博士（農学）近江戸伸子 学位論文題名
Rice chromosomes studies by fluorescence in sitLL hybridization with special reference to physical mapping and chromosome structure
（螢光所situハイブリダイゼ―ション法を用いたイネ染色体物理的地図作製 な らびに染色 体構造の解 析に関する 研究）
学位論文内容の要旨
本研究で は、イネ染色体において、遺伝子およぴDNA配列を直接染色体上ヘ位 置づけ、 可視的にそ れらを検出 する螢光in situハイブリダイゼーション（FIS H）法の開発を行なうとともにその手法を用いてイネ染色体の構造解析を行った。
ま ず17S‑5．8S‑25Sリボ ゾ ー ムRNA遺 伝子(45SrDNA）を用い て、イネの 染色体 上にその 遺伝子を位 置づけをし て、充分に 再現性のあるFISH法とした。ここで は(1)非特異的ノイズの除去の為の細胞壁分解酵素処理、夕ンバク質分解酵素処理、
酢酸による洗浄、RNA分解酵素処理を組み合わせた「後処理法」の導入、(2)独自 に改良したサーマルサイクラーによる厳密な温度条件の管理、(3)画像解析法による 遺伝子からの螢光シグナルの明確化の3点に絞って改良を試みた。その結果、イネ に おい て 初め てFISH法 に よ り45SrDNA遺 伝 子を 明 瞭に 同 定す る こと に成功し た。
次 に この 改 良FISH法 を 用い て 、イ ネ 属の8種の 近 縁野 生 種 につ いて45SrDN Aの 遺伝子座を 調ペ、種に より45SrDNA遺伝 子数に変異を認めた。すなわち、日 本 や中国に 分布する日 本型イネ品 種ではrDNA遺伝子 座は1対で、熱帯 ，亜熱帯 に分布す るインド型 品種あるいはジャワ型品種では2対の遺伝子座が存在してい た。また野生稲のOryza punctaとa（Bゲノム）およぴ〇．off icinal is（Cゲノム）
で は 、45SrDNAに つ い て第3の 遺伝 子 座を 検 出し た 。こ の 発見 に は改 良FISH
法による貢献が大きかった。また栽培種の起源とされている野生種の〇． rufipogon で は、栽培種 内にある1および2対の45SrDNA遺伝子座が すでに存在 していたの で、〇． rufipogon内で45SrDNA遺伝子座に分化を生じ、栽培イネに伝ったと考え ら れ る 。 こ の 事 実 は 栽 培 種 の 起 源 を 考 え る 上 で 重 要 で あ る 。 さら に45SrDNA遺伝子座を有する染色体は螢光シグナルの強度の順により染色 体9および11にあること がインド型 の第1次トリソミックシリーズによる分析か ら判明した。また2種の野生稲にみられた最も微弱な螢光シグナルを発する第3の 遺 伝 子 座 も 、 染 色 体 の形 態 から 染 色体10の 長 腕の 介 在 部に 位 置し て いた 。 次に イネの反復配列（Tr sA）を染色体上ヘ位置づけることを試みた。サザン ハ イブリダイ ゼーション の結果、Tr sAはAゲノムに高頻度で存在する配列であ る こ と が 示 さ れ た 。 Tr sAは 3種 の 遺 伝 子 座 （ trsAl、 trsA2、 trs A3） に 含 ま れ 、 ゛ そのDNA構 成 にはTr sAお よ び その 上 流域 のAT含 量の 多 い 特 定の領域とGC含 量が多い特 定の領域と が存在し、GC領域にはヒトの染色体で 認められるミニサテライト様配列が存在し、染色体の末端配列に接続していたこと から、このTr sA配列1ま染色体の次端部に存在する。また〇．saとfya内の2系統 およびO． glaberrimaにおいてこの3種の遺伝子座中のTr sAの存在様式が異なっ て い た 。PCR法 を 用 い て 日 本 晴 、IR36、 〇 ．glaberrimaに つ い てtrsAlお よ びt・r sA3の遺 伝 子座 に おけ るTrsAの有 無 を調 ぺ たと こ ろ、3系 統のすべ て でtrsAl遺 伝 子座 に おい てTr sA&ま存 在していた が、〇．glaberrimaではt r sA3遺伝子座においてTr sAを欠失していた。
改良FISH法 によ りTr sAを 染 色体 上 に位 置 づけ た とこ ろ 、複数の 染色体の 長 腕部の末端部（テロメア）に座乗していることが判明した。Tr sAはコシヒカ り で は 染 色 倦 6お よ ぴ 12に 、 IR36で は 染 色 体 5、 7、 8、 9、 10、 11 に 、〇． glaberrimaで は染色体5、6、7に存 在した。興 味深いこと にTr sAは す ぺ て、 染 色体 の 長腕 の テロ メ ア 近傍 に あっ た 。DNA塩 基 配列およ びFISH法 に よる解析結果より、Tr sAは転移因子としての機能を有し、染色体の様々な位 置に挿入や欠失を起こしており、染色体上ではサプテロメア領域に局在していた。
西アフリカの栽培稲であるD． glaberrimaについてアジァの栽培種、〇．sativa ー176―
との染色体構造の違いを詳細に比較するため、体細胞分裂前中期の染色体に特徴的 に 現れる凝縮 型に基づく 核型分析お よぴFISH法による解析を行った。ギムザ染 色により、個々の染色体に現れる凝縮型に基づぃて識別・同定と、画像解析法によ って染色体の相対長および腕比を測定した。その結果、〇． glaberrimaの染色体は
〇． sativaとほぼ同一であったが、いくつかの染色体については若干の形態的な相 違点を認めた。
D． glaberrima染色体上における遺伝子構成を調ぺるために、〇． glaberrimaの細 胞 核 より 直 接ク ロ ーニ ン グ およ び 直接 標 識法 に よっ て45SrDNAおよ び5SrDNA をそれぞれ別の非放射性物質（ビオチン、ディゴキシゲニン）で標識し、それらを プ ロ ー プ と し て マル チ カラ ーFISH (McFISH） 法 を 行っ た 。そ の 結果 、 〇．
glaberr imaの染色体上での45SrDNA遺伝子座は染色体9の短腕の付随体部に、5S rDNA遺 伝 子 座 は染 色 体11の短 腕 の動 原 体 近傍 で それ ぞ れ検 出 した 。 すな わ ち、これら2種のrDNA遺伝子の染色体上の位置は、〇．saf ivaの場合と同一であ った。従って、〇． sativaと〇．glaberrimaはほぼ同様の染色体を有し、かつ2種類 のりボゾーム遺伝子の位置関係も同一で、両種は同様な染色体編成を有することが 判った。
本 研究では、FISH法 により遺伝 子およぴ反復配列をイネ染色体上に位置づけ る と 共に 、 さら に 技術 的 に 改良 し たMcFISH法に よ り、2種類の遺伝 子座の同 時 検出を行な うことに成 功した。ま たそれらの新手法によりrDNA遺伝子座をイ ネ染色体地図上に位置づけた。このように、イネ染色体の構造を染色体・遺伝子レ ベルで解析することは、イネ属植物の種分化、種内および種聞変異の解析に新知見 を加えた。
FISH法を 用いたイネ ゲノム研究 の今後の方向として、従来の核型分析の改良 に加えて生化学的遺伝子の位置づけによる新しい分子細胞遺伝学の展開が考えられ る。また、本研究によルイネ染色体物理地図作製の端緒が開かれ、さらに総合的な ゲノム解析によルイネの遺伝育種学の発展に応用できる。
学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
Rice chromosomes studies by fluorescence in sitrL hybridization with special reference to physical mapping and chromosome structure
（螢 光in s′fUハイ ブリ ダイ ゼー ショ ン法 を用 いた イネ 染色 体物理 的地図作製 ならび に染 色体 構造 の解 析に 関す る研 究）
イ ネ の 染 色 体 上 ヘ 直接 に遺 伝子 およ びDNA配列 を位 置づ け、 可視 的に それ らを 検 出 す る 螢 光fn siとuハイ ブリ ダイ ゼー ショ ン（FI SH）法 の開 発を 行な った 。更 に そ の 手 法 を 用 い て イ ネ 染 色 体 の 構 造 解 析 を 試み た 。
本 論 文 は6章 より 成 り 、76頁 で 表4と 図18を含 む 。
ま ず り ボ ゾ ー ム RNA遺 伝 子 (45SrDNA） を 用 い て 、FISH法 に 対 し て 、 (1) 非 特異 的ノ イズ の除 去の為の細胞壁分解酵素処理、タンバク質分解酵素処理、酢酸に よ る 洗 浄 、RNA分 解酵 素 処 理 を 組 み 合 わ せ た 「 後 処 理 法 」の 導入 、(2)独自 に改 良 し たサ ーマ ルサ イク ラー によ る厳 密な温 度条 件の 管理、(3)画像解析法による遺伝子 か らの 螢光 シグ ナル の明 確化 の3点 につ いて の改 良を加えた。その結果、イネにおい て 初 め て 45SrDNA遺 伝 子 の 明 瞭 で か つ 再 現 性 の あ る 同 定 に 成 功 し た 。 次 に こ の 改 良FI SH法 を 用 い て 、 イ ネ 属8種 の 近 縁 種 に つ い て45SrDNAの 遺 伝 子座 に関 する 種間 変異を調べ、日本や中国に分布する日本型イネ品種では遺伝子座 が1対 である のに 対し て、 熱帯 ，亜 熱帯 に分 布す るインド型品種あるいはジャワ型品 種 では2対の 遺伝 子座 が存 在す るこ と、 また 野生 種のOryza puロctataお よびOr yza of icinalisでは 、い ずれ も新 たに 第3の 遺伝 子座 を検 出し た。 また 、栽 培イ ネの祖 先 種 で あ る 〇 ． rufipogonで は す で に1お よ び2対 の45SrDNA遺 伝 子 座 が 分 化 し て い る こ と を 見 出 し た 。 第1次 トリ ソ ミ ッ ク シ リ ー ズ を 用 い たFISH法 に よ り 、 こ の 第3の 遺 伝 子 座 は 、 染 色 体10の 長 腕 介 在 部 に 位 置 す る こ と を 明 ら か に し た 。 イ ネ の 反 復 配 列 （Tr sA） はAゲ ノ ム 種 中 に 高 頻 度 で 存 在し て い て 、3種 の 遺 伝
郎 也夫 俊 義哲 下本 上 木島 三 授授 授 教教 教 査査 査 主副 副
子 座 （ trsAl、 trsA2、 trsA3） か ら 成 る 。 PCR法 を 用 い て 栽 培 イ ネ の2系 統 お よ び 〇 ． glaberrimaに お い てTr sAの 有 無 を 調 べ た と ころ 、3系統 のす ぺ て でtrsAl遺 伝 子 座 に お い てTr sAが 存 在 し て い た が 、 〇 ，glaberrimaで は trsA3遺伝子座においてTr sAを欠失していた。
改 良FISH法 に よ り 染 色 体 上 ヘTr sAを 位 置 づ け た と こ ろ 、 複 数 の 染 色 体 の 長 腕 部 の 末 端 部 （ テ ロ メ ア ） に 座 乗 し てい た。Tr sAは品 種「 コシ ヒカ リ」 では 染色 体 6お よ ぴ 12に 、 「 IR36」 で は 染 色 体 5、7、 8、 9、 10、 11に 、 〇 ． glaberr imaで は 染 色 体5、6、7に あ っ た 。 し た が っ て 、Tr sAは 転 移 因 子 と し て の機 能を 有し 、染 色体 の様 々な位置に挿入や欠失を起こしており、染色体上ではサ ブテロメア領域に局在していた。
西アフリカの栽培イネである〇． glaberrimaの染色体構造について、ギムザ染色に よ る画 像解 析法 によ って 詳細 な核型分析を行ったところ、各染色体の凝縮型、相対長 およぴ腕比等の特徴は〇． saと｜yaの場合とほぼ同一であったが、いくつかの染色体に ついて若干の相違がみられた。
0． glaberrimaの 細 胞 核 よ り45SrDNAお よ び5SrDNAを 直 接 ク ロ ー ニ ン グ し て 、そ れぞ れ別 の非 放射 性物 質（ビオチン、ディゴキシゲニン）により標識し、それ ら を プ ロ ー ブ に 用 い て マ ル チ カ ラ ーFISH (McFI SH） 法 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 〇 ． glaberrimaの 染 色 体 の1つ の 画 像 で45SrDNA遺 伝 子 座 が 染色 体9の短 腕付 随 体 部 に 、5SrDNA遺 伝 子 座 は 染 色 体11の 短 腕 動 原 体 の 近 傍 に 存 在 す る こ と を 検 出できた。
本研 究 で は 、FISH法 の 改 良 に よ り 遺 伝 子 お よ び 反 復 配列 を染 色体 上に 位置 づけ る と 共 に 、 さ ら にMcFISH法 に よ り 、2種 類 の 遺 伝 子 座 の 同 時 検 出 に も 成 功 し た。 このよ うに 、イ ネゲノムの染色体構造を遺伝子レベルで解析して種分化や種内お よび 種間変 異に 関す る新知見を加えたことにより、イネ遺伝育種学ヘ大きな貢献をし た。
よ って審 査員 一同 は別 に行 った 学力 確認 試験 の結 果と 合わ せて、 本論 文の 提出者 近江 戸伸子 は博 士（ 農学 ）の 学位 を受 ける のに 十分 な資 格が あるも のと 認定 した。
