β‐ガラクトシダーゼ欠損症の遺伝子解析　：　人種による違いと共通点

原

著

〔書女医擁、篶63巻平騨翻骨〕

β一ガラクトシダーゼ欠損症の遺伝子解析

一人種による違いと共通点一

1）（財）東京都臨床医学総合研究所 臨床遺伝学研究部門

2）都立駒込病院 小児科

3凍京女子医科大学 小児科学教室（主任：福山幸夫教授）

 イシイ      スズキ  ヨシユキ   フクヤマ  ユキオ

石井のぞみn∼3）・鈴木 義之1）・福山 幸夫3）

（受付 平成5年6月22日）

Phenotype・Genotype Correlation ill Hereditary．β・Galactosidase Deficiency：

         ACompadson Among Different Ethnic Groups

  Nozomi ISHII1ト3｝Yosh董yuki SUZUKI1）and Yukio FUKUYAMA3｝

1｝Department of Cllnical Genetics， The Tokyo Metropolitan Institute of Medicai Science      21Depart血ent of Pediatrics， Tokyo Metropolitan Komagome Hospital．       3）Department of Pediatr三cs（Director：Prof． Yukio FUKUYAMA）       Tokyo Women’s Medical College   Agenetic deficiency of Iysosomalβ一galactosidase in humans causes four malor clinical syndromes identifiable on the basis of age of onset and distribution of pathological lesions：three clinical forms of GMrganglios童dosis（infantile， juvenile and adult）with central nervous system lesions， and Morquio B disease with skeletal lesions。 In Japanese patients， gene mutations are heterogeneous in infantile GMrgangliosidos童s， and it is difficult to detect residua1β一galactosidase activity． On the other hand， common mutations have been found in otherβ一galactosidase defic童encies：201Arg−Cys for juvenile GM1・gangliosidosis，5111e−Thr for adult， and 273Trp−L，eu for Morquio B disease． The residual enzyme activity in each of these clinically mild forms is higher than that in early onset GM1・gangliosidosis． In this study， we analyzed mutant DNAs from Caucasian patients withβ・galactosidase deficiency． Some of the Caucasian subjects did not have the mutations common in Japanese patients with the same phenotypes．   It is therefore suggested that the genetic background ofβ・galactosidase deficiency in Caucasians is different from that of Japanese。        緒  言

 β一ガラクトシダーゼ欠損により引き起こされる

疾患の中で，酵素遺伝子の異常を原因とするもの

には，GM1ガングリオシドーシスとモルキオB病

が存在する1》．GM1ガンリオシドーシスは，さらに

発病時期によって乳児型・幼児型・成人型の3型

に分けられ，各々異なる臨床像を示す（表1）1）．

乳児型は，乳児期より高度の精神運動発達遅滞・

Cherry−red spot・肝脾腫などを呈し，頻回のけい

れん・除脳硬直にいたり通常3歳以前に死亡する．

GMIガンダリオシドの蓄積は，脳組織全体に見ら

れる．幼児型は，乳児型に比べ発病が遅く進行も

それほど早くないが，最：終的な病像は乳児型に類

似している．これに対して成人型は，一般に青年

期より発病し慢性の経過を示す，神経症状も構

音・歩行障害などの錐体外路症状（ジストニア）

を中心とする．これは，GM、ガソダリオシドが大脳

基底核へ選択的に蓄積するためと考えられてい

表1 GM1ガソグリオシドーシスの臨床分類

乳児型 幼児型 成人型 発症年齢 3∼6ヵ月 7ヵ月∼5歳 4∼30歳 臨床経過

_1∼3歳

3∼8歳

＞10歳 神経症状 知能障害 朴 十 ± 錐体路徴候 朴 升 十 ジストニア 一   升 小脳症状 一 一 一 末梢神経障害 一 一 一 チェリーレッド @スポット 十 ＋／一 一 全身症状 ガルゴイル顔貌 十 ± _一 臓器腫大 十 ± _一 多発性骨変化 十 ± _一 椎骨異形成 一 一 十

       Q

Message

二二

Genotype Phenotype Not de臨b旦e      agkb    27kb（凪。㎜1）

  LP？  D  

CGHIJQFBA

CDGHIJKLPQ

 NOne

D／D I’K  J／L D’？ Rダ？ QIQ  ノ   ノマ

＼↓／

 血fan姐e F 〈5％  ノ   景1号  ＼ B く2％  ノ 

B父

 A ＜1〔尻 A／A A／C  ノマ  ＼ E E 董oc％ ±：境界例，微細変化，症候不明療． ＋／一：＋の例および一の例が存在，症候自体は明瞭．

る．また，モルキオB病はケラタン硫酸の蓄積に

より骨軟骨の異形成をきたし，ムコ多糖症IVBに

分類され，神経症状を示さない．

 同じβ一ガラクトシダーゼ欠損症でありながら，

なぜ異なる発症年齢・臨床症状を呈するのか．日

本人患者を中心とした各臨床型の遺伝子解析の結

果は，以下のようにま「とめられた（図1）2）∼6）．

 1）最も重症な乳児型の原因となる遺伝子変異

は多様であり，血族婚の既往がなければ，遺伝子

型は全くβ一ガラクトシダーゼ残存活性のない変

異の複合ヘテロ接合体である．GM、ガングリオシ

ドーシスのなかで，乳児型が最も多いことから考

えて，日本人にはここに示された以外にも多．数の

変異が蓄積されていて，それらがたまたま出会う

ことで乳児型として表現されると考えられる．

 2）軽症の幼児型・成人型・モルキオ’B病の遺伝

型は，それぞれに特有の変異201Arg→Cys（図1

ではB）。5111e→Thr（A）・273Trp→Leu（F）のホ

モ接合体か，これらと残存活性のない変異とのヘ

テロ接合体である．これらの変異遺伝子は，各々

正常の2∼10％程度の残存活性を有していた．

 しかしデンマークにおいて成人型の変異遺伝子

が，82Thr→Met（R）であったという報告があ

り7），日本人では単一であった遺伝子変異も，人種

が違えば異なる可能性がある．．そこで，我々は世

Morquio B Juven皿e Adult  図1 β一ガラクトシダーゼ遺伝子変異と．表現型

最上段は，ヒトβガラクトシダーゼcDNA上にGM、．

ガングリオシドーシス（▲▼）とモルキオB病（△▽） 患者で同定された変異を示す．5’側の非転写領域につ づく黒のボックスはシグナル配列を示し，白ボックス 内の縦線は潜在的糖側鎖結合部位を示す．以下，各変

異のmRNAのサイズ（message）→酵素活性（enzyme

activity）→遺伝子型（genotype）について，表現型 （phenotype）ごとにまとめた．遺伝子変異ρ）略号A： 5111e→Thr， B：201Arg→Cys， C：457Arg→G茎n， D： duplication＃1103−1267， E：loLeu→Pro， F：273Trp →Leu， G：482Arg→His， H：509Trp→Cys，1：123Thr →Arg， J：316Tyr→Cys， K：菟94Gly→Cys， L：Dupli− cation＃288−310， P：49Arg→Cys， Q：457Arg→Ter， P：変異未確認のもの

界各地より幼児型・成人型・モルキオB病の患者

細胞を集め，その変異遺伝子を解析し比較検討す

ることにした．

         対象と方法

 1．対象

 対象としたβ一ガラクトシダーゼ欠損症の患者

について，表2にまとめた．モルキオ．B病はドイ

ツ・ポーランド・南アフリカ，GM1ガングリオシ

ドーシス成人型は南アフリカ，幼児型は日本，乳

児型として南アフリカから2例を集めた．皮膚線

維芽細胞におけるβ一ガラクトシダーゼ活性は，酵

素液30μ1と30μ1の反応液（1mM 4・

methyl㎜belliferone一β一galactopyranoside，100

mM citrate buffer（pH 4．5），200mM NaCl）を

37℃で60分反応させ，700μ1のglycine buffer（pH

10．7）を加えて反応を停止させた後，蛍光計で活

性を測定した．乳児型と診断されている患者7・

8にはほとんどなく，他の例ではわずかに残存活

性を認めた．患者2では，得られたタンパク量が

表2 対象としたβ・ガラクトシダーゼ欠損症の患者一覧 患者 病  型 地  域 性別 血族婚

幾籍粧

遺伝子変異 2》A

F

R

1 _Morquio B

_Germany

？ ？ _3．6 n．d． _十 n．d． 2 _Morquio B Poland F』． ？ 一 n．d． 一 n．d． 3 _{Morquio B South Africa}

M

（一） 3．4 n．d． 一 n．d． 4 _{GMI chronic South Africa}

M

（一） 3．2 _一 n．d．   5 _{GMI juvenile Japan}

_F

？ _4．0 n，d． n．d． n．d． 6 GMI infantile South Africa

F

（一） 0．9 n．d， n．d． n，d， 7 _{GMI infantile South Africa}

M

（＋） 1．4 n．d． n．d． n。d， 1｝皮膚線維芽細胞におけるβ一ガラクトシダーゼ残存活性（nmol／mg protein／hr） 2｝A：変異5111e→Thr， F：変異273Trp→Leu， R：変異82Thr→Met．

非常に少なく，信頼性のあるデータが得られな

かった．

 2．方法

 今回は，モルキオB病とGMIガングリオシドー

シ．ス成人型を中心に解析することにした．すなわ

ち，モルキオB病では273Trp→Leu（F）， GMIガン

グリオシドーシス成人型では5阻e→Thr（A）およ

び82Thr→Met（R）を含むエクソγについて．

polymerase chain reaction（PCR）を行い，制限

酵素解析を行って変異遺伝子の箇所を調べた1

 1）ゲノムDNAの分離

 正常者および対象とした患者由来のリンパ芽球

または皮膚線維芽細胞をプロテアーゼ処理，フェ

ノール抽出，透析後RNase処理によりDNAを

分離し試料とした8）．

 2）RNAの分離およびcDNAの作製

 GM、ガシグリオシドーシス成人型の変異82Thr

→Met（R）については，患者由来の皮膚線維芽細

胞から総RNAを抽出し， reverse transcriptase

によって1本鎖．RNAからcDNAを作製した．

 3）β・ガラクトシダーゼ遺伝子の増幅

 β・ガラクトシダーゼcDNAの塩基配列9）に基づ

いて作成したプライマーを用いて以下のエクソン

についてPCRを行った．モルキオB病では273

Trp→Leu（F）変異を含むエクソン8（120塩基

対）について，センスプライマー5’一CAA−

TTCTGAATTCTATACAGGG3’・アンチセン

スプライマー5’一AAGTTCACACTCGCCCCA−3’

を用いた．この変異273Trp→Leu（F）については

新たな制限酵素部位を生じさせるために，人為的

にセンスプライマーの塩基配列を847T→Aに変

更している．GM、ガンダリオ’シドニシス成人型の51

11e→Thr（A）を含むエクソン2（170塩基対）につ

いては，センスプライマー5’AA−

TGCCACCCAGAGGATGTTTGAAATTGAG

3’．・アンチセンスプライマー5’・GTCT−

GGATGGCGTTCAG−3’を用いた．また成人型の

もう1つの変異82Thr→Met（R）を含むエクソン

2∼3（201塩基対）については，センスプライマー

5’GGAAGCATTCACTACTCCCGTG−3’・アンチ

センスフ．

_{宴Cマー5’GATAACCA−}

GCAGTCCCAGCTCA・3’を用いた．センスおよび

アンチセンスプライマーを各々1μgと与UのTaq

DNAポリメラーゼおよび適当量の試料DNAま

たはcDNAを用い，全100μ1の反応液（50mM

KCI，10mM Tris・HCI（pH 8．3），1．5mM MgC12，

0．01％（w／v）gelatin，0．1mM d NTP）中で，増

幅反応を変性：94℃，1分間，アニーリング：

62℃，1分間，伸張：72℃，．1分間で30サイクル

行った．

 4）増幅産物の制限酵素解析

 変異遺伝子の箇所によって各々以下の制限酵素

を用いた：273Trp→Leu（F）に8’％1，5111e→Thr

（A）にBs％361，82Thr→Met（R）に福α611（変

異273Trp→Leu（F）については上述の操作によっ

て人為的にS劾1部位を作製した）．上記の制限酵

素でPCRによって得られた増幅産物を処理し，

4％アガロースゲル電気泳動で分離，エチジウム

ブロマイド染色した．

      結  果

 上述の方法で制限酵素処理を行った結果を，図

2∼4に示し，表2にまとめた．モルキオB病につ

いては，患者1（ドイツ）は273Trp→Leu（F）の複

合ヘテロ接合体であるが，患者2（ポーランド）

および患者3（南アフリカ）には273Trp→Leu（F）

は存在しなかった（図2）．同様に，GM、ガングリ

オシドーシス成人型で5111e→Thr（A）および82

Thr→Met（R）について調べると，患者4（南アフ

リカ）にはいずれの変異も存在しなかった（図3・

4）． GMI gangliosidosis chronic type（Mutant A：151T）

   M   4    P   N

Norma1

170bp

←170

’92

、78

Mutant

78bp

92bP

Morquio B（Mutant F：W273L）

M  1

2

3

N

P

Normal

←120

、99

21bp

99bp

      ↑       Bsu 361 （cd「TNAGG） 図3 変異5111e→Thr（GM1ガングリオシドーシス成  人型）を含むβ一ガラクトシダーゼDNAエクソン2

 のPCR増幅産物の制限酵素解析

 170塩基対のPCR増幅産物をβ∫認61で処理し，  4％アが十一スゲル電気泳動で分離，エチジウムブ  ロマイド染色したもの．4：患者4，P：過去にシー  クエンス解析によって変異5111e→Thrが確i認され  ている患者（文献3）の患者7），N：正常コントロー  ル，M：DNAマーカー（φ×174phage／Hae III処  理）．変異5111e→Thrが存在すると，170塩基対の

 PCR増幅産物のなかに＆π361によって認識され

 る部位が生じ，78塩基対と92塩基対のフラグメント

 に切断される．患者4ではPCR増幅産物が全く切

 断されていない． Mutant  ↑   ▼ Stu l （AGG CCT） 図2 変異273Trp→Leu（モルキオB病）を含むβ・ガ

 ラクトシダーゼDNAエクソン8のPCR増幅産物

 の制限酵素解析

 120塩基対のPCR増幅産物をS’π1で処理し，4％

 アガロースゲル電気泳動で分離エチジウムブロマ

 イド染色したもの．1，2，3：患者1，2，3，

 N：正常コントロール，P：過去にシークエンス解

 析によって変異273Trp→Leuが確認されている患

 老（文献5）のcasel），M：DNAマーカー（φx174  phage／Hae III処理）．変異273Trp→Leuが存在す  ると，847T→Aに変えたセンスプライマーを用いる  ことによって，120塩基対のPCR増幅産物のなかに  新たに∫伽1認識部位が生じ，PCR増幅産物は21塩  基対と99塩基対のフラグメントに切断される．患者

 1では一部PCR増幅産物が切断されているが，患

 者2・3では全く切断されていない．

      考  察

 表3にβ一ガラクトシダーゼ欠損症すなわち

GM1ガングリオシドーシスとモルキオB病におけ

る遺伝子変異について，表現型と遺伝子型の関係

をまとめた．

 モルキオB病では，過去に発見された患者はい

ずれも273Trp→Leu（F）の複合ヘテロ接合体で

あった4）．また，そのsecond alleleとして認めら

れる変異（482Arg→His＝G，509Trp→Cys＝H）

は，いずれも酵素の残存活性が全くなく，モルキ

オB病は273Try→Leu（F）と酵素の残存活性が

全くない遺伝子変異との組み合わせによって発症

するのではないかと考えられる．さらに興味深い

点は，482Arg→His（G）という変異は，白人種の

GMI gangliosidosis chronictype（Mutant R：T82M）

M  4  N

Mutant 輌201

←112

炉89

Normal

 ↑ Mae l1（A▼CGτ）

        201bp

図4 変異82Thr→Met（GM1ガングリオシドーシス

 成人型）を含むβ・ガラクトシダーゼcDNAエクソ

 ン2∼3のPCR増幅産物の制限酵素解析

 上段：β一ガラクトシダーゼcDNAを，変異部位82

 Thr→Metを含むエクソン2∼3の201塩基対につ

 いてPCRし，4％アガロースゲル電気泳動で分離

 エチジウムブロマイド染色したもの．4：患者4，  N：正常コントロール，M：DNAマーカー（φ×174  phage／Hae III処理）．  下段：上段のPCR増幅産物を〃舵 IIで処理し，  4％アガロースゲル電気泳動で分離，エチジウムブ  ロマイド染色したもの．4：患者4，N：正常コント  ロール，M：DNAマーカー（φ×174phage／Hae llI  処理）．変異82Thr→Metが生じると， PCR増幅産

 物のなかに存在していた伽6 11認識部位が消失

 し，89塩基対と112塩基対のフラグメントに切断され  なくなる．患者4は，正常コントロールと同様に切  断されており物θII認識部位は消失していない． 表3 β一ガラクトシダーゼ欠損症における遺伝子変異 遺 伝 子 型 表 現 型 日 _{本 人} 白 人 GM1 乳児型 DD（1） D？（1） GG（1）3） G？（6）3） IK （1） JK（1） P？（1） QQ（1） 幼児型 BB（1）D B？（4）1） ？？（1）

成人型 AA（16） AC（1） A？（2） RR（2）2，

？？（1） モルキオB病 FG（2） FH（1） F？（1） ？？（2） （）内は例数．遺伝子変異の略号 P：49Arg→Cys， Q：457Arg→Ter， R：82Thr→Met， その他は図1と共通．1，文献3），2，文献7），3，文献10）参照．

GMIガングリオシドーシス乳児型で計7例におい

て報告されていることである（ホモ接合体1例，

ヘテロ接合体6例）10）．482Arg→His（G）は，白人

種においてかなり共通な変異である可能性が示唆

される．しかし，今回の解析で，273Trp→Leu（F）

をもたないモルキオB病の患者の存在が明らか

になった．今後，273Trp→Leu（F）をもつ群ともた

ない群で表現型と遺伝子型を比較し，さらに人種

による違いを検討していく必要がある．

 一方，GM、ガングリオシドーシス成人型におけ

る遺伝子変異は，日本人では5111e→Thr（A）のホ

モ接合体あるいはヘテロ接合体だったが5），白人

種では82Thr→Met（R）ホモ接合体の報告があ

り7），今回我々が調べた患者4にはいずれの変異

も存在していなかった．各々の遺伝子型による表

現型の違いを検討してみると，5111e→Thr（A）の

ホモ接合体と82Thr．→Met（R）のホモ接合体は，

人種が違っても共に幼児期から青年期にかけて発

症し緩徐な経過をとっていた5）11）．一方，ヘテロ接

合体は，ホモ接合体に比べて発症時間が早く経過

も進行性で，どちらかというと幼児型に近い臨床

像を呈．していた5＞．このことは，さらに表現型と遺

伝子型の関係を詳細に検討する必要があることを

示している．

 β一ガラクトシダーゼ欠損症の中で，特に軽症型

のもの（GMIガングリオシドーシス幼児型・成人

型，モルキオB病）について，さらにその遺伝的

背景を明らかにし，病態発現機構を解明していく

ことは，将来治療的アプローチを考えるうえでも

重要である．．今回の解析により，表現型が一致し．

ていても，異なる人種では日本人と同一の特有な

変異をもたないことがわかった．今後さらに解析

を進め，．人種による違いと共通点を明らかにし℃

いくことによって病態発現機構の解明に有効であ

ると考えられる．

         ．結  語

 β一ガラクトシダーゼ欠損症の病態発現機構を解

明するために，従来その表現型を規定すると考え

られていた遺伝子変異について，白人種での解析

を行った．その結果，表現型は一致していても，

人種の違いによって遺伝子型は異なっていた．今

後，さらに人種による違いと共通点を解明し，表

現型と遺伝子型の関係について詳細な検討が必要

であると考えられた．

 本稿を，福山幸夫教授退職記念論文集に捧げる．

 本稿の要旨は，第35回日本先天代謝異常学会（1992

年11月5∼6日，大阪）で発表した．

      文  献

 1）0’Brien JS： β・Galactosidase deficiency（GM1−   gangliosidosis， galactosialidosis， and Morquio

  6yndrome type B）；g3nglioside sialidase

  de丘ciency（mucolipidosis IV）．勉The Meta−   bolic Basis of Inherited Disease， ed 6（Scriver   CR， Beaudet AL， Sly WS et al eds）pp1797   −1806，McGrヨw−Hi11， New York（1989） 2）Yoshida K， Oshima A， Shimmoto M et al：   Human β・galactosidase gene mutations in

  GMズgangliosidosis：A common mutation

  among Japanese adult／chronic cases． Am J   Hum Genet 49：435−442，1991 3）Nishimo鳶。 J， Na血ba E， Inui K et al：GM1．   gangliosidosis （genetic．β・galactosidase   deficiency）：Identi丘cation of four mutations in   difεerent clinical phenotypes among Japanese   patients。 Am J Hum Genet 49：566−574，1991 4）Oshima A， Yo6hida Kl， Shim瓢oto M et al：   Humanβ一galactosidase gene mutation in Mor．   quio B disease． Am J Hum Genet 49：   1091−1093， 1991       ・ 5）Yoshida K， Oshima A， Sakuraba H et a1：   GMrgangliosidosis in adults： Cl三nical and   molecular analysis of 16 JaPanese Patients．   Ann Neuro131：328−332，1992 6）大島章弘：遺伝代謝病一GM1ガングリオシドーシ

  ス遅発型を中心に一．神経精神薬理14．：

  513−518， 1992

7）Cbakraborty S， Ra血MA，．We籠ger DA：A

  point mutation in the acid betagalactosidase   cDNA sequence of 2 adult patien記s with GM1．  gangliosidosis． Proceeding of 8th Internat圭onal  Congress Human Genetlcs， WaShington DC，  P95（1991） 8）Aldridge J， Kunke1 L， Bru聡s G et a1：A  strategy to reveal high・frequency RFLPs along  the human X chomosome， Am J Hum Genet  36：546−564， 1984 9）Oshima A， Tsuji A， Nagao Y et a監：Cloning，  sequencing， and expression of cDNA for human  β一galactosidase． Biochem Biophys Res Com・

 mun 1571238−244，1988

10）Mosna G， Fattore S， Tubiello G et al：A  homozygous missense arginine to histidine sub・  stitution at position 4920f theβ一galactosidase  in an Italian infant避e・GMrgangliosidosis  patient． Hum Genet 90：247−250，1992 11）Wenger DA， Sattler M， Muener OT et al：  Adult GM、・ganighosidosis：Clinical and bio．  chemical studies on two patients a註d compari−  son to other patients called variant or adult  GMrgangliosidosis． Clin Genet 17：323−334，   1980