RNA編集機構を利用した
部位特異的
RNA変異導入を可能にする
新規ガイド
RNA
福岡大学理学部化学科
研究背景（タンパク質の合成経路 -セントラルドグマ-） DNA RNA タンパク質 設計図 生命現象の担い手 DNA情報を運ぶ 遺伝情報はDNA→RNA→タンパク質の順に流れる。 タンパク質の様々な機能により生命現象が支えられている
DNA RNA タンパク質 多くの病気はタンパク質の機能異常により生じる 作られる量や機能 が変わる 研究背景 （タンパク質機能の異常は病気の原因） 設計図 生命現象の担い手 DNA情報を運ぶ
DNA RNA タンパク質 設計図 生命現象の担い手 DNA情報を運ぶ タンパク質機能を自在に操ることができるようになれば、 生命現象を制御できる。 ＝病気の予防、治療ができる 機能制御 研究背景（タンパク質機能制御の位置づけ）
DNA RNA タンパク質 生体内標的タンパク質の機能を制御する方法 情報 機能 情報のレベルで標的タンパク質の機能 を制御 標的タンパク質の機能 を直接制御する （一般的な薬剤） （遺伝子改変技術）
ゲノム編集 siRNA, miRNA 恒常的 一過的 効果 標的 オフターゲットのリスク DNA RNA 大 小 遺伝子改変技術の比較 タンパク質制御 自在 発現抑制 RNA 一過的 小 自在 用途 DNA遺伝子治療 核酸製剤 使用物質 標的設定 相補鎖 相補鎖 RNA、タンパク質 RNA 相補鎖 RNA 未開発 RNA編集 （目的）RNAレベルで情報を改変する新たな技術を開発する 内在の機構を利用 内在の機構を利用 （CRISPR-Cas9）
RNA編集機構 DNA RNA タンパク質 N N N N NH2 O OH O P O -O O P O O -NH N N N O O OH O P O -O O P O O -adenosine inosine A-to-I RNA 編集 RNAの段階で遺伝情報を変換する
A-to-I RNA編集
● ほぼ全ての高等生物が持つ ● 生体の恒常性維持に必須の機構 ● IはGとして翻訳される（DNA上のA→G変異と等価） N N N N NH2 O OH O P O -O O P O O -NH N N N O O OH O P O -O O P O O -アデノシン (Adenosine) イノシン (Inosine) ADARADAR: Adenosine Deaminase Acting on RNA
A
I
＝タンパク質のアミノ酸配列（機能）が変わる
● miRNAのプロセシング及びRNAサイレンシングを制御
Nishikura, K. et al. Cell, 153, 575. (2013)
● スプライシングを制御
Prior to editing After A-to-I editing AGU/C IGU/C UAU/C UIU/C ACA/C/G/U IGA/C/G/U AUU/A/C IUU/C/A AUG IUG UAA UII CAU/C CIU/C AAA/G IGA/G AAU/C IAU/C CAA/G CIA/G GAU/C GIU/C GAA/G GIA/G IAA/G AIU/C Ser Tyr Thr Ile Start/Met Stop His Lys Asn Gln Asp Glu Gly Cys Ala Val Val Trp Arg Gly Glu Asp Ser Arg Gly Gly
UAG, UGA UIG, UGI
A-to-I RNA編集によるコドン変換
-AGU- -IGU- -GGU-
Ser Gly = （例） ● タンパク質リン酸化制御 約30%の細胞内タンパク質がリン酸化される （機能が調節されている） がんを始めとする腫瘍細胞では タンパク質リン酸化シグナル伝達が異常 ● タンパク質活性制御 ● タンパク質発現調節 開始コドン、終止コドンの変換 活性中心、金属配位アミノ酸の変換 様々な生体プロセスの制御が可能
Adenosine deaminase acting on RNA (ADAR) ● ADARノックアウトマウスは、 ADAR1: 胚性致死 ADAR2: 生後2〜3週間で致死
RNA編集酵素
● 二本鎖構造中のアデノシンを編集するHiguchi, M. et al., Nature, 406, 78. (2000) Wang, Q. et al., Science, 290, 1765. (2000)
dsRBD2 dsRBD1
Deaminase domain
Macbeth, M.R. et al. Science 309, 1534 (2005) Stefl, R et al. Cell, 143, 225. (2010)
hADAR2の構造 ● miRNAのプロセシング及びRNAサイレンシングを制御
Nishikura, K. et al. Cell, 153, 575. (2013) N N N N NH2 O OH O P O -O O P O O -NH N N N O O OH O P O -O O P O O -A I ● ほとんどの細胞種で発現（特に神経細胞で高発現）
A-to-I RNA編集機構を利用したRNA変異導入 dsRBD2 標的 RNA A I hADAR2 標的RNAにADARを誘導し、 部位特異的にA-to-I変異を導 入する RNA変異導入法 標的アデノシン
Deaminase domain (DD) guide-RNA (gRNA) SNAP-DD SNAP-tag
Stafforst, T. and Schneider, M. F.
Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 51, 11166. (2012)
A BzG-gRNA
λN-DD
λN
Montiel-Gonzalez, M. F. et. al.
PNAS, 110, 18285. (2013)
A boxN-gRNA
（修飾したADARを用いる） ・煩雑な操作が必要
・内在のRNA編集に干渉する可能性 従来のRNA変異導入法の特徴
本RNA変異導入技術のコンセプト 標的 RNA A I hADAR2 ADARを目的部位に 誘導するガイドRNA ADAR-guide RNA (AD-gRNA) AD-gRNAによるRNA変異導入 ・内在のRNA編集機構を利用 ・相補配列で標的を設定 標的アデノシン
CAUUA GGUGGGUGG AUA UAUAACAAUAU GUAGU CCAUCCACC UAU AUAUUGUUGUA
A G G C U A A G C C A dsRBDsとGluR2 RNAの複合体 (Stefl, R et al. Cell, 143, 225. (2010))
hADAR2 dsRBD1 dsRBD2 Deaminase domain GluR2 RNA （生体内の編集基質RNA） 編集ガイドRNA(AD-gRNA)設計コンセプト
GGGUGG AUA UAUAACAAUAU XXXXX XXXUCCACC UAU AUAUUGUUGUA
A G G C U A A G C C A NNNNN NNN 編集ガイドRNA(AD-gRNA)設計コンセプト 標的RNA AD-gRNA 相補領域 (<15 nt) ADAR結合領域 (40-49 nt) ● 天然型ADARを誘導 （内在のRNA編集機構を利用） ● 相補領域の配列で標的部位を設定
実施例 1 （AD-gRNAの設計と機能評価）
200
複合体形成確認（Gel shift assay）
(Annealing reaction condition) 300 nM GFPs RNA (160 nt) 900 nM AD-guide GFP_A200 10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl
80 ºC 3 min, slope 25 ºC for 15 min
8% Native PAGE (EtBr staining)
Lane 1: GFPs RNA (160 nt) Lane 2: AD-guide GFP_A200 Lane 3: Annealed sample
1 2 3
hADAR2
A +
in vitro editing reaction
RT-PCR Direct sequencing In vitro 編集解析 5’ ACUGGUGGGACUCGA A GFP mRNA UGACCACCCUGAGCU CGGCGUGCAGUGCUU GCC 3’ AD-guide GFP_A200 3’ C 配列設計
(reaction condition)
12.5 nM recombinat ADAR2, 5 nM guide RNA -target RNA complex, 20 mM HEPES-KOH
A G G C TAG C G G C G hADAR2 A Antisense RNA A G G C TGA C G G C G hADAR2 A AD-gRNA A G G C T A C G G C G A hADAR2 No guide-RNA GFP RNA 200 0 20 40 60 80 100
guide (-) antisense AD-guide GFP_A200 % editing 編集率（反応時間1時間） ※ ピーク高の比（G/(A+G)）から算出 実施例 1 （AD-gRNAの設計と機能評価） 標的部位特異的な 変異導入に成功 （変異導入効率：約80％）
改変型ADg-RNA（ADg-rRNA）の設計 3’-antisense GCCGCACGUCAUGAA C 5’ CGA 5’-antisense 200 5’ ACUGGUGGGACUCGA A GFP mRNA UGACCACCCUGAGCU CGGCGUGCAGUGCUU GCC 3’ ADg-GFP_A200 3’ C 200
5’ GFP mRNAUGACCACCCUGAGCU A CGGCGUGCAGUGCUU
3’
(reaction condition)
12.5 nM recombinat ADAR2, 5 nM guide RNA -target RNA complex, 20 mM HEPES-KOH (pH 7.5),2 mM MgCl, 150 mM NaCl,
guide RNA (-)
AD-guide GFPr_A200
Editing efficiency (vs time)
0 30 60 90 120 150 180 Time (min) % editing 100 80 60 40 20 0 AD-gRNA (5 -AS) AD-gRNA (3 -AS) 実施例 2 (ADg-rGFP_A200の設計と機能評価) 変異導入効率の向上に成功 （変異導入効率：約100％）
A
U G 173 AUG UGA stopI
U G 173 AUG UGA Trp ADg-GFP_A173 Reporter mRNA (GFP W58X) MV promoter pcDNA3.1_ GFP W58X GFP W58X MV promoter pcDNA3.1_ ADAR2 hADAR2 H1 promoter pSuper_AD-gRNA AD-gRNA Transfection HEK293 cell Montiel-Gonzalez, M. F. et. al.PNAS, 110, 18285. (2013)
GFP WT ADg-rGFP-A173 ADAR2 GFP W58X (-) ADAR2 GFP W58X 5’-AS ADAR2 GFP W58X ADg-rGFP-A173 ADAR2 Phase GFP Merge (Transfected plasmid) 実施例３ (AD-gRNAを用いた細胞内RNA変異導入)
