有 受 精 鶏卵法 用性 前 立腺 癌 転移実験

ヒ ト前立腺癌^の転 移 実 験 ^モ デ ^ルと して ^の受精鶏卵法^の有用 性

金 沢 大 学 医 学 部 医 学 科 泌 尿 器 科 学 講 座(主 任: 並 木 幹 夫 教授)

小 林 忠 博

前 立腺 癌^の転 移 形 成^{に お}ける特 徴 的 な所 見^{と し て}骨 転 移^の頻 度が高^いこ と があ げら れ, 骨 転 移^の有 無は前 立 腺 癌^の予 後 を 規 定 する重 要な因 子である^. 前 立 腺 癌の予 後 を 改 善 す^{る た め に は}骨 転 移^の克服が最 も 重 要な課 題であ り, そのた め に は再 現 性^の高^い前 立腺 癌^の骨転 移^モデ^{ル の}樹立 が必 要 不 可 欠と考 え^{ら れ る.} 本研 究^{で はヒト}前 立腺 癌^の転 移 実 験^モデ^ルと し て受 精 鶏 卵 法 を 応 用^し, その有 用 性^について考察し た^. さら に, 本 法 を 用^いて P C^‑3 細 胞^の転 移に対 するスラ ミン の抑 制効 果について 検 討 を 行った^･ 膵 卵1 0日目^の受 精 鶏 卵 紫 尿 膜上^の血管 内より, 1 ^×1 0⁶ 佃^{の P C‑3} 細 胞 を 移植^し, 経 時 的に肝お よ び大 腿骨 を 摘 出し た･ 転 移 細 胞^の検 出^{な ら び に}定 量^は, 各臓 器^より 抽 出し た D N A を鋳 型と し て, ヒトβ^{‑グロ ビン}遺 伝 子^に対 する P C R 法に よ る増 幅 反 応 と そ れに次 ぐサ ザ^ンプ^ロ ッ ト法に よ る増 幅D N A 断 片^の解析 肝^{C R‑サ ザンプロッ ト}法) ^{に よ}り 行^った. そ^の 結 果, P C^‑3 細 胞は肝^{お よ び}骨 転 移 を^{1 0 0 %}形 成 す^{る こ と が}明^{ら か に}な^った. さ ら に P C R^‑サザ^ンプ^ロ ッ ト法に より, 転 移細 胞

の定 量 的 解 析 も 可 能であ^った^. すな わち, 臓 器 あ^たりの転 移 腫 瘍 細 胞 数は移 植後経 時 的に増 加し, 移 植後^{7 日目の}肝^{で は}約 9 ユ×1 0⁶ 胤 また大腿骨で は約9.9^×1 0³ 個の転 移 細 胞^が検 出^{さ れ た.} 組織 学 的検 索^の結 果, 移 植² 時 間 後^の肝に お^いて微 小血 管 内^に存 在^{し ていた P C‑3} 細胞^は, 1 日目で は 血管 外^へ浸 潤^し, 3 日目以降, 肝 実 質に お^いて分 裂 増 殖 像 を 示しつ つ転 移巣 を 形 成し た^{. 一}方, 大 腿 骨に おいて は_, 形態 学 的に腫 瘍 細 胞^の同 定は困 難^であっ た が, 抗^ヒト サ イ ト ケ ラ チン抗 体お よ び抗^ヒト

Ⅲ^‑6 7 抗 原 抗 体^{に よ る}免疫 組麟^{化 学 染 色に より, 7 日目で初め て骨 髄 内お よ び骨 膜 内に}転 移 巣^の形 成が確 認さ れ た^. 続^いて_, 本 法 を 用^いて P C^‑3 細 胞^の肝 転 移 巣お よ び骨 転 移 巣に対 するスラ ミン の抗 腫 瘍 効 果について検 討^{し た. P C‑3} 細 胞 を渠 尿 膜^上の 血 管に移植 後1 日日 また は 3 日目に^スラ ミ^ンを 投 与^し, 7 日目^に肝お よ び大 腿 骨 を摘 出し て, P C R サ ザ^ンプ^ロッ ト法に よ る 転 移 細 胞^の検 出お よ び解 析 を 行った^･ その結 軋 P C^‑3 細 胞 移 植 後1 日目にスラ ミン (^{5 0}〃g/ 卵) を投 与 し^た場 合は, 明ら かな 転 移抑制 効 果は認め ら れなかっ た.

一方, 移 植後^{3 日日にスラ ミン}(^{50 0}〃 g/ 卵) を投 与し た場 合, 肝 転 移 巣に対し て は6 0^.6 % の増 殖 抑 制 率 を 示し た が, 骨 転 移に対し て は6^.7 % と抗 腫 瘍 効 果^は認め ら れなかっ た^. 以上の結 果より, 受 精 鶏 卵 法は再 現 性

の高い ヒト前 立 腺 癌 細 胞^の骨お よ び肝^への転 移 実 験^モデ^ルと し て, ヒト前^立腺 癌^の転 移 あ^るいは浸 潤^の機 序 解 明お よ び治療 薬 開発の基 礎 的 研 究^に有 用^な実 験 系^{に な}り う^るも^のと考えら れ た.

E ey w o rd s p^{r o s}tate c a n c e r_, m eta Sta Sis, Chick e m bry^o,P C^‑3_,S u r a min

高齢 化 と生 活 様 式^の欧 米 化に よっ て, 我が国^の前 立 腺 癌^の慣 恩 率^{お よ び 死}亡 数^は増 加 傾 向にある^{l ). こ}れ ま で前 立 腺 癌^の過 半 数^の症 例^は初 診 時 既に遠 隔 転 移 を 有し^{2 )}根 治 的治 療は困 経で あっ た. し かし, 経 直 腸 的超 音 波 断 層 法お よ び腫 瘍^{マ ー カ ー} と し ての前 立 腺 特 異 抗 原 br o state sp^{e c}i丘c a nti_ge n, P S A) ^の臨床 応 用が進む につれ て, 前 立腺 癌^の早 期 診 断^が可 能^にな り^{つ つ}あ る^{3 ,.} 最 近で は逆 転 写 ^‑ ポ リメラ ^ー ゼ連 鎖 反 応 (r e v e r s e tr a n s c rip tio n^‑P C R, R T^‑P C R) 法^{に よ る}腫 瘍 細 胞^{の P S A mR N A}

の検 出^が可 能^{と な}り, 従 来^の診 断法で は検 出不 可 能^であっ た微 小 転 移^の存 在が明ら か とな^っ てきた^{4 ). こ}れ ら^の微 小 転 移^に対 する治 療 手 段^の開発^は前 立腺 癌^の根 治的 治療に必 須である^. そ し て, 微 小 転 移に対 する抗 腫 瘍 効 果 を 評 価 する た め に は^ヒト前 立腺 癌 転 移を効 率^よく 再 現^できる転 移 実 験^モデルを 樹 立 する必 要があ^{る. こ}れまで, ヒト前 立 腺 癌^の転 移 実験^モデルと し て は,

ヌ ^ー ドマウス^{5 卜 8)}や S C I D マウ^スg)を 用^いた方 法^が報告^{さ れ て}き

た. し か し, 実 験 動 物^{のコ ス}ト, 特 殊な動物 実 験 施 設^の必 要性,

転 移 形 成 率の再 現性^に問題 を 残し ており, 治 療 実 験^モデ^ルと し

て ^一般 的に応 用さ れ る に至^って^いな^い. 受 精 鶏卵 法^は, ヒト腫 瘍 を 含め実験 動 物 腫 瘍 を 宿 主動 物に移植 する方 法と し て, 手技

の簡便^さ, 移植 腫 瘍^の生者率が高^いと^いう 点^で優れ て^いる^{岬巨 l 射} さ ら に, 短 期 間^で効 率 的に し かも安 価^に転 移 実験が 可能である こと に加 え, P C R 法 を 応 用 す^{ること に よ り}定 量 的^に転 移細 胞

の検 出が可 能である^{1 5 )こ}と か ら, 特に治 療 薬 開 発^のた めの スク

リ ^{ー ニ} ング法と し て^の応 用が期 待^{さ れ る.} 本研 究^{で は}, 受精 鶏 卵 法 を応 用し た^ヒト前 立 腺 癌^の転 移 実験^モデ^ルに^ついて検討 す る と ともに, そ^の応 用と し て本 実 験系を 用^い, 現 在ホ^{ル モ ン}抵 抗 性 前 立 腺 癌 転 移 患 者^の治 療 薬と し て注目 さ れ て^いるスラ ミ

ン^{1 6 卜 1 8)}の抗 腫 瘍 効 果に^ついて検 討 を 行^い, 治 療 薬^の効 果 判定 法

と し ての有 用 性について考 察^{し た.} 材 料お よび方 法

Ⅰ. 実験 腫 瘍 細 胞お よび培 養 法

ヒ ト前 立 腺 癌 培 養 細 胞 P C^T3^{1 9 )} [Am e ric a n Ty pe Cultu r e

Co11e ctio n, Ro ck vi 11e, U S A] ^は, 1 0 % 付/^v) 非働 化^{ウ シ}胎児 血

平成⁸ 年^{1 1}月^{1 8}日受付, 平 成8 年12月1 9日受理

A b br e viatio n s :b p^, ba s e p^air; E P O S_, e nha n c ed _pol_ym e r o n e^qstep ^staining ;I R,

r

inh ib itio n r ate; M T T, 3^‑(⁴,5^‑ dim eth _ylt hia z ol^‑2ヤ¹)^‑2, 5^‑di_phe nyltet_{r a z o}liu m b_{r o m}ide;P S A, P^{r O S}tate Sp^{e C}i五c anti g^{e n;}R T^IP C R_, r e V e r S e tr an S Cripd o n^‑

P C R;T E , m S^‑E D T A

ヒト前立腺 癌 転 移 実 験^モデル

清(fetal c alf s e ru m , F C S) (G I B C O, Gr a nd Isla nd, N Y, U S A) と 0^.3mg/^{ml グルタ ミン}(^日水 製軋 ^{東 京) を 含む R P M I‑1 6 4 0培} 地 (^日水 製薬) 中に お^いて! 5 % C O2濃 度, 3 7 ℃ で培 養^{し た･}

Ⅰ^. 実 験動 物

本 研 究^で培 養 細 胞^の移 植宿 主動 物^{と し て}用^いた受 精 鶏卵(^プ リ^{マス ロツ}ク種^×ホ ワ イ トレグ ホ^ン種) は後 藤膵 卵 場 ( 岐 阜) ^よ り購入 し, 加 湿し た3 7℃膵 卵 器 中^で膵 卵し た･

Ⅱ. 培 養 細 胞の移植 方 法

受 精鶏 卵^{へ のP C‑3} 細 胞^の移 植は U ch ida ら^{1 4 )}の方法に準じ て 行^った. す なわち, 膵 卵1 0 日目^の鶏 卵 を透 光^し, 渠 尿 膜^上の血 管^の位 置^を定^め, 回 転 式^のヤスリを 用^いて卵 殻に 1c 皿×0^･5c 皿

程度^の傷を付 け, ピンセッ トを 用^いて卵 殻 を 除 去し た･ 露 出し た卵 殻 膜^に流 動^パラフ ィ ン(Me r ck, Da r m stadt

, Ge r m a ny) を 滴 下し 血管 を 見やす くし, 3 0 ゲ^ー ジ針を用^い て 1 ×1 0⁷個/ml に 調製^{し た P C‑3} 細 胞 浮 遊 液, 0^.1ml(^{1 06}個/ 卵) ^を渠 尿 膜^上の血管 内に移 植^{し た.} 移 植 後1, 3 , 5 お よ び 7 日日に胎 児 を 屠 殺し,

肝お よ び左 右^の大 腿 骨 を摘 出し 以 下^の検 討^に用^{いた･ ま た}同^一 個体^の肝^{の 一} 部お よ び村側^の大 腿 骨 を1 0 % ホ^{ル マ}リ ^ンに て固 定 後, H E 染 色に て標 本 を 作 製^し, 肝 転 移, 骨 転 移^の有 無 を 病 理 組織 学 的^に検 索し た^.

Ⅳ^. 免疫 組織 化 学 染 色

転 移 巣がヒト由 来である こ と を証 明 す^{る た め}, ヒト特 異抗 体 を 用^いた免 疫 組 織 化 学 染 色 を 行^った. 免 疫 染 色に は, 増 幅^{ポ リ}

マ ^{ー ー}段階 染 色 (e nha n c ed _pol_ym e r o n e^‑SteP Staining, E P O S)

法^{2 0 )に て}行^い, ホ ^ー スラ ディ ッシ^ュペ ルオ キ シ ダ^ー ゼ標 識抗^ヒ

ト サイト ケ ラ チ ^ン抗 体 (M N F l 1 6, E P O S/H R P , D A K O ,

G lo str up, De n m a rk), 抗^ヒト Ki ^‑6 7 抗 原 抗 体 (^{E P O S}/^{H R P},

D A E O) を使用^{し た.} す なわち, 1 0 % ホ^ル マリン固 定^パラフ ィ ン包埋 切 片を脱^パラフ ィ ン, 親 水 化^{し た}後, サ イ ト ケ ラ チ^ンに 対 す^る免 疫 染 色に はプ^ロテ ィ ナ ^ーゼ K(D A K O) ^で室 温6 分 間酵 素処理 し, また, 和^一6 7 抗 原^に対 す^る免 疫 染 色に は, 1 0m M ク

エン酸 横 衝 液 b^{H 6.0}) に切 片を浸し^マイ ク^ロ ウエ ^ー ブ処^理を5 分間 行^った. 3 % 過 酸 化 水 素水^{に て1 0}分 間, 内因 性^{ペ ル}オ キ シ ダ^ーゼ活性 を 阻 止し た後, 非特 異 的 反応^を阻止 す^{る た め 3 % ウ} シ 血清^{アルブ ミン} (^{D A E O}) を⁵ 分 間 反 応さ せ た^{. つい}で, 抗

ヒトサ イ ト ケ ラ チ^ン抗 体 を 室 温^{6 0}分 間 反 応^{さ せ た.} また, 抗^ヒ ト Ⅲ^‑6 7 抗 原 抗 体は, 4 ℃ で山^一晩 反 応さ せ た^{. 一} 次 抗 体^の反応 終 了後, 0^.1 % ^の過 酸 化 水 素水^を含有^{し た 3}, 3^' ジア ミ ノベ ンチ ジン(^{3, 3,Ldia min obe n zidin e, D A B, D A K O}) を 滴下 し て室 温 1 0分 発 色 反応 を 行^{っ た. さ ら に}核 染 色を^ヘ マ ト キ シ リ^ンに より

行った^.

Ⅴ. D N A 抽 出

摘 出 臓 器^{の D N A は D N Az ol}( G^{I B}C O) を用^いて抽 出, 精 製し た. すな わち, 摘 出し た肝に 1ml の Tris^‑E D T A (^{T E}) 緩 衝 液 (^{ニ ッポンジー ン}, 束 京) ^を加 え^{ガ ラスホモジ ナ イ}ザ^ー を 用^いて ホモ ジ ナイズ し, そ^のホモジネ^ー ト 1 0 0 _〃1 に対^{し て 1ml の} D N Az ol を 加 え 懸 濁^{さ せ た.} また, 大 腿 骨は 1ml の D N Az ol を 加 えホモ ジ ナ イ ズ し た後, 4 ℃, 1 5,0 0 0rp^{m ,} 1 5分 間遠 心^{し た･}

上層 を 新 し^{いチ ュ ー ブ に}移し, 0^.5ml の9 9 % ^エタ^{ノ ー ル}を 加 え 混合 し, 室 温 下5分 間 放 置し た後, 液中^に浮 遊 す^{る D N A} を 得 た^. D N A を新し^いチ^{ュ ー} ブ に移し, 1ml ^の9 5 % ^エ タ ノ ^ー ルを 加 え2 阿洗 浄し, 風 乾し た後^{8m M} 水 酸 化^ナトリ ウム水 溶液^を 加 え 溶 解^{さ せ た.} さら に, 0^.1 M H E P E S (S ig ^{m a,} S t. Lo uis,

U S A) を 加 え, pH を7.5 に調 整し た.

7 9 7

Ⅶ^. 鋳 型D N A の調整

各D N A ^の 2 6 0n m に おける O D 値 を 測 定し て D N A 濃 度 (¹ 0 D ⁼5 0〃g/^ml) を 求^{め た}後, 滅 菌 蒸 留 水を用^いて 1 0 0_{〃 g}/ml に調 製し た^. さ ら に, 1 0 0_FLg/ ml ^のP C^‑3 細 胞^{の D N A} を 滅菌 蒸 留 水^{に よ}り 希 釈^し, P C^‑3細 胞^のD N A 濃 度が 1 0², 1 0, 1 , 10.^l

,

1 0【²_, M ｢³_{〃 g}/ml^の段 階希 釈溶 液^を調 製^{し た･}

Ⅶ. P C R プラ イ^{マ ー} お よぴ プロ^ー ブ用オ リ ゴ ヌ ク^レオ チ ド の合 成

P C R プ ラ イ^{マ ー} とプ^{ロ ー} ブ用オ リ^ゴヌ クレオ チ ド は太田^{2 1)の} 報 告^に準^じ, ヒトβ^{一グロ ビン}遺伝 子1 8 3塩 基 対 を特^{異 的に増 幅} する Huβ^{‑1: 5,T}A G A G C C A T C m G m C A 3^' と Huβ^‑5:5'‑ C T G T C T T G T A A C C T T G 瓜 C^‑3^,, お よ び プ^{ロ ー} ブ用オ リ^{ゴ ヌ} ク レ オ チ ド, Hu/9^‑3:5^,‑G A A G T C T G C C G m C T G C C C^‑3^,, を D N A 合 成装 置P C R メイ ト(Ap plied B io syst_{e m s}, Fo ste r, U S A)

に より 合成^{し た}(表¹)^{. プロ ー} プ D N A 1 3p^{m o}l に対し[γ

3 2p]

j m 5 0_iLCi 仏m e r sha m , G^{r e e n w}hich, U S A), ポ¹) ヌク^レオ チ ドキ ナ ^ー ゼ緩 衝 液[^{5 0m M T ds‑H C l}(pH 7^.6), 1 0mM 塩 化^{マ グ} ネシ ウ^ム, 5皿M ジ チ オ ト レ イ ト^{ー ル}, 0.1m M ^{ス ペ ル}ミ ジンお よ び 0.1mM E D T A (pH 8^.0)], 1 0単 位T 4 キ ナ ^ー ゼ(宝 酒造, 京 都) ^{お よ び}滅 菌 蒸留 水^を加 え全 量2 0〃1 と し, 3 7 ℃ に おい て4 5 分 間 反応さ せ た後^ハイ プ リ ダ イ ゼ ^ー ショ ンに用^いた.

Ⅷ. P C R 反 応お よ び サザンプロ_ッ ト^ハイプリグイ ゼ ^ー ショ

ン法(^{P C R‑サ ザ ンプロッ ト法) に よ る増 幅D N A 断 片の} 検 出

Endo ら^{1 5 )}が報 告^{し た}方法に従^い, 鶏 卵 胎 児 肝お よ び大腿骨

か ら抽 出 調 整し た D N A に対し て^ヒトβ^{‑グロ ビン}遺伝 子^{の P C R} に よ る増 幅 反 応 を 行^{っ た.} 調 製し た鋳 型 D N A l_{〃 g} に対し て P C R 反 応 緩 衝 液[1 0mM T ris^‑H C l(pH 8.3), 5 0m M 塩 化カ リ ウ

ム

, 1.51 nM 塩 化マ グネシ ウ^ム], デ オ キ シ リ ボ^ヌクレオ チ ド混 合 液 (^{d A T P , d G T P, d C T P} お よ び d T T P 各2 0 0_FLM),

D N A ポ¹)メラ^ー ゼ(宝 酒 造)2^.5単 位, 各^々1F⁽M のプ ラ イマ ^ー

を 加 え, 滅 菌 蒸留 水^{に よ り}全 量1 0 0_〃1 に調 整し た^･ 反応に は D N A サ ^{M マル}サ イ ク ラ ^ー (^{Pe rkin‑Elm e r Cetu s}) を 傾 用^し, 熱 変性 を^{9 4 ℃}, 1 分 間, アニ ^ー リングを5 5 ℃, 2 分 間, D N A の

伸 長を7 2 ℃, 1 分 間^{と し}, これ を 1 サ イ ク^ルと し て, 2 8 サ イ ク ル繰り返し た^. 増 幅 彼^の D N A 溶 液に 1 0/¹1 の 3 M 酢 酸^{ナ ト1)} ウム b^{H 5.2}) お よ び 3 0 0

.

"l^の エタノ^ー ルを加 え, 4 ℃, 1 5,0 0 0

rp^m にて2 0分 間遠 心し D N A を沈 殿さ せ た^･ D N A は, 8 0 % エタ ノ ^ー ル 3 0 0_/∠l に て洗 浄し た後, 減 任 乾 燥し, 試 料 溶 解 液 (0^.0 6 % プ^{ロ ム フェ ノー ル}ブル ^ー , 0.0 6 % キ シ^{レ ン}シ アノ ^ー ルお よ び6.7 % グ リ^セロ ^ー ルを含む T E 権 衡液)⁹/^∠1 に溶角草^{し た.} 各 試 料を 0^.5′^∠g/ ^{ml エナ ジ ウムブロ マイ ド を}含む泳 動 緩 衝 液 (4 0

m M Tris, 2 0m M 酢 酸ナ ト リ ウ^ム, 1m M E D T A, pH 7･2) 中,

Tab le l･ O li g^{o nuc}le oti de p^{rlm e rS a n}d p^{r o}befo r P C R ^of hu m a n /9^‑g lob in g^{e n e}

P rim e r

a) Sequ e n c e s(^5l‑31)

A GA G C C A T C T^{A T T}G CT TACA C TGTC TTG T^AA C CT TG ATA C G AAGTC T G C C G T^rA C T G C CC

a) T hep^rim er Huβ^一I is a s e n s ep^{rim e r･} Thep rim e r Huβ^{‑5 is}

a n a ntis e n s ep ri m e r. Huβ^{‑3 w a s u s eda s thepr obetodete ct the}

a mp^li鮎d D N A 蝕^ag^{m e n}t･

■

T hele ngth ofPCR p^{r o}du ctwith Hu

β^{‑1a nd Hu}β^{‑5is18 3 ba s e}p血s^･