打田 愛 学 位 の 種 類

氏 名 ^{うちだ あい}

打田 愛

学 位 の 種 類

博士（医学）

報 告 番 号

甲第

号

学位授与の日付

令和

年

月

日

学位授与の要件

学位規則第

条第

項該当（課程博士）

学 位 論 文 題 目

Calprotectin Play a Role as a DAMP for Development of Tubulointerstitial Injury Accompanied with MPO-ANCA- Associated Glomerulonephritis

（カルプロテクチンの MPO-ANCA 関連糸球体腎炎の尿細管間質障 害における DAMP としての働き）

論 文 審 査 委 員 （主 査） 福岡大学 教授

田中 正利

（副 査） 福岡大学 教授

廣松 賢治

福岡大学 准教授

上杉 憲子

内 容 の 要 旨

【目的】

増殖性糸球体腎炎では、半月体形成により糸球体毛細血管からボウマン腔への炎症性 蛋白や障害細胞由来タンパクあるいは分子が漏出することで、尿細管の上皮の障害が進 展し、尿細管間質障害の増悪を助長すると考えられている。好中球細胞質抗体(ANCA)関 連糸球体腎炎(ANCAGN)は、代表的な半月体形成性糸球体腎炎ではあるが、その尿細管間 質障害は、他の半月体形成性糸球体腎炎に比して障害の程度が強く、その重症度は糸球 体障害のそれより高度に障害されることが知られており、このことが腎の予後の悪化に 繋がっていることが指摘されている。この事実は、ANCAGN には疾患特異的な尿細管間質 障害機序が存在することを示唆していると考えられる。ANCA により活性化された好中球 は、neutrophil extracellular trap (NETs)により、多くのタンパクや分子を放出し、

それらは DAMP(damage-associated molecular patterns)として機能している。これらの

DAMP がマクロファージや樹状細胞の細胞質に存在する Nod-like receptor family pyrin

domain–containing-3 ( NLRP3 ) inflammasome の構成を促し、その結果 IL-1βを産生そ

して分泌する自然免疫を作動させると考えられているからである。本研究では、ANCA に

よる好中球活性化で自然免疫が作動することが、尿細管間質障害が進展する大きな要因

であること明らかにするとともに、DAMP のひとつである好中球由来カルプロテクチンが

実際に inflammasome を活性化していることを明らかにすることを目的としている。

【対象と方法】

2015 年 1 月から 2018 年 12 月の福岡大学医学部腎臓・膠原病内科学教室で入院、精 査、治療を行った 35 例の MPO-ANCA 陽性患者であり、半月体形成性糸球体腎炎を呈した 症例（ANCAGN）と 25 例の半月体形成を呈した IgA 腎症症例（IgA nephropathy ; IgAN）

の腎生検標本を対象として解析を行った。さらに糸球体障害と尿細管間質性腎障害を免 疫組織学的にも評価した。それぞれの糸球体障害は、細胞性半月体形成性糸球体数を全 糸球体数で割った細胞性半月形成率（cCFR）によって評価した。尿細管間質障害は尿細 管間質で重複しない強拡大下の 5 箇所での浸潤細胞数の平均値（cTII）で評価した。腎 生検標本のカルプロテクチンの発現は、免疫組織学的に評価した。カルプロテクチン陽 性細胞を有する糸球体の 5 つを平均し、糸球体カルプロテクチン陽性スコア(GCP)とし た。尿細管間質では、重複しない強拡大視野の 5 箇所を平均し、尿細管間質カルプロテ クチン陽性スコア(TICP)とした。Inflamasome の活性化は腎生検組織から抽出した mRNA を鋳型として RT-PCR を行い、NLRP3 inflammasome 関連分子である Toll-like receptor 4 (TLR4), NLRP3, IL-1βの mRNA 発現量を評価した。

【結果】

ANCAGN では cCFR と cTII 値の有意な相関は認められなかった。一方、IgAN では、cGFR と cTII の値間に有意な相関を認めた。この結果は、ANCAGN では IgAN と異なる機序で尿細 管間質障害が進展することを示している。ANCAGN と IgAN の両群でカルプロテクチンの関 与を評価した。両群の細胞性糸球体半月体の周囲でカルプロテクチンの発現が認められた。

尿細管間質の小血管周囲には著明な数のカルプロテクチン陽性細胞が認められた。ANCAGN の TICP は、cTII の値と相関していた。cTII は TLR4、NLRP3、IL-1βと有意に相関してい た。しかし、TICP は TLR4 とは相関を見せたが、cTII と相関を認めた NLRP3、IL-1βとは 有意な相関が認められなかった。カルプロテクチンは DAMP のひとつとして機能している が、カルプロテクチン以外の多くの分子が DAMP として働いていることがこの結果の意味 するところだと示唆された。免疫組織化学的解析では、カルプロテクチンは、受容体であ る TLR4 や NRLP3 タンパク質とともに重症の炎症浸潤領域で陽性に染色されたが、共通し て染色が認められない場所も多かった。

【結論】

ANCA で活性化された好中球、また活性化されたマクロファージによって産生されるカ ルプロテクチンは、尿細管間質で樹状細胞やマクロファージに対して NLRP3

inflammasome を活性化する DAMP として働いていることが示唆された。この反応は尿細 管間質障害の発生と重症化に関与している。自然免疫の結果産生される NLRP3

inflammasome を抑制、あるいはは IL-1βの制御は尿細管間質障害の進行を抑制する可能

性があり、ANCAGN による慢性腎臓病の予後を改善することが期待される。

審査の結果の要旨

本論文は、好中球細胞質抗体(ANCA)によって引き起こされる半月体形成性糸球体腎炎の 尿細管間質障害の特異的な機序を考察した研究内容が記されている。申請者は腎生検組織 からの抽出 mRNA を用いて、ANCA により活性化した好中球から neutrophil extracellular traps(NETs)として放出される damage associated molecular patterns (DAMPs)と呼ばれ る細胞内タンパク、あるいは分子が、インフラマゾームを介して炎症性サイトカイン(IL- 1β)による組織障害を助長させる機序を示した。さらに申請者は DAMPs のひとつであるカ ルプロテクチンに着目し、生検組織の免疫学的多重染色を行っている。その結果、尿細管 間質障害部位や血管周囲では、好中球から放出されるさまざまな DAMPs がインフラマゾー ムを活性化していることが明らかにされた。

この研究の特記すべき点は、腎生検組織を対象に、ANCA 関連腎炎で従来考えられている 好中球独自の障害機序に加え、好中球が放出する DAMPs による二次的な自然免疫機序に基 づく組織障害が存在することを示した点である。

1. 斬新さ

近年着目されている病原体に起因しない炎症反応である自然免疫現象を、実際の腎生検 組織を用いて示した点は斬新である。

2. 重要性

感染症において、活性化した好中球が生体防御に寄与すると考えられる現象 NETosis が、

二次的には自然免疫を賦活化して、組織障害を惹起することを示した点は重要である。

3. 研究方法の正確性

腎生検組織から抽出した mRNA を用いた定量 RNA 測定に加え、特異的モノクロナル抗体 を用いた免疫染色でタンパクレベルでのカルプロテクチン、インフラマゾームの分布の実 際を解析している。カルプロテクチン産生細胞の同定に関しては曖昧であり、今後は細胞 の同定とともに細胞内に存在するのか、細胞外に放出されているのかの判別を行うことが 望まれた。

4. 表現の明確さ

研究分野に特徴的な専門用語が多く用いられ、曖昧な表現で定義された部分がある。内 容の把握が難しい状況で目的、方法、結果の詳細は表現されている。結果に基づいた考察 については、過去の論文を十分検討し、今回の報告の位置づけを示すとともに、実施した 解析の不十分な点を明確に示している。

5. 主な質疑応答

Q1：ANCA 関連疾患の発症に関して遺伝的要因や環境要因について教えてください。

A1：ANCA 関連疾患は、HLA-DR との関連が指摘されています。地域的にも MPO-ANCA と PR3- ANCA の頻度には大きな違いがあり、日本では MPO-ANCA>PR3-ANCA、北欧では MPO- ANCA<PR3-ANCA です。人種間の遺伝的な差異によるものと考えられています。環境要 因としては、衛生状態や外気汚染との関連が指摘されており、昨今では阪神淡路大震 災や東日本大震災地域での多数の発症が報告されています。

Q2：DAMPs について、説明して下さい。

A2：病原体由来の物質(PAMP)と宿主由来の物質(Alarmin)を併せて DAMPs と呼びます。樹 状細胞やマクロファージに存在するそれぞれの受容体に作用して、炎症性サイトカイ ン放出を促します。

Q3：ANCA 関連腎炎の患者の治療に関して、教えて下さい。

A3：細胞体半月体が認められる患者さまには、ステロイド治療の適応となります。線維性 半月体ばかりの場合には、ステロイド治療が奏功する可能性が低く、高い確率で腎代 替療法が必要となります。

Q4：カルプロテクチンを産生する細胞は、何と考えていますか？

A4：活性化マクロファージと好中球が産生すると考えられています。

Q5：カルプロテクチンが染まっている部分は、産生細胞を見ているのか？それとも NETs の 結果を見ているのですか？

A5：この染色では、区別することは難しいと思われます。DNA をうまく染めることができ れば、NETs の存在を示唆することができると思われます。

Q6：なぜ ANCA が存在すると腎臓にこのような障害が出てきてしまうのでしょうか？

A6：活性化好中球による障害標的は、毛細血管内皮です。毛細血管の発達した、腎臓、肺 の障害が多く認められますが、時には神経系の障害も来します。

Q7：IgA 腎症でもカルプロテクチンが発現しているのは、IgA 腎症でも活性化好中球が関 与しているということなのでしょうか？IgA 腎症でもこの自然免疫が働いているとい うことでしょうか？

A7：細胞性半月体に浸潤している活性化したマクロファージが産生していると考えられま す。半月体が形成されると、障害細胞や壊死物質が DAMPs として自然免疫を賦活化し ている可能性は大きいと考えています。

Q8：カルプロテクチンがよく染まった症例の腎予後はより悪いという傾向があったのでし ょうか？

A8：今回の検討では、数が多くないので、腎予後との関連は不明です。間質障害とは相関 していますので、悪化の傾向があると考えてよいかもしれません。

Q9：DAMPs の説明が少なすぎるので、内容の理解が難しかったです。ANCA 関連腎炎の尿細

管間質における血管炎の関与にもっと焦点を当てて考察すべきではないですか？

A9：尿細管間質の血管炎に関しても、やはり同様に二次的に DAMPs が産生され、自然免疫 が賦活化されているものと考えています。この内容を記載するべきでした。

以上のように、数多くの質問と要望があった。申請者は、質問に対しほとんどの部分は 対応していたが、対応できない部分に関しては、指摘の内容を真摯に受け止め今後の課題 としていた。

本論文は、記載にもあるとおり、検討症例数の少なさや、対照疾患の選別など種々の study limitation があり、明確に結果を示せていない部分が見られた。しかし、今後も探 索的研究として、症例数を追加するとともに、他疾患での同様の解析結果を加えることで、

新しい問題提議に結びつく、独創性と発展性を有するものと思われ、学位論文に値すると

評価された。