博 士 （ 獣 医 学 ） 迫 田 義 博
学 位 論 文 題 名
Development of Novel Diagnostic Methods of Classical Swine Fever
（豚コレラの新しい診断法の開発）
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
豚 コ レラ ウ イル ス(CSFV)は フラ ビウイル ス科、ベ スチウイ ルス属の 十鎖RNA ウ イ ル ス で あ る 。CSFVは 同 属 の 牛 ウ イ ル ス 性 下痢 ウ イ ルス(BVDV)と 共 通 抗 原性 を 有す る の で、 試 験 に用 い る細 胞 の 培養 液 に添 加 す る牛 血清は抗BVDV抗 体陰性で なければ ならない。しかし、牛ウイルス性下痢病は世界中に蔓延してい る た め 、 抗BVDV抗 体 陰 性 血 清 の 入 手 は き わ め て難 し い 。ま た 、BVDV持 続 感 染牛 か ら採 取 さ れた 血 清 には 感 染性BVDVを 含 むこ と が多 い ので、 診断やワ ク チン製造 のための 細胞の培養に用いることはできない。また、このような血清に は加 熱 非働 化 し て感 染 性 ウイ ル スを 不 活 化し て も、BVDV RNA断片は残 存する ので、誤 った遺伝 子検出成績 を得るお それがあ る。
ほ と ん ど のCSFV株は 、 培養 細 胞 に対 し て明 ら か な細 胞 変性 効 果(CPE)を 示 さな い 。そ の た め、 ウ イ ルス と抗 体の検出 には酵素 抗体法、 螢光抗体 法、END
［ ニ ュ ー キ ャ ッ ス ル 病 ウ イ ル ス(NDV)のCPEを 増 強 させ る ］法 お よ び干 渉 法 などが 用いられ ていた。酵 素抗体法 と螢光抗 体法は抗CSFV特異抗体 を用いて ウ イル ス 抗原 を 検 出す る も ので 、煩 雑な作業 を要する 。また、END法および 干渉 法 は 強 毒 のCSFVやNDV、 お よ び海 外 悪 性伝 染 病で あ る 水胞 性 口炎 ウ イ ルス や 西部馬脳 炎ウイル スなどをそれぞれ使用するので、ウイルス拡散を防止すること ができる 施設にお いて実施し なければ ならない 。
本研究は まず、無 血清培地で増殖可能な豚腎臓由来株化細胞を樹立した。次に こ れ を 用 い て 安 全 、 簡 便 か つ 信 頼 性 の 高 い 豚 コ レ ラ 診 断 法 を 確 立 し た 。 1． 無血清培 地で増殖可 能な細胞 株の樹立 とその性状解析
豚 腎 上 皮由 来 の株 化SK−L細 胞 およ びCPK細胞 を 培養 液 中 の血清濃 度を徐々 に 減少 さ せて 継 代 した 。 継 代を 約50代繰り 返した結 果、最終 的にイー グルMEM に0.5％Bacto Peptone、0.295% TI．yptosePhosphateBroth、10mMN，N―Bis（2− hydroxyethyl）―2−aIT曲oethanesulfonicaCidのみを加えた無血清培養液で増殖可能な 細胞 株、FS―L3細 胞およびCPK―NS細胞を樹 立した。FSーL3細胞は 継代3日目 か ら単層 形成後に 本細胞特有なドームを形成し、この数は培養時間とともに増加し
た。さらにこのドームは、長期間培養すると球状の形態をとって培養液中に浮遊 し、増殖した。これらの両細胞にはぺスチウイルス属のすべてのウイルスの迷入 がないことを確認した。さらにFS −L3 細胞には、豚サイトメガロウイルス、豚レ ト口ウイルス、豚サーコウイルス、マイコプラズマが存在しないことも確認した。
2
．新しい豚コレラウイルスの感染価と中和抗体価の定量法の確立
FS
ーL3 細胞に
CSFVワクチン株
(GPE一株）を感染させたところ、ウイルス接種
3日後 よりCPE を 認め、ウイルスの増殖に伴って
FSーL3 細胞に特有な球状のド ームが消失 した。CPK ―
NS細胞もまた、
GPE‑株の感染によって明瞭な
CPEを示 した。両細 胞は
END現 象を示さな い
(END―）すべ てのCSFV 株の感染により明 瞭 な
CPEを 示 し 、
END現 象 を 示 す
(END十）
CSFV株 の感 染 では
CPEを 示 さな かった。この
END―株の感染によるCPE は、アポトーシス誘導の結果と想定され た。
FS
−L3 細胞にお けるドームの消失とCPK −
NS細胞における明瞭なCPE をウイ ルス感染のマーカーとして、END‑ CSFV 株の感染価定量法を確立した。また、
このウイルス感染マーカーと豚コレラウイルス株間の干渉現象を利用して、単独 では
CPEを 示さない
END十
CSFV株の感 染価の定量 法を確立した。さらに、GPE 一株をマーカーウイルスとして用いた中和抗体価測定法を確立した。これらの方 法で求めたウイルス感染価と中和抗体価は、従来法による値と高い相関を示した。
3
．豚コレラウイルスと反芻動物のぺスチウイルスの遺伝子解析による分類
RT
−PCR 法により、豚ならびに反芻動物由来のべスチウイルスの5 非翻訳領域
のウイルス遺伝子を増幅し、PCR 産物を検出した。さらにこれらのウイルス遺伝
子核酸の塩基配列を決定し、分子系統樹解析を行った。豚由来ペスチウイルス4
2株はすべて
CSFVグループに分類され、大半は2 つのサブグループ(CSFV −1 と
CSFV―
2）に区分された。日本の分離株を含む4 株は塩基配列が他の
CSFV株とは
大 き く 異 な り 、 新 し い サ ブ グ ル ー プ
(CSFV−
3） に 区 分 さ れ た 。
反 芻動物由来 ベスチウイ ルス
31株はその大半がBVDV 遺伝子型I(BVDV −I ）
に分類され、さらに2 つのサブグループ
(BVDV―Ia と
BVDV−Ib) に分かれた。そ
れ以外の反芻動物由来
3株はB VDV 遺伝子型II (BVDV‑10[) として分かれた。ま
た 、制限酵素 を用いた
PCR産物の切 断片長解析から
CSFV、BVDV 一I 、
BVDV‑IIの 遺 伝 子 グ ル ー プ を 容 易 に 区 別 す る こ と が 可 能 と な っ た 。
学位論文審査の要旨 主査
副査 副査 副査
教授 教授 教授 助教授
喜 田 宏 小 沼 操 高 島 郁 夫 岡 崎 克 則
学位論文題名
Development of Novel Diagnostic Methods of Classical Swine Fever
（ 豚 コ レ ラの 新し い診 断法 の開 発）
豚 コ レ ラ ウ イ ル ス(CSFV） は 牛 ウ イ ル ス 性 下 痢 ウ イ ル ス(BV DV)と 共 通 抗 原 を 有 す る の で 、 試 験 に 用 い る 細 胞 の 培 養 液 に 添 加 す る 牛 血 清 は 抗BVDV抗 体 陰 性 で な け れ ば な ら な い 。 し か し 、 抗BVDV抗 体 陰 性 血 清 の 入 手 は き わ め て 難 し く 、 ま た 、 BVDV持 続 感 染 牛 か ら 採 取 さ れ た 血 清 に は 感 染 性BVDVま た は そ のRNA断 片 を 含 む の で 、 診 断 や ワ ク チ ン 製 造 の た め の 細 胞 の 培 養 に 用 い る こ と は で き な い 。 CSFVと 抗 体 の 検 出 に は 酵 素 抗 体 法 、 螢 光 抗 体 法 、END法 お よ び 干 渉 法 な ど が 用 い ら れ て い た 。 酵 素 抗 体 法 と 螢 光 抗 体 法 は 抗CSFV特 異 抗 体 を 用 い て ウ イ ル ス 抗 原 を 検 出 す る も の で 、 煩 雑 で あ り 、END法 お よ び 干 渉 法 は 強 毒 のCSFVや ニ ュ ー キ ヤ ッ ス ル 病 ウ イ ル ス(NDV)、 お よ び 水 胞 性 口 炎 ウ イ ル ス や 西 部 馬 脳 炎 ウ イ ル ス な ど を そ れ ぞ れ 使 用 す る の で 、 ウ イ ル ス 拡 散 を 防 止 す る こ と が で き る 施 設 に お い て 実 施 し な け れ ば な ら な い 。
本 研 究 は 、 無 血 清 培 地 で 増 殖 可 能 な 豚 腎 臓 由 来 株 化 細 胞 を 樹 立 し 、 こ れ ら を 用 い て 安 全 、 簡 便 か つ 信 頼 性 の 高 い 豚 コ レ ラ 診 断 法 を 確 立 し た も の で あ る 。 ま ず 、 豚 腎 上 皮 由 来 の 株 化SK―L細 胞 お よ びCPK細 胞 を 培 養 液 中 の 血 清 濃 度 を 徐 々 に 減 少 さ せ て 継 代 を 繰 り 返 し 、 無 血 清 培 養 液 で 増 殖 可 能 な 細 胞 株 、FS―L3細 胞 お よ びCPK‑NS細 胞 を 樹 立 し た 。 次 に 、 FSーL3お よ びCPK―NS細 胞 を 用 い て CSFV株 の 感 染 価 と 中 和 抗 体 価 の 定 量 法 を 確 立 し た 。 こ れ ら の 細 胞 を 用 い て 得 た 成 績 は 従 来 法 に よ る 値 と 高 い 相 関 を 示 す こ と を 確 か め た 。
さ ら に 、RT‑PCR法 に よ り 、 豚 な ら び に 反 芻 動 物 由 来 の べ ス チ ウ イ ル ス の5 非 翻 訳 領 域 の ウ イ ル ス 遺 伝 子 を 増 幅 し 、PCR産 物 を 検 出 し た 。 こ れ ら の ウ イ ル ス 遺 伝 子 核 酸 の 塩 基 配 列 を 決 定 し 、 分 子 系 統 解 析 を 行 っ た 結 果 、 豚 由 来 ベ ス チ ウ イ ル ス42 株 は す べ てCSFVグ ル ー プ に 分 類 さ れ た 。 日 本 の 分 離 株 を 含 む4株 は 塩 基 配 列 が 他 のCSFV株 と は 大 き く 異 な り 、 新 し い サ ブ グ ル ー プ(CSFV―3） に 区 分 さ れ た 。 ま た 、PCR産 物 の 制 限 酵 素 に よ る 切 断 片 解 析 に よ っ て 、CSFVと 反 芻 動 物 由 来 ペ ス チ ウ イ ル ス を 遺 伝 子 グ ル ー プ に 区 別 す る こ と が 可 能 と な っ た 。
