉 耐 性 が 乏 し い こ とが 示 唆 さ れ て い る11).THP-ADMに お け るADMと の 交 叉 耐 性 に つ い て は 必 ず し も明 らか に され て い る とは い いが た い が, 臨 床 的 に 部 分 的 に は 交 叉 耐 性 が な い こ とが 示 唆 さ れ て い る12).今 回,著 者 は ③,④ の 抗 腫 瘍 活 性 に つ い て,ヒ ト肺 癌 細 胞 株 を 用 い, colony assay 法 に よ りACR, THP-ADM, MITに 対 す る殺 細 胞 効 果 を,母 化 合 物 で あ るADMと 比 較 検 討 した.そ の 結 果,ヒ ト肺 小 細 胞 癌 細 胞 株 は,他 の 組 織 型 の ヒ ト 肺 癌 細 胞 株 に 比 べ て, anthracycline-anthraquinone系 薬 剤 に 対 す る 感 受 性 の 高 い こ と が 認 め ら れ,と くにTHP-ADM, ACRに 高 い 感 受 性 が 認 め ら れ た.し か し,各 細 胞 株 はADMに 対 しか な り抵 抗 性 で あ り,MITに 対 して は 感 受 性 を ほ とん ど示 さ な か っ た.ま た,SBC-1, SBC-2で は,ADMを 含 む 多 剤 併 用 化 学 療 法 に 対 し耐 性 と な っ た 患 者 よ り樹 立 培 養 した 細 胞 株 で あ る に もか か わ ら ず, THP-ADM, ACRに か な り高 い 感 受 性 を 示 し た こ とが 注 目 さ れ た. 臨 床 第 Ⅱ 相 試 験 に お け る 成 績 をみ る と,ACR, THP-ADMは 固 形 癌 で は 主 と して 胃 癌,乳 癌, 卵 巣 癌,子 宮 癌 に 有 効 例 が 報 告 され て い るが, 肺 癌 に 対 し て は 有 効 例 の 報 告 は 少 な く12)13)14)15)16),今回 のin vitroに お け る 成 績 と 若 干 の 解 離 が み ら れ た.こ の 解 離 の 理 由 と し て, in vitroの 場 合 に はTHP-ADMは 組 織 中 で 比 較 的 早 く代 謝 され,組 織 内 停 滞 時 間 がADMに
を 除 い て は ほ ぼ 同 等 で は な い か と推 測 さ れ た. ま た,THP-ADMとACRは,副 作 用 を考 慮 した 場 合,肺 癌 化 学 療 法 に お け る臨 床 的 有 用 性 に お い てADMよ りは や や 優 れ て い る 可 能 性 が 示 唆 され た. 結 論 当 教 室 で 樹 立 培 養 し 継 代 し て い る5種 類 の ヒ 本 論 文 を擱 筆 す るに あ た り,御 懇篤 な る御指 導 な らびに御 校 閲 を賜 った恩 師 木 村郁 郎 教 授 に深 甚 の謝 意 を表 わ します.ま た,終 始 御 懇 篤 な る御 指 導 を賜 っ た大 熨泰 亮助 教 授,平 木 俊 吉 先 生 に深 謝 し ます. なお 本 論文 中の要 旨は 第31回 日本化 学 療 法学 会 総 会(昭 和58年 大 阪)に お いて 発表 した. 文 献
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