3系統のタバコ・モジイク・ウイルスの塩素による不活性化

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(1)Title. 3系統のタバコ・モジイク・ウイルスの塩素による不活性化. Author(s). 由崎, 俊道. Citation. 北海道教育大学紀要. 第二部. B, 生物学,地学,農学編, 35(2): 87-95. Issue Date. 1985-03. URL. http://s-ir.sap.hokkyodai.ac.jp/dspace/handle/123456789/6418. Rights. Hokkaido University of Education.

(2) . 北海道教育大学紀要（第２部Ｂ）第３５巻第２号ｉＳｅｉＩｉｉｔｌｏｆＨｏｋｋａｉｄｏＵｎｔｔＩＢ）ＶＯＪｏｕｃｏｎｌｒｓｏｎ（ｖｅｒｎａｙｏｆＥｄｕｃａ．３５．２，Ｎｏ. 昭和６０年３月Ｍａ９８５ｒｃｈ，１. ３系統のタバコ・モザイク・ウイルスの塩素による不活性化. 由. 崎. 俊. 道. 北海道教育大学札幌分校生物学教室. ｌｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆ３ＳｔｒａｉｎｓｏｆＴｏｂａｃｃｏｙｌｏｓａｉｃＶｉｉｎｅｒｕｓｂｙＣｈｌｏｒＴｏｓｈｉｍｉｃｈｉＹｏｓＨＩＺＡＫＩＢｉｌｏｇｉＩＬａｂｏｒａｔｏｒｙｌｌｉｄｏＵｎｉｖｅｉｏｃａｉｏｎｔｙｏｆＥｄｕｃａｔｅｇｅｒｓ，ＳａｐｐｏｒｏＣｏ，Ｈｏｋｋａ，Ｓａｐｐｏｒｏ０６４. Ａｂｓｔｒａｃｔｌｔｗａｉｉｖｉｔｔｙｏｆｔｈｒｅｅｓｔｒａｉｎｓｏｆｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ（ＴＭＶ）ｔｏｓｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｈｅｓｅｎｓ. ｉｎａｃｉｉｏｎｂｙｃｈｌｏｒｉｎｅｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎｔｈｅｆｏｔｌｌｏｗｉｉｆｅｒ（Ｃ‐ ｔｔｖａｔｎｇｏｒｄｅｒ−ｃｒｕｃ）ｓｒａｉｎｒａｉｓｎ），ｔｏｍａｔｏ（Ｌ‐ ，ｄｄｉ０ｉｈｈｉｌｌｔｉｉｎｅｆｏｒ３０ｍｎ．ａｔｏｏ）− ｗｅｎｔｅｖｒｕｓｅｓｗｅｒｅａｏｗｅｄｔｏｒｅａｃｔｗｉａｎｏｒｎａｒｙ（ ‐ ｔｈｃｈｌｓｒａｎｏｒＣ．ＳｉｍｉｌａｒｌｉｎｅｑｕａｎｔｉｔｉｅｓｗｈｉｔｈＴＭＶｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｔｏｄｅｃｒｅａｓｅｉｃｈｒｅａｃｔｅｄｗｉｙｎ，ｔｈｅｃｈｌｏｒｄｈｔｅｓａｍｅｏｒｅｒａｓｆｏｒｔｈｅｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ −Ｃ；Ｌ；ａｎｄｏ‐ ｔ１ｏｍｇ）ｗａｓａｌｌｏｗｅｄｒａｉｎ − ｗｈｅｎＴＭＶ（ｓｏＣＴｈｅｈｂｒｔｏｒｅａｃｔｗｉｉｔｈｃｈｌｏｒ５ｍｇ）ｆｏｒ３０ｍｉｎｉｄＴＭＶｔｏｈｈｉｉｎｅ（ｔｔｔｔｈａｗｒｃｗａｓｅｃｏｎｓｕｅｄｗｉｙ．，ＬｔｈｅＲＮＡｏｆｏ−ｏｒ ‐ｓｔｒａｉｎａｎｄＣ‐ｓｔｒａｉｎｐｒｏｔｅｉｎｓｈｏｗｅｄａｈｉｇｈｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｏｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｂｙｉｎｅａｎｄｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｏｆｇ１ｉｉｅｓｏｔｆｃｈｌｏｒｉｉｄＴＭｖｗｉｃｈｌｏｒｔｈ「ｅａｔｅｒｑｕａｎｔｎｅｔｈａｎｔｈｏｓｅｏｆｔｈｅｈｙｂｒＲＮＡｏｆＣ−ｏｒＬ‐ｓｔｒａｉｎａｎｄｏ‐ｓｔｒａｉｎｐｒｏｔｅｉｎ，ＴｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔｔｈａｔｔｈｅｓｅｎｓｉｉｔｔｙｏｆＴＭＶｖｉｔｏｉｉｖａｔｉｏｎｂｙｃｈｌｏｒｉｎｅａｎｄｔｏｔｈｅｑｕａｎｔｉｔｉｅｓｏｆｃｈｌｏｒｉｉｎｇｗｉｎａｃｔｔｈＴＭＶｄｅｐｅｎｄｏｎｔｈｅｎｅｒｅａｃｔ. ｔｏｎｔｈｅＲＮＡｏｆｔｈｅｖｉｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎ，ｎｏｒｕｓ．Ｔｏｃｏｎｆｉｒｍｔｈｉｓｓｕｇｇｅｓｔｉｏｎ，ｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｏｆｃｈｌｏｒｉｎｅｉｉｅｓｗｉｔｔｈｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｓｗｈｉｃｈｈａｄｂｅｅｎｐｒｅｐａｒｅｄｆｒｏｍ３ｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｅｓｉｍａｔｅｄｉｔｑｕａｎｔｎｔｈｅｓａｍｅｍａｎｎｅｒａｓｆｏｒＴＭＶ．Ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｗｅｒｅｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｕｓｉｎｇｏｆｌｏｍｇｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｎｄａｂｏｕｔｉｎｅｉｎｔｗｏｋｉｎｄｓｏｆｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｏ５ｍｇｏｆｃｈｌｌｕｔｉＩＭｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｏｒ）ｉｎｏｎ：０ＰＨ２．. ｉｌ００５ｎ４ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｗｈｉｃｈｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｗａｓａｓｓｅｍｂｌｅｄｉｎｔｏａｇｇｒｅｇａｔｅｓｗｈｅｔｈｅｏｔｈｅｒｗａｓｏ．ｉｏｎ（０ｉｎｈａｄｂｅｅｎｂａｒｅ）ｉｎｗｈｉｌｙａｓｓｅｍｂｌｅｄｈｓｏｌｕｔｔｌｏｒｉｎｅｃｈｔｈｅｐｒｏｔｅＰＨ７．．Ａｓａｒｅｓｕｌ，ｔｅｃｈｉｉｅｓｗｈｔｉｉｎｉｎＱ１ハ江ａｎｄｏｔｈｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｏｆｅａｃｈｓ００５八厘ｐｈｏｓＰｈａｔｅｓｏｔｌｕｔｉｏｎｃｈｒｅａｃｔｅｄｗｉｑｕａｎｔｒａ．. ３３ｍｇｆｏｒｃ‐ ７９ａｎｄ３４７ａｎｄ３１ｏｍｇｆｏｒＬ一ｔｉｎｗｅｒｅ２ｔ１ｏａｎｄ３０９ｍｇｆｏｒｏ‐ ｓｒａｉｎｓｒａ，，，，，１，，，ａｎｄ１ｌｏｒｉｉｉｓｔｒａｉｎｔｈｔｈｅｐｒｏｔｅｌｎαｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｏｌｕｔｉｏｎｎｅｑｕａｎｔｉｔｙｗｈｃｈｒｅａｃｔｅｄｗｉｎｉｎｏ．Ｔｈｅｃｈ．ｉｇｎｉｆｉｌｉｇｈｔｄｅｃｒｅａｓｅｓｌｉｆｆｅｒｅｎｃｅｗａｓｃａｎｔｙｉｎｔｈｅｏｒｅｒＣ‐ ，Ｌ‐ ，ａｎｄｏ‐ｓｔｒａｉｎ，ｗｈｅｒｅａｓｏｎｌｙａｓｆｏｕｎｄａｍｏｎｇｔｈｅｃｈｌｏｒｉｉｔｈｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｏｆ３ｓｉｔ０００ｌｐｈｏｓｐｈａｔｅｎｅｑｕａｎｔｉｔｉｅｓｒｅａｃｔｉｎｇｗｉ５∼ ｒａｎｓｎ，ｄ. ｄ. ｄ. ｂｕｆｆｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎｉｔｓｗｅｒｅｏｂｔａｉ５ｍｇ）ａｎｄ９ｎｅｄｆｒｏｍｔｈｅｍｉｘｔｕｒｅｏｆｔｈｅｐｒｏｔｅｎ（．Ｔｈｅｓａｍｅｒｅｓｕｌ．（７）.

(3) . ８８. 由. 崎. 俊. 道. ｉｎｅｉｎｏ１ＭＰｙｒｏＰｈｏｓＰｈａｔｅａｎｄｏ００５ＭｔｈＣｈｌｏｒ５１ｔｒｅａｃｔｅｄｗｉＲＮＡ（○ ｎｇ）ｏｆｅａｃｈｓｔｒａｉｎｖｖｈｅｎｉ・．・ｆｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｎｏｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｗａｓｆｏｕｎｄａｍｏｎｇｔｈｅｃｈｌｏｒｉｎｅｑｕａｎｔｉ ‐ ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｈｌｌｌｄｄｆｔｈｉｉｔｏｈｂｉｔｔｈｔｔｔｉｔｉｈｔｈｆ３ｔｔｔＲＮＡｕｅｒｅｓｕｓｗａｓｃｏｎｃｅｒｅａｃｎｓｒａｎｓｏａｅｎｅａｓｓｅｓｅｏｇｗ．，ｉｉｌｏｒｉｎｅｉｏｎｂｙｃｈｌｏｒｉｎｅａｎｄｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｏｆｑｕａｎｔｄｆｉｉｖｉｉｖａｔｔｉｆｅｒｅｎｃｅｉｎｔｈｅｓｅｎｓｔｙｔｏｉｎａｃｔｔｅｓｏｆｃｈａｍｏｎｇｓｔｒａｉｎｓｏｆＴｎ４Ｖｄｅｐｅｎｄｓｏｎｔｈｅｎａｔｕｒｅｏｆｔｈｅｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎｏｆｔｈｅｖｉｒｕｓｅｓ．. 緒. 言. タバコ・モザイク・ウイルス（ＴＭＶ）は，紫外線によって不活性化されるが，その不活性化のｌｄｎｏａｎｉｌａｎｄＷｉ程度は，ＴＭＶの系統によって差のあることが知られている（Ｓｅｇｅ，１９５６；ｏｈｓｈｉｍａ，ｏｈａｓｈｉｄｋ１１Ｕ９７）しかし各系統のＴＭＶから分離された核酸（ＴＭＶ ‐ＲＮＡ）のａｎｍａａｅｗ，，，．ｌｌｄｍａｎ紫外線に対する耐性には系統間に差がないことが報告されている（Ｓｉｅｇｅｎｏｓａ，Ｇｉ，ａｎｄＷｉ，. １９５７）．同様な結果はＴＭＶの塩素による不活性化についての研究においても報告されている（由）崎・池畑，１９７７．これらの事実から，ＴＭＶの紫外線あるいは塩素に対する耐性の系統間の差は，ＴＭＶ‐ＲＮＡには関係なく，外被蛋白の性質の差によるものと推定されている．本研究では３系統のＴＭＶ，およびＴＭＶ蛋白試料に一定量の塩素を加え，一定時間後の塩素の消費量（反応量）を測定し，各系統の塩素による不活性化と塩素の反応量との関係について調べた．その結果，各系統の塩素に対する耐性と塩素反応量との間に関係のあることを認めたので，ここに報告する．. 材料および方法実験に用いたすべての植物は，鉢植えにしてガラス室内で生育させた．ＴＭＶは，普通系統（０系統））６４，およびヤチイヌガラシから分離，トマトから分離されたＬ系統（大島・後藤・佐藤，１９ｌｔｅＢｕｒバ断た所ＺされたＣ系統（後藤・大島，１９６２）を用い，タコ（ｅｙ伽α 加る鑑“ｍＬ．ｖａｒ．Ｗｈｉ，亙たメカ７）に接種し増殖させた．そ２α ねる鑑”伽Ｌ．ｖａｒ．Ｓｕｍｓｕｎ）および寄居カブ（Ｂ“硲ｓたα 焔卿Ｌ．. ９５９）によってＴＭＶを純化した．ＴＭＶ‐ＲＮＡは，の感染葉の搾汁液から超遠心分画法（Ｓｔｒｅ；１ｅｅｌペントナイト・フェノール法（Ｆｒａｅｎｋｅｔａ）によって調整した． ‐Ｃｏｎｒａｔ，Ｓｉｎｇｅｒ，ａｎｄＴｓｕｇｉ，１９６１ｌ）により調整した．純化したＴＭＶ，ＴＭＶ−ＲＮＡおＴＭＶ蛋白は酢酸法（Ｆｒａｅｎｋｅ ‐Ｃｏｎｒａｔ，１９５７．. ｈｉ９５１）によって測定よびＴＭＶ蛋白の濃度は，２６０および２８０１皿の紫外線吸光度法（Ｔａｋａｈａｓ，１ｋｌＦＣした．ＴＭＶの再構成の実験には，ｒａｅｎｅ‐ ｏｎｒａｔらの方法（）に従って０．ＩＭピロ燐酸溶液１９５５（）を用い，計算上の再構成ＴＭＶの濃度がｌｍｇ／ｍｌになるようにＴＭＶ‐ＲＮＡと蛋白とＰＨ２を混合した．再構成ＴＭＶは超遠心分画法によって純化を行った．塩素は，次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣ工○）溶液を用いた．その際，水素イオン濃度をｐＨ６．５∼７．０に調整し，溶存塩素濃度は，チオ硫酸滴定法により使用の都度測定した．実験は一定濃度のＴＭＶ，ＴＭＶ−ＲＮＡ，ＴＭＶ蛋白および再構成ＴＭＶに一定量の塩素溶液を加え，０℃の条件において三角スラスコ内で反応させた．３０分後に２％沃化カリ溶液を加え反応を停止させた．この試料をｐＨ６．５∼７．０に調整し，チオ硫酸滴定法により残存塩素量を測定した．不活１空化の実験においては， ÷ 定濃度のＴＭＶあるいは再構成ＴＭＶに，一定量の塩素溶液を加え，０℃の条件において，試験管内で反応させた．３０分後に，溶液中０．２％以下になるように沃化カリを加えた．沃化カリがＴＭＶの感染力に何ら影響のないことは（８）.

(4) . ８９. ３系統のＴＭＶの塩素による不活性化. ０）すでに報告している（由崎・池畑・野村，１９７４）で一定濃ＰＨ７．．この試料を０．ＩＭ燐酸緩衝液（川北〆ねＺ ” Ｌメーラダム度に希釈した後，６０シのカボンをりかけたふ０ッョれαｇ“ ％ｏｓα ．の葉の表面になすりつけ接種を行い，３日後に生じた壊痘病斑数から不活性化の程度を調べた。. 実験結果１）ＴＭＶの塩素による不活性化と塩素反応量ＴＭＶの○，Ｌ，およびＣ系統について，塩素による不活性化を調べた．共栓試験管内のＴＭＶｌｍｇ／ｍｌ液（）に一定濃度の塩素水を加えた．その際，ＴＭＶの濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ，塩素の濃度は２５０，１００，および３００”ｇ／ｍｌになるように調整した。十分振湯した後，それらの試験管を，５，２００氷中に保って反応させた．３０分間の反応の後，２％の沃化カリ液を加えて反応を止めた．反応液を０ＴＭＶの濃度が，１０．０”ｇ／ｍｌになるように燐酸緩衝液（）を用いて希釈した後，亙０．ＩＭ，ＰＨ７．Ｚ ”瓦”ｏｓ αの葉に接種を行い，生じた壊痘病斑数からＴＭＶの不活性化の程度を調べた．なお，対照ｇ ′ として，無処理のＴＭＶ（）を同様に，亙ｇ０．５“ｇ／ｍｌ ““”ｏｓ αの葉に接種し，生じた病斑数を調べた．３系統のＴＭＶについてＮ，ｇＺ “瓦”ｏｓα の葉１枚当りの病斑数を第１図に示した。３系統のＴＭ. Ｖの塩素による不活性化の程度を比較すると，３００〆ｇ／ｍｌの濃度の塩素によって，３系統ともに完全に不活性化され，２００“ｇ／ｍｌの濃度の塩素ではＬおよびＣ系統が完全に不活性化されたが，０系統では活性がわずかに認められた．５０および１００”ｇ／ｍｌの濃度の塩素についてみると，Ｃ系統が最も不活性化され易く，次いでＬ系統が不活性化され易く，０系統の塩素に対する耐性は，他の２系統よ０）に懸濁させた１ｏｍｇの ○，Ｌ，および００ＩＭ，ＰＨ７り強かった．次に，１ｏｍｌの燐酸緩衝液（．，Ｃ系統のＴＭＶに５ｍｇの塩素を加え，氷中（０℃）で３０分間反応させ，対照として１ｏｍｌの燐酸緩００ＩＭ，ＰＨ７０衝液（）に塩素を加え，同様に３０分後の塩素反応量を求めた．それらの結果は第１．．表に示した．対照の燐酸緩衝液のみでの塩素反応量は，ほとんどなかったが，ＴＭＶに対する塩素８０. 圃ｏ系統. ６０に. 棲. 圏Ｌ系統４０. 圏Ｃ系統２０. １００. ０５塩素. 第１図. ２００ ”ｇ／“〆. 濃度. ３系統のＴＭＶの塩素による不活性化）と塩素とを混合し，０℃ で３０分間反応させた後に，ＴＭＶ（０．５ｍｇ／ｍｌＮ．ｇ卿云物ｏ接種ｓを行った．感染力は，Ｎ．ｇＺ郷すれｏ αの葉１枚当りのｓ αに平均病斑数で示した．（９）.

(5) . ９０. 由. 崎. 俊. 道. ２．６％，Ｌ系統では３１．２％，Ｃ系の反応量は，系統によって異なった．０系統では，加えた塩素の２Ｃ系統が最も多統では４９．０％の反応量を示した．この反応量は，塩素による不活性化の程度の高い低下し強い系統ほど塩素反応量がく，次いでＬ系統，０系統と塩素に対する耐性の，塩素に対する耐性とその反応量との間に関連のあることが認められた．第１表ＴＭＶの系統Ｏ. ＴＭＶ量（ｍ）ｇ. Ｌ. １０. Ｏ. ３系統のＴＭＶに対する塩素反応量塩素添加量（ｍｇ）. ）塩素反応量（ｍ）（％）（ｍ塩素残存量資ｇｇ. ５. ３．８７３．４１. １．１３１．５６. （２２．６）（３１，２）. ２．５５４．９０. ２．４５０．１０. （４９．０）. ５. Ｃ. 対照※※. （２．０）. ※. ＴＭＶと塩素とを混合し，０℃ で３０分間反応させた後の塩素量を測定した． ※賛対照には００ＩＭの燐酸緩衝液（ＰＨ７．０）を用いた．，．. ２）再構成させて得たｈｙｂｒｉｄＴＭＶの塩素による不活性化と塩素反応量 ○，Ｌ，およびＣの３系統のＴＭＶよりＲＮＡと蛋白とを，それぞれ分離し，ＣあるいはＬ系統ＩＭ，ＰＨ７２０）中で再構成させ，いわゆるのＲＮＡと０系統の蛋白とを，それぞれピロ燐酸溶液（．．ｈｙｂｒｉｄＴＭＶを作った同様に○あるいはＬ系統のＲＮＡとＣ系統の蛋白とで再構成させた．なお，．１００. □卿一閲 □−. ８０. Ｒ. ６０. 趣. ４０. ２０. ５０塩. 素. １００ βｇ／？ “′ 濃. 度. 第２図再構成ＴＭＶの塩素による不活性化０．５伽ｇ／粥Ｚ）と塩素とを混合し，０℃ で３０分間反応させ再構成ＴＭＶ（すｓ αの葉一枚 “Ｚれｏた後に，Ｎ．ｇ／ ””“ｏｓαに接種を行った．感染力はＮ．ｇ‘ びＬ−○はＣあるいはＬ系統のＣ−○およ斑数当りの平均病で示した．ＲＮＡと○ 系統の蛋白とを用いて再構成させたＴＭＶ． ○−ＣおよびＬ−Ｃは○あるいはＬ系統のＲＮＡとＣ系統の蛋白とを用いて再構成させたＴＭＶ，１０）（.

(6) . ３系統のＴＭＶの塩素による不活性化. ９１. 第２表再構成ＴＭＶの塩素反応量再構成ＴＭＶ芙の系統ＲＮＡ − 蛋白. ※ 塩素残存量※. 塩素添加量（ｍｇ）. ０. −. ○. Ｌ. −. Ｌ. Ｃ. −. Ｃ. ０. −. Ｃ. Ｌ. −. Ｃ. Ｌ. −. ○. ４．９６４，９６. Ｃ. −. ○. ４．９６. ．. 塩素反応量）（％）（ｍｇ. （ｍｇ）. ５．００４．９６. ３，３２１，９９. １，２５（２５，０）１，６４（１）３３，２，９８（６０ｏ，）. １，７４１，８４. ３，２２（６４９），３，１２（６２，９）. ３．７３. １，２４（２５，０）１，１５（２３．１）. ３，７５. ４．９７４．９６. ３．８１. ※ 再構成ＴＭＶはすべて１ｏｍｇを用いた．， ※※ 再構成ＴＭＶと塩素とを混合し０℃ で３０分間反応させた後の塩素量を測定した，．. Ｌ系統の蛋白と他の系統のＲＮＡと再構成させた場合には活性のあるＴＭＶが得られなかった．再０および１００〆ｇ／ｍｌ構成ＴＭＶを超遠心分画法によって純化した後に，塩素による影響を調べた．５５ｍｇ／ｍｌ０）の不活性化の程度を比較した結果を第２図に示した．このの塩素による再構成ＴＭＶ（．実験においてもＣ系統の蛋白をもって再構成させた○系統ＲＮＡ（○−Ｃ）あるいはＬ系統ＲＮＡ（Ｌ−Ｃ）のＴＭＶは，０系統の蛋白をもって再構成させたＣ系統ＲＮＡ（Ｃ−○）あるいはＬ系統ＲＮＡ（Ｌ−○）のＴＭＶと比較して塩素に対する耐性は低かった．次に，これらの再構成ＴＭＶに対する塩素反応量を前述と同じ方法で測定した結果を第２表に示した，Ｃ系統の蛋白と他の系統のＲＮＡとで再構成させた○−ＣあるいはＬ−ＣのＴＭＶの塩素反応量は，０系統の蛋白と他の系統のＲＮＡとで再構成させたＬ−○あるいはＣ−○のＴＭＶの反応量より明らかに多かった．また，同じ系統のＲＮＡと蛋白とで再構成させた○−○，Ｌ−Ｌ，Ｃ− ＣのＴＭＶについても塩素反応量を測定したが，第１表に示した無処理の○，Ｌ，あるいはＣ系統の場合と同様に０−○，Ｌ−Ｌ，Ｃ−Ｃの順序で反応量は増加した．３）ＴＭＶのＲＮＡおよび蛋白に対する塩素反応量３系統のＴＭＶのＲＮＡと蛋白に対する塩素反応量を前述の方法で測定した．その際，ＴＭＶ蛋２）中）と会合の生じない００５Ｍの燐酸溶液（ＰＨ０白が会合する０．ＩＭのピロ燐酸溶液（ＰＨ７，．０でＴＭＶのＲＮＡおよび蛋白の塩素反応量を測定した。また，ＴＭＶ蛋白については０．０ＩＭの燐酸緩衝溶液中での塩素反応量についても測定した．ＴＭＶ−ＲＮＡに対する塩素反応量は第３表に示す第３表ＴＭＶ−ＲＮＡ. の系統 ○. Ｌ. Ｃ. 異なる濃度の燐酸溶液中でのＴＭＶ−ＲＮＡの塩素反応量. ＴＭＶ−ＲＮＡ. 塩素添別量. 燐酸溶液の濃度※ 塩素残存量※※. ）の量（ｍｇ. （ｍｇ）. （Ｍ）. １０. ５．００. ０．１０．００５. ４．９６. ０，１０．００５. ４，９８. ０，１０．００５. １０. １０. （ｍｇ）. （％）. ４，７０. ０，３００，３１. （６，０）. ０．３５０．３８. （７，１）. ０．３６０，３５. （７．０）. ４，６９４，６１４，６０４．６３４，６３. ２）を用い，０．ＩＭはピロ燐酸溶液（ｐＨ７００５Ｍは燐酸緩衝液（ＰＨ７０．．０）を用いた，，塩素とＴＭＶ−ＲＮＡとを混合し，０℃ で３０分間反応させた後に塩素量を測定した．. １）（１. 塩素反応量. （ｍｇ）. （６，２）（７，７）（７．０）.

(7) . 由崎俊道. ９２. 第４表異なる濃度の燐酸溶液中でのＴＭＶ蛋白の塩素反応量ＴＭＶ蛋白の系統. 綴. 塩素残存量※※. 塩素反応量. 塩素添加量. ）の量（ｍｇ. （ｍ）ｇ. （Ｍ）. （Ｍ）. ）（ｍｇ. （％）. ３．９０１．９１. １．１０３．０９. （２２．０）（６２．８）. Ｏ. １０. ５．００. ０．１０．００５. Ｌ. １０. ４．９６. ０．１０．００５. ３．４９１．８６. １．４７３．１０. （２９．６）. ４．９８. ０．１０．００５. ２．１９１．６５. ２．７９. （５６．０）. ３．３３. （６６．９）. Ｃ ※. 燐酸溶液の濃度※. ＴＭＶ蛋白. １０. （６２．５）. ）を用いた．２）を用い，００．ＩＭはピロ燐酸溶液（ｐＨ７．５Ｍは燐酸緩衝液（ｐＨ７．０．００塩素とＴＭＶ蛋白とを混合し，０℃ で３０分間反応させた後の塩素量を測定した．. 第５表. 異なる濃度の燐酸溶液中でのＴＭＶ−ＲＮＡと蛋白との混合液の塩素反応量燐酸溶液の濃度※ 塩素残存量※※. 士塩素反応量. ＴＭＶの系統. ＲＮＡ十蛋白. 塩素添加量. ＲＮＡ十蛋白. ）の量（ｍｇ. （ｍ）ｇ. （Ｍ）. ５．００. ０．１０．００５. ３．７５２．００. １．２５３．００. ４．９６. ０．１０．００５. ３．３２１．９５. １．６４３．０１. ４．９８. ０．１０．００５. １．９９１．３６. ２．９９３．６２. ０＋ ○. Ｌ＋Ｌ. Ｃ＋Ｃ. ０．５＋９．５０．５＋９．５０．５＋９．５. （ｍ）ｇ. ）（ｍｇ. （％）（２５．０）（６０．ｏ）（３３．１）（６０．７）（６０．０）（７２．７）. ）用いた．ＩＭはピロ燐酸溶液（ｐＨ７．２）を用い，０．００５Ｍは燐酸緩衝液（ＰＨ７．００．塩素をＴＭＶ−ＲＮＡと蛋白（１：１９）の混合液に加え，０℃ で３０分間反応させた後の塩素量を測定した．. ように，反応量は比較的に少なく，加えた塩素量のわずか６∼７％であった．またＲ，ＮＡの塩素反酸溶液中び０ＩＭの燐でも差異は認め００応量については系統による差異が認められず，０５Ｍおよ．．られなかった．それに対し，第４表に示すように蛋白の塩素反応量は燐酸溶液の濃度によって異なり，また系統によっても明らかな差異が認められた．どの系統においても０．ＩＭのピロ燐酸溶液中での塩素反応量が最も少なく，０．００５Ｍの溶液中で最も多かった．また０．０ＩＭの溶液中では，それらの中間の塩素反応量を示した．ＴＭＶ蛋白の０．ＩＭと０．００５Ｍとの溶液中での塩素反応量の差異の最も大きい系統は０系統で，次いでＬおよびＣ系統の順序でその差が小さくなった．この結果から，ＴＭＶ蛋白の塩素反応量は会合状態が進むにつれて減少し，その減少の程度は塩素に対する耐性の強い０系統では大きく，耐性の弱いＣ系統は最も少なかった．次いで，ＴＭＶのＲＮＡと蛋白との混合液について塩素反応量を測定した． ○，Ｌ，およびＣの３系統のＴＭＶのＲＮＡと蛋白とを，ＴＭＶ粒子のＲＮＡと蛋白と同じ比率になるように０．５ｍｇ）のＲＮＡと９．５ｍｇの蛋白（１：１９の割合）を１ｏｍｌの０．ＩＭのピロ燐酸溶液（ＰＨ２，あるいは）中で混合した．３０℃に一定時間放置した後，０．ＩＭピロ燐１ｏｍｌの０ＰＨ０．００５Ｍの燐酸緩衝液（酸溶液ではＲＮＡと蛋白から活性のあるＴＭＶが再構成され，それに対し０．００５Ｍ燐酸溶液では，そのような再構成がなされないことを確かめた．これらの試料について０℃における塩素反応量を前述と同じ方法で測定した．その結果を第５表に示した．ＴＭＶのＲＮＡと蛋白との混合液の塩素反応量は０．００５Ｍと０．ＩＭ溶液とで差が生じた．０．ＩＭのビロ燐酸溶液中で粒子へ再構成されることによって塩素反応量は，再構成されない０．００５Ｍの燐酸溶液中の反応量より減少した．その減少（）１２.

(8) . 口にる一′ ３系統のＴＭＶの塩素による不活性化. ．. ９３. の程度は，０系統が最も大きく，Ｃ系統が最も少なく，Ｌ系統はそれらの中間であった．この結果はＴＭＶの蛋白の塩素反応量（第４表）とほぼ一致していた．. 論議お１よび結論一定の条件でのＴＭＶに対する塩素の不活性化効果については，すでに報告したが（由崎・池畑・野村，１）９７４；由崎・池畑，１９７７，それによると塩素によるＴＭＶの不活性化は系統によって異なり，Ｃ系統は○系統よりも塩素による不活性化作用に対して，耐性が強いことが認められたが，両系統から分離されたＲＮＡには塩素に対する耐性には差異はなかった．本研究では，ＴＭＶの３系統について塩素による不活生化の程度を比較した結果は，Ｃ系統の耐性が最も弱く，次いでＬ系統，０系統の順で耐性は強かった．それと同時に，３系統の塩素との反応量を測定した結果は，耐性の最も弱いＣ系統の塩素反応量が最も多く，次いでＬ系統，０系統の順で反応量が少なく，ＴＭＶ系統の塩素による不活性化とその反応量との間に関連のあることを認めた．ｌｌｌｉａｍｓは，ＴＭＶを核酸と蛋白に分けこの両者をふたたび試１９５５年Ｆｒａｅｎｋｅ ‐ＣｏｎｒａｔａｎｄＷｉ，. 験管内でＴＭＶ粒子に再構成させた．この再構成の実験は，さらにＴＭＶの系統間で，その核酸とｈｙｂｒｉｄ蛋白を入れ替えて再構成し，新らしいウイルス系統（ｌ）を作り出す研究も行われた（Ｆｒａｅｎｋｅ − ＣｏｎｒａｔａｎｄＳｉｎｇｅｒ１ｏｕｂｅｋ，１９６２；。ｈａｓｈｉｅ云 αん１９６７；ｏｎｄａ１９７２）．Ｓｔｒｅｅｔｅｒａｎｄ，１９５７；日ｏ，Ｇｏｒｄｏｎ（１９６８）は，ＴＭＶのＵ，系統とＵ系統のＲＮＡと蛋白の組み替えを行って再構成させたｈｙｂｒｉｄＴＭＶの紫外線に対する耐性を調べた結果ＴＭＶの系統の紫外線に対する耐性はＲＮＡに. ，関係なく，外被蛋白に依存していることを認めた．同様な結果は，梅ｉ＝」大島（）によ，１９７１っても報告された。同じように，本研究の塩素を用いた場合においても，ＴＭＶ‐ＲＮＡと異なる系統のＴｉｄＴＭＶの塩素による不活性化およびその反応量は，ＲＮＡに関係ＭＶ蛋白とで再構成させたｈｙｂｒ. なく，蛋白によって支配されていることを確かめることが出来た．ＴＭＶ蛋刻ま，一定のイオン強度の下では，試験管内でさまざまな会合状態を示し，酸性領域ではＴＭＶ‐ＲＮＡがなくとも蛋白のみで，ＴＭＶ粒子と区別のつかない棒状の会合体を形成する．これに対し，中性領域では，デスク型の会合体となり，高ｐＨ，低イオン強度のような条件では蛋白は会合しないでｓｕｂｕｎｉｔの状態で存１１Ｒｉｈｄｉｌｌ在することも知られている（Ｄｕ）．本研究での３ｒｈａｍ鑑 αん９７；ｃａｒｓａｎｄＷｉａｍｓ，１９７６系統のＴＭＶの蛋白に対する塩素反応量を，蛋白が会合する０．ＩＭピロ燐酸溶液と蛋白がほとんど会合しない０．００５Ｍの燐酸溶液中で測定した結果は，系統によって異なったが，どの系統においても蛋白が会合しない０．００５Ｍの溶液中での塩素反応量は，０．ＩＭ溶液の場合より多かった。すなわち，１ｏｍｇのＴＭＶ蛋白に塩素を加えた時の３０分後の０．ＩＭと０．００５Ｍの燐酸溶液中の反応量（ｍｇ）は，Ｃ系統では２，７９と３．３３，Ｌ系統では１．４７と３．１０，０系統では１．１０と３．０９であった．. ＴＭＶのＲＮＡと蛋白とを１対１９の割合で混合し，蛋白のみの場合と同様に上記の００５．ＩＭと０．０Ｍの燐酸溶液中で塩素反応量を測定した結果も蛋白のみの結果と大差なかった．また，ＴＭＶ−ＲＮＡの塩素反応量は，３系統間に差はなかった．ＴＭＶ‐ＲＮＡに対するＴＭＶ蛋白の紫外線および塩素に対する保護効果は再構成されない０．００５Ｍ燐酸溶液中よりも再構成される０．ＩＭのピロ燐酸溶液中に保つことによって著しく高まることは，すでに報告した（由崎・池畑，１９）８０．以上の結果から，ＴＭＶの系統間の塩素の不活性化作用に対する感受性および反応量の差は，Ｔｉｔ蛋白に依存しているが，それらの蛋白小単位（ＭＶ‐ＲＮＡに直接関係なく，各系統のｃｏａｔ）ｓｕｂｕｎが，会合したときの性質の差によるものと結論できる．）（１３.

(9) . ９４. 由. 崎. 俊. 摘. 道. 要. ＴＭＶに塩素を０℃ で３０分間反応させた時のタバコ・モザイク・ウイルス（ＴＭＶ）の３系統にｉｔ）ｒａｎｓついて塩素による不活性化に対する感受性を調べた．その結果，アブラナ（Ｃ‐ ，トマト（Ｌ‐ ｉｎ），次いで普通（０‐ ｉｔｔ１）に塩素（５）の系統の順序で感受性が弱くなった．ＴＭＶ（ｏｍｇｒａｓｒａｎｓ. ）を０℃ で３０分間反応させた時の塩素反応量は，不活性化に対する感受性と同様にＣ，Ｌ，次いｍｇｉｄで０系統の順序で少なかった．０あるいはＬ系統のＲＮＡとＣ系統の蛋白とで再構成させたｈｙｂｒｉｄＴＭＶより塩素によＴＭＶは，ＣあるいはＬ系統のＲＮＡと○系統の蛋白とで再構成させたｈｙｂｒる不活性化に対する感受性は高く，また塩素反応量も多かった．この結果は，ＴＭＶの塩素に対すｔ蛋白によることを示している感受性および塩素反応量は，このウイルスのＲＮＡに関係なく，ｃｏａる．このことを確かめるために，３系統から分離した蛋白の塩素反応量をＴＭＶの場合と同様に測定した．この実験では，１ｏｍｇの蛋白と約５ｍｇの塩素を用いて２種の燐酸溶液中で行った．その２）γ他の溶液は，蛋白がほとんど会合しない０溶液は，蛋白が会合する０．ＩＭピロ燐酸溶液（ＰＨ７．．Ｈ０）を用いたその結果ＩＭと０００５Ｍの燐酸緩衝溶液（Ｐ．００５Ｍ燐酸溶液での塩素，各系統の０．．反応量は，Ｃ系統の２，７９と３．３３ｍｇ，０系統の１．１０と３．０９ｍｇであっ，Ｌ系統の１．４７と３．１ｏｍｇ. た．０．ＩＭピロ燐酸溶液中での塩素反応量は系統間に明らかな差が認められた．それに対して，０．００５）とＲＮＡ（）９．５ｍｇ０Ｍ溶液中での系統間の反応量の差は，わずかであった．各系統の蛋白（．５ｍｇとを上記の０．ＩＭのピロ燐酸溶液および０．００５Ｍの燐酸緩衝液中に混合して塩素反応量を測定したが，，結果は蛋白のみの場合と，ほとんど同じであった．さらに，３系統のＲＮＡの塩素反応量には系統間の差はなかった．以上の結果から，ＴＭＶの系統間の塩素による不活性化に対する感受性おｔ蛋白の性質に依存していると結論した．よび塩素反応量の差は，各系統のｃｏａ. 引用文献ｉｏｎｏｆｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｉｎＩｉＤｕｒｈａｍ，Ａ，Ｃｃｖｓｐｒｏｔｅｎ．，Ｓｔａｔｅｓｏｆａｇｇｒｅｇａｔ，日，．Ｔ．Ｆｉｎｃｈ，ａｎｄＡ‐ Ｋ１ｕｇ，１９７１，ｊＮａｔｕｒｅ２２９：３７一４２．ｌｉｉｉｎａｎｄｉｉｄｌｉｉｏｎｏｆｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａＤｕｒｈａｍ，Ａ．Ｃ．Ｈ．ａｎｄＡ．Ｋ１ｔｃｖｒｕｓｐｒｏｔｅｓｃｏｎｔｒｏｕｇｚａｔｙｍｅｒ．ｌｂ．２２９：．Ｐｏ，１９７１４２一４６．ｉｉｄｌｉｉＦｒａｅｎｋｅｌｔｈａｃｅｔｒｏｏｇｙ４：１−４ｃｖｉｒｕｓｗｉｃａｃ ‐Ｃｏｎｒａｔｏｎｏｆｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａ主＃ａｄａｔ．Ｖｉ・．Ｄｅ，日・，１９５７ｉｌｉｉｄＶｉｉＣｂｉｉｆｌＨｄＢＳｉ１９５ｉｒＦｒａｅｎｋｅ７ｔｔｔｔｔ１１ｎｏｎａｎｄｎｕｃｕｓｒｅｃｏｎｓｕｏｎｏｍｎａｏｏｅｅｃａｃａｎｎｅｒｒ ‐Ｃｏｎｒａｔｐｇ．．．．，．，ｉｉｍ．ｂｉｉｆｆｅｆｔｒｅｎｔｓｒａｎｓｏｃｈｏｐｈｙｓｒｏｍｄ．．Ａｃｔａ２４：５４０一５４８．ＢｉｉｉｉｉｌＦｒａｅｎｋｅｔｈｏｄｓａｎｄｔｔｕｔｃｖｒｕｓｎｇｅｒｏｎｏｆｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａ ‐Ｃｏｎｒａｔ．ｌｎ．ｌｎｐｒｏｖｅｄｍｅ ‐Ｒｅｃｏｎｓ，Ｈ．ａｎｄＢ．Ｓｉ，１９５９ｉｌｉｉｄｌｂｄ３３３９３０５７ｔｈｅｕｓｅｏｆｍｉｘｅｄｎｕｃ一．ｅｃａｃ．．：ｉｉｆｉｏｎｏｆｖｉＩＲＮＡｂｙｍｅａｎｓｏｆｂｅｎｔｏｎｉｉｔｅｌＦｒａｅｎｋｅｔａｒａｃａｔ ‐Ｃｏｎｒａｔ」Ｐｕｒ．，Ｂ．ＳｉｎｇｅｒａｎｄＡ．Ｔｓｕｇ，１９６１，Ｈ．Ｖｉｌｏｇｙ１４：５４−５８ｒｏ．ｉｉｉｉｉｏｎｏｆａｃｔｉｌｌｌｉＦｒａｅｎｋｅｔｕｔｔｔｒｕｓｆｒｏｍｉｎａｃｔｃｖｓｉｖｅ −Ｃｏｎｒａｔａｍｓｅｃｏｎｓｖｅｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａ．Ｒ ‐ ，Ｈ．ａｎｄＲ．Ｃ．いｉ，１９５５ｉｉｉｄｃｏｍｐｏｎｅｎｔｉｎａｎｄｎｕｃｌｓｅｃａｃｐｒｏｔｅ．．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃ．Ｕ．Ｓ．４１：６９０−６９８. 後藤忠則・大島信行，１９６２．ヤチイヌガラシから分離されたタバコ・モザイク・ウイルスの一系統について．日植病報２７：１０９一１１４．ｉｉｉｌｉｉｎｆｂｏｎｕｃｌｉｘｅｄｒｅｃｏｎｓｉｉｏｎｂｅＨｏｔｔｕｔｔｗｅｅｎｐｒｏｔｅｒｕｓａｎｄｒｅｃｒｏｍｃｏｍｍｏｎｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｃｖｏｕｂｅｋ．Ｎ１，Ｖ．１９６２Ｖｉｌ１８４０１４０４ｉｄｆｔ一ｎｓｒｏｏ：ａｃｒｏｍｏｔｈｅｒｓｒａｉｇｙ．．ｉｏｎｉｉｉｉｉｔｄｂｉｂｉｔｔｏｈａｓｈｉｔｔｕｔｃｖｒｕｓｉｎｖｒｏｏｎｏｆｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａ．ｌ．Ｒｅｃｏｎｓ，１９６９，Ｙ．，Ｔ．ｏｈｎｏ，Ｙ．Ｎｏｚｕ，ａｎｄＹ．ｏｋａｄａ. ）（１４.

(10) . ３系統のＴＭＶの塩素による不活性化. ９５. ｉｂｙｃｏａｔｐｒｏｔｔｒｓｒａｉｎｓｎｓｏｆｏｔｈｅｅ．．Ｐｒｏｃ．ｊａｐａｎＡｃａｄ．４５：９１９一９２４. ９６４大島信行・後藤忠則・佐藤倫造，１．トマトから分離したタバコ・モザイク・ウイルスの一系統（ＴＭＶ−Ｌ）３：８７一９９について．北海道農業試験場桑報８．. ｉｉｉｎｓｏｆｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｉｍａｉａｎｄＭ，ＵｍｅｋａｗａｉｔｏｈｓｈｒａＣｖｒｕｓｐａｔｈｏｇｅｎｃｅｓｏｎｓｏｍｅｓ，Ｓｔｕｄ，１９７１，Ｎ，，Ｙ，。ｈａｓｈ７２ＡＰｈｈＳ３３１９一３５ｉｆｅｒｐｌＪｔｔｔｏｃｒｕｃｔｎ：ａｎｓ．．ａｐａ．ｎｎ．ｙｏｐａ．ｏｃｌｏｉｉｉｂｌｙｏｆｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉ×ｅｄａｓｔｏｎｄａｒｕｓｉｎｖｒｏｒｏｓｅｌローｃｖ ≦穿４７：７７３−７７９，，Ｖｉ，Ｎ１，Ｈ，１９７２ｌｏｉｉｉＡｂｌｆｂｉＲｉＫＥＣ ▽ｉｌｌｉ１９７６ｔｄＲｔｕｓｉｒｏｖｅＶｉｒｏｅｍｏａｃｃｏｍｏｓａｃｖｒｎｖｎａｍｓｓｓｏｃｈａｒｄｓａー弾ｙ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓ．．，，．，，６：１−３７．ｉｉｌｄｍａｎｉｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｉｎｆＳｉｌｔｃｖｉｒｕｓｂｙｅｃｏｕｓｃｅｎｔｅｒｓｏｆｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｅｇｅ．Ｔｈｅｉｎａｃｔ．Ｇ．いｉ，１９５６，Ａ．ａｎｄｓｄｉｌｉｇｈｔｔｔｌｕｌｒａｖｏｅ，２：６９−８２．．ｌｂｉｌｉｉｌｉｌｄｍａｎＳｉｔｔｈｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｎｆｅｃｏｎｗｉｃｖｉｒｕｓｓｏｆｉｅｇｅｎｏｓａｙｅｖｅｎｔ．Ｔｈｅｅａｒ．Ｇ．斬′ ．Ｇｉ，１９５７，Ａ．，ＶＶ，ａｎｄｓｌｄｉｄ３４ｉｉ工ｂ５５５９ −５ｎｕｃｅ：ｃａｃ．．．ｌａｎｔｖｉＳｔｉｆｉｉｏｎｏｆｐｎＶｉｒｕｓＲｅｓｒｕｓｅｓｅｅｒｅｃａｔ．６：１−７０．．Ａｄｖａｎｃｅｓｉ．Ｔｈｅｐｕｒ，Ｒ．Ｌ．，１９５９ｉｉｉｎａｃｔｉｉｏｎＳｈｌｆｈＳｔＤｄＰＧｄ１９６８ｄｉｆｔｔｔｔＧｔｔｅｒＭ ‐ ｖａｔｅｒｏｅｏｅｃｏａｒｏｅｎｎｔｈｅＵ．Ｖ．ｐｈｏｔｏｒｅｅｎｏｒｏｎｕｅｓｏａｐ．．．．，，．１ｏｆＵ（）ａｎｄＵ（２）ｓｔｒａｉｎｓｏｆＴＭＶ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．．８：８１−９２ｌｉｉｎｉｌｉＴａｋａｈａｓｈｉｔａｂｓｏｒｐｔｔｒｕｓｎｕｃｅｏｐｒｏｔｅｅｏｎａｓａｍｅａｓｕｒｅｏｆｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｃｖｒａｖｉｏ．．Ｎ．．Ｕ１，ＶＶ，１９５１１１２Ｐｈｙｔｈｌ４４４５ｔ一１ｏｐａｏｏｇｙ：．. ０７梅ｉ９７１Ｈ学・大島信行，１，ＴＭＶ系統の紫外線に対する感受性．日植病報３７：２．バゾ由崎俊道・池畑昭・野村邦重，１９タコ・モザイク・ウイルスに対するオンおよび塩素の影響．北海道教７４．ＩＢ，２６：５５一６１育大学紀要１。由崎俊道・池畑. ｌｂｉｄバ昭，１９７７．２８：３ −６．．タコ・モザイク・ウイルスのオゾンおよび塩素による不活性化．. ｉｄｂ由崎俊道・池畑昭，１９８０，．タバコ・モザイク・ウイルス核酸のオゾン，塩素，および紫外線による不活性化．ｌ３１：１３一１８．. ）（１５.

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