博士論文   (19.85MB)

博 士 論 文 論 文 題 目 植 物 免 疫 と し て の 活 性 酸 素 発 生 の 制 御 機 構 に 関 す る 研 究 2014 年 3 月 長 浜 バ イ オ 大 学 大 学 院 バ イ オ サ イ エ ン ス 研 究 科 バ イ オ サ イ エ ン ス 専 攻 バ イ オ 科 学 技 術 領 域 学 籍 番 号 511303 氏 名 神 村 麻 友

目 次 目 次 2 序 論 3 第 1 章 A. avenae N1141 菌 株 の フ ラ ジ ェ リ ン 認 識 に よ っ て 誘 導 さ れ る 活 性 酸 素 発 生 の 制 御 機 構 の 解 析 1-1 緒 言 12 1-2 材 料 お よ び 方 法 13 1-3 結 果 32 1-4 考 察 55 第 2 章 OsCPK12 に よ る 活 性 酸 素 発 生 の 制 御 機 構 の 解 析 2-1 緒 言 59 2-2 材 料 お よ び 方 法 60 2-3 結 果 79 2-4 考 察 112 参 考 文 献 116 謝 辞 126

序 論 日 本 の 農 業 は 危 機 的 な 状 況 に あ る 。1960 年 に 農 作 物 の 輸 入 自 由 化 が 始 ま る こ と で 、GDP に 占 め る 農 業 の 割 合 は 9％ か ら 今 日 で は 1％ に ま で 減 少 し た (農 林 水 産 省 、2010)。現 在 、米 や 小 麦 な ど の 重 要 品 目 に 高 い 関 税 を 掛 け る こ と で 、 日 本 農 業 の 保 護 を 行 っ て い る が 、2013 年 の TPP へ の 参 加 表 明 に よ っ て 今 後 農 作 物 貿 易 の 自 由 化 が 加 速 し て 、日 本 農 業 は 深 刻 な 打 撃 を 被 る と 予 想 さ れ る 。 農 産 物 貿 易 の 自 由 化 か ら 日 本 の 農 業 を 守 る た め に は 、 日 本 の 農 産 物 に 海 外 に 対 抗 で き る 競 争 力 を つ け る こ と で あ ろ う 。 し か し 、 日 本 の 国 土 は 狭 く 、 大 規 模 農 業 に は 向 か な い た め 、 ア メ リ カ や オ ー ス ト ラ リ ア な ど の 大 規 模 農 業 を 行 う 国 に 比 べ て 生 産 コ ス ト が 高 く な る 。 さ ら に 、 日 本 で は 農 家 一 戸 当 た り の 面 積 が EU の 9 分 の 1、ア メ リ カ の 99 分 の 1、オ ー ス ト ラ リ ア の 1862 分 の 1 と な っ て お り 、計 画 的 な 生 産 や 集 約 的 な 生 産 が 難 し い (農 林 水 産 省 、2013)。加 え て 、農 業 従 事 者 の 平 均 年 齢 は 65.8 歳 で あ り 、自 営 農 業 に 投 入 さ れ る 労 働 力 は 年 々 減 少 の 一 途 を 辿 っ て い る 。 こ の よ う に 生 産 性 や 生 産 コ ス ト 面 で は 外 国 の 農 産 物 に 対 応 で き な い の で 、 日 本 で は 味 や 品 質 の 良 い 農 作 物 を ブ ラ ン ド 化 し 、 付 加 価 値 を 付 け る こ と で 輸 入 農 作 物 と の 差 別 化 を 進 め て い る 。 そ の ブ ラ ン ド 化 の 一 つ と し て 、 無 農 薬 や 減 農 薬 野 菜 が 挙 げ ら れ る 。 現 在 日 本 で は 、 無 農 薬 野 菜 や 減 農 薬 野 菜 は 特 別 栽 培 農 産 物 に 分 類 さ れ 、 無 農 薬 野 菜 は 農 薬 を 使 用 せ ず に 栽 培 し た 農 産 物 、 減 農 薬 野 菜 は 農 薬 の 使 用 回 数 が 当 該 地 域 で 使 用 さ れ て い る 回 数 の お お む ね 5 割 以 下 で 栽 培 さ れ た 農 産 物 と し て 定 義 さ れ て い る 。 こ れ ら の 野 菜 は 一 般 的 な 野 菜 に 比 べ て 3 割 5 割 程 度 高 い が 、 こ こ 数 年 、 海 外 で も 健 康 志 向 な 消 費 者 が 増 え 、 日 本 の 無 農 薬 野 菜 や 減 農 薬 野 菜 な ど を 購 入 す る 人 が 増 加 し て い る 。 低 農 薬 や 減 農 薬 栽 培 は 日 本 の 農 産 物 に ブ ラ ン ド 力 を 付 与 す る が 、 安 易 に 農 薬 を 減 ら し た 農 産 物 栽 培 は 新 た な 問 題 を 引 き 起 こ す こ と が 近 年 明 ら か に な っ て い る 。 低 農 薬 や 減 農 薬 で 栽 培 す る こ と に よ り 、 土 壌 中 に 存 在 す る 薬 剤 に 対 し て 比 較 的 感 受 性 の 低 い 菌 を 完 全 に 駆 除 出 来 ず 、 薬 剤 低 感 受 性 の 菌 が 生 き 残 る 。 こ れ を 、 毎 年 繰 り 返 す こ と に よ り 、 特 定 の 薬 剤 に 対 し て 耐 性 を 示 す 薬 剤 耐 性 菌 が 蔓 延 す る 。 事 実 、 減 農 薬 や 低 農 薬 栽 培 等 に よ り 、 ナ シ 黒 斑 病 菌 に 使 用 す る ポ リ オ キ シ ン や イ ネ い も ち 病 に 使 用 す る カ ス ガ マ イ シ ン な ど 多 く の 薬 剤 耐 性 菌 が 見 つ か っ て お り 、 こ れ ら の 薬 剤 耐 性 菌 に よ っ て 農 家 は 大 き な 被 害 を 受 け て い る 。 現 在 で は 、 こ の よ う な 薬 剤 耐 性 菌 の 発 生 を 抑 え る た め に 複 数 の 薬 剤 を

ロ ー テ ー シ ョ ン で 散 布 す る こ と が 奨 励 さ れ て い る 。 し か し 、 こ の 方 法 も 、 薬 剤 耐 性 菌 の 出 現 が 遅 れ る の み で 完 全 に 薬 剤 耐 性 菌 を 駆 除 す る こ と は 出 来 な い 。 そ こ で 、 こ の よ う な 薬 剤 耐 性 菌 の 発 生 を 抑 制 す る こ と が で き る 薬 剤 の 開 発 が 進 め ら れ た 。 こ れ ま で の 殺 菌 剤 は RNA 合 成 や タ ン パ ク 質 合 成 な ど の 一 部 の 酵 素 や 代 謝 系 を ピ ン ポ イ ン ト に 狙 っ た 薬 剤 が 多 く 開 発 さ れ て き た 。 そ れ 故 に 、 菌 側 で 標 的 酵 素 の 構 造 に 変 異 が 生 じ て 薬 剤 耐 性 を 獲 得 す る こ と を 防 ぐ こ と が 出 来 な か っ た 。 そ こ で 、 植 物 が 本 来 有 し て い る 免 疫 機 構 を 活 性 化 す る 方 法 で 病 害 抵 抗 性 を 付 与 す る こ と が 出 来 れ ば 、こ れ は 薬 剤 耐 性 菌 の 発 生 は 無 く な る と 思 わ れ る 。 世 界 初 の 免 疫 賦 活 剤 と し て 開 発 さ れ た プ ロ ベ ナ ゾ ー ル は 、 植 物 の 抵 抗 性 誘 導 の シ グ ナ ル 伝 達 系 に 作 用 し 、 イ ネ 本 来 の 抵 抗 性 反 応 を 誘 導 す る こ と で い も ち 病 な ど の 真 菌 病 の み な ら ず 、 イ ネ 白 葉 枯 病 、 イ ネ も み 枯 れ 細 菌 病 な ど の 細 菌 病 害 に 対 し て も 優 れ た 効 果 を 発 揮 す る こ の 薬 剤 の 発 売 か ら 30 年 経 っ た 現 在 で も こ の 薬 剤 に 対 す る 薬 剤 耐 性 菌 は 検 出 さ れ て い な い こ と か ら 、 低 農 薬 や 減 農 薬 栽 培 に よ る 農 産 物 の ブ ラ ン ド 化 に は 重 要 な 農 薬 と な る で あ ろ う 。 し か し 、 こ の よ う な 免 疫 賦 活 剤 に は 植 物 の 成 長 阻 害 を 引 き 起 こ し 、収 量 の 低 下 を 招 く こ と が 知 ら れ て い る 。 農 産 物 に ブ ラ ン ド 力 を 付 加 す る 場 合 、 生 産 量 も 落 と さ な い こ と も 重 要 と な る が 、 こ の 様 な 薬 剤 は 未 だ 報 告 さ れ て い な い 。 収 量 の 低 下 を 引 き 起 こ さ な い 免 疫 賦 活 剤 の 開 発 の た め に は 、 植 物 の 免 疫 反 応 シ ス テ ム を 分 子 レ ベ ル で 詳 細 に 理 解 す る こ と が 必 要 と な る で あ ろ う 。 植 物 の 免 疫 シ ス テ ム の 中 で 、 微 生 物 に 広 く 保 存 さ れ た 病 原 体 分 子 パ タ ー ン (Pathogen-associated molecular patterns; PAMP) を 認 識 し 、 誘 導 さ れ る 免 疫 反 応 を PAMP-triggered immunity (PTI) と 呼 ぶ 。 植 物 の PTI を 誘 導 す る PAMP と し て は 、 こ れ ま で に 細 菌 の 鞭 毛 を 構 成 す る タ ン パ ク 質 で あ る フ ラ ジ ェ リ ン や 糸 状 菌 の 細 胞 壁 の 主 成 分 で あ る キ チ ン 、翻 訳 伸 長 因 子 EF-Tu、リ ポ 多 糖 (LPS)、ペ プ チ ド グ リ カ ン な ど が 報 告 さ れ て い る (Zipfel et al., 2004; Kunze et al., 2004; Zeidler et al., 2004; Okada et al., 2002)。

植 物 は こ れ ら の PAMP を パ タ ー ン 認 識 受 容 体 で 認 識 し 、PTI を 誘 導 す る こ と が 知 ら れ て い る 。シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ で は 、フ ラ ジ ェ リ ン の N 末 端 に あ る 保 存 さ れ た 22 残 基 の ア ミ ノ 酸 (flg22) を 認 識 す る パ タ ー ン 認 識 受 容 体 で あ る Flagellin-sensitive 2 (FLS2) が 同 定 さ れ て い る (Gómez-Gómez et al., 2000)。FLS2 は 細 胞 外 に リ ガ ン ド と 結 合 す る ロ イ シ ン リ ッ チ リ ピ ー ト 領 域 (LRR) を 持 ち 、細 胞 質 内 に セ リ ン /ス レ オ ニ ン キ ナ ー ゼ ド メ イ ン を 有 す る 一 回 膜 貫 通 型 の 受 容 体 様 キ ナ ー ゼ

(LRR-RLK) で あ る 。FLS2 は flg22 を 認 識 後 、速 や か に 他 の LRR-RLK で あ る BRI1-associated kinase1 (BAK1) と 複 合 体 を 形 成 す る (Chinchilla et al., 2007; Schulze et al., 2010)。 BAK1 は ブ ラ シ ノ ス テ ロ イ ド 受 容 体 で あ る Brassinosteroid insensitive 1 (BRI1) と 相 互 作 用 す る 分 子 と し て 同 定 さ れ 、 ブ ラ シ ノ ス テ ロ イ ド の 情 報 伝 達 に も 関 与 す る こ と が 明 ら か に な っ た 分 子 で あ る (Li et al., 2002; Nam and Li, 2002)。 FLS2/BAK1 複 合 体 は BOTRYTIS-INDUCED KINASE 1 (BIK1) に よ っ て リ ン 酸 化 さ れ 、 こ の リ ン 酸 化 情 報 が 細 胞 内 に 伝 達 さ れ る と 考 え ら れ る (Lu et al., 2010)。

パ タ ー ン 認 識 受 容 体 の リ ン 酸 化 情 報 が ど の 様 に 細 胞 内 に 伝 達 さ れ て い る か に つ い て は 未 だ 詳 細 な 知 見 が 得 ら れ て い な い が 、 少 な く と も 植 物 の Mitogen-activated protein kinase (MAPK) カ ス ケ ー ド が 関 与 す る こ と は 報 告 さ れ て い る (Meng and Zhang, 2013)。 シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ で は 、PAMP 認 識 シ グ ナ ル の 伝 達 に 関 与 す る 2 つ の MAPK カ ス ケ ー ド が 報 告 さ れ て い る 。１ つ は MEKK1 が MKK1/MKK2 を リ ン 酸 化 し 、 こ れ ら が さ ら に MPK4 を 活 性 化 す る 経 路 で あ る 。 MPK4 は 通 常 時 、 MAP kinase4 substrate1 (MKS1) と AtWRKY33 か ら な る 複 合 体 を 形 成 し て い る が 、MPK4 が リ ン 酸 化 さ れ る と 、 MKS1/AtWRKY33 複 合 体 が 解 離 し 、 遊 離 さ れ た AtWRKY33 に よ っ て 、 抗 菌 物 質 で あ る カ マ レ キ シ ン の 生 合 成 に 必 要 と さ れ て い る Phytoalexin deficient3 (PAD3) な ど の 免 疫 応 答 遺 伝 子 の 転 写 を 誘 導 す る (J.-L. Qiu et al., 2008)。 2 つ 目 は 、 MEKK1 が MKK4/MKK5 を 活 性 化 し 、 さ ら に こ れ ら の MKK に よ っ て 、 リ ン 酸 化 さ れ た MPK3/MPK6 が WRKY22 や WRKY29 を 活 性 化 す る こ と で 、Pathogenesis-related (PR) 遺 伝 子 等 の 免 疫 応 答 遺 伝 子 の 転 写 促 進 、 活 性 酸 素 の 発 生 、 過 敏 感 細 胞 死 な ど の 免 疫 反 応 を 誘 導 す る と 考 え ら れ て い る (Asai T et al., 2002; Ichimura et al., 2006; Nakagami et al., 2006; Suarez-Rodriguez et al., 2007)。 こ の よ う な PAMP 認 識 シ グ ナ ル に よ っ て 発 現 誘 導 さ れ る PR タ ン パ ク 質 は 、 病 原 菌 の 感 染 時 に 植 物 体 内 で 蓄 積 す る タ ン パ ク 質 の 総 称 で あ る (van Loon LC et al., 1999)。こ れ ま で に 明 ら か に な っ た PR タ ン パ ク 質 の う ち 、 グ ル カ ナ ー ゼ や キ チ ナ ー ゼ な ど は In vitro で 抗 菌 活 性 を 有 し て お り 、 病 害 抵 抗 性 に 寄 与 す る こ と が 示 さ れ て い る (van Loon LC et al., 1999) 。 こ れ ら の PR タ ン パ ク 質 の 多 く は シ グ ナ ル ペ プ チ ド を 有 し て お り 、 小 胞 輸 送 を 介 し て 細 胞 外 に 分 泌 さ れ る と 予 想 さ れ て い る 。 一 般 的 に 、 分 泌 シ グ ナ ル を 持 つ タ ン パ ク 質 は 翻 訳 さ れ た 後 、 小 胞 体 へ 送 ら れ 、 次 に 小 胞 体 か ら ゴ ル ジ 体 へ 輸 送 さ れ る 。 そ し て 、 ゴ ル

ジ 体 か ら 分 泌 小 胞 と し て 標 的 膜 へ と 輸 送 さ れ る 。小 胞 体-ゴ ル ジ 体 輸 送 の 分 泌 小 胞 の 形 成 に 関 わ る 分 子 で あ る ARF-GTP exchange factor (ARF-GEF) は コ ー ト 小 胞 の 形 成 に 関 わ る ADP ribosylation factor (ARF) を 不 活 性 な GDP 型 か ら 活 性 型 の GTP 型 に 変 換 し 、 ARF の コ ン フ ォ メ ー シ ョ ン 変 化 を 引 き 起 こ す 。 こ れ に よ り ARF の N 末 端 に 存 在 す る ミ リ ス ト イ ル 基 が 露 出 し 、 小 胞 膜 に 会 合 す る よ う に な る 。 膜 に 会 合 し た ARF は シ ス ゴ ル ジ で は COPI 複 合 体 、 ト ラ ン ス ゴ ル ジ ネ ッ ト ワ ー ク で は AP-1 複 合 体 や GGA の よ う な コ ー ト タ ン パ ク 質 を リ ク ル ー ト す る 。 次 に コ ー ト タ ン パ ク 質 が 積 み 荷 膜 タ ン パ ク 質 の 輸 送 シ グ ナ ル を 認 識 し て 集 合 さ せ る こ と で 脂 質 二 重 膜 が 変 形 し て 、 輸 送 小 胞 の 出 芽 が 起 こ る 。 こ の 出 芽 の く び れ た 部 分 が 切 り 取 ら れ て 、 輸 送 小 胞 が 完 成 す る 。 こ れ ま で に 、 シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の ARF-GEF で あ る GNOM は う ど ん こ 病 菌 で あ る Blumeria graminis f. sp. horidei (Bgh) の 植 物 細 胞 内 へ 侵 入 抵 抗 性 へ 関 与 す る こ と が 報 告 さ れ て い る (Henrik Böhlenius et al., 2010)。 ま た 、 オ オ ム ギ の ADP ribosylation factor1 A1b/1c (ARFA1b/1c) の 一 過 的 な 遺 伝 子 抑 制 で は 、Bgh の 侵 入 の 成 功 率 の 上 昇 や 免 疫 反 応 の 一 種 で あ る カ ロ ー ス の 沈 着 の 減 少 が 報 告 さ れ て い る こ と か ら (Böhlenius et al., 2010)、輸 送 小 胞 の 構 成 因 子 が 侵 入 抵 抗 性 に 関 わ る こ と が 予 想 さ れ て い る 。 さ ら に 、 ゴ ル ジ 体 か ら 分 泌 さ れ た 小 胞 の 標 的 膜 へ の 輸 送 に 関 わ る vesicle-associated soluble N-ethylmaleimide sensitive factor attachment protein receptor (SNARE) の AtSNAP33 は 病 原 菌 に よ っ て 発 現 誘 導 さ れ 、 AtSNAP33 は PR1a と 協 調 し て 発 現 し て い る こ と か ら (Wick et al., 2003)、 病 原 菌 認 識 後 、 免 疫 に 関 連 し た 小 胞 輸 送 の た め に こ の よ う な 遺 伝 子 の 発 現 を 誘 導 し て い る と 考 え ら れ て い る 。さ ら に 、別 の SNARE タ ン パ ク 質 で あ る PEN1-Syntaxin は SNAP33、 VAMP721/722 と SNARE 複 合 体 を 形 成 す る こ と で 、Bgh の 侵 入 サ イ ト に 正 確 に 局 在 し 、 病 原 菌 の 侵 入 の 阻 止 に 関 与 し て い る 。 (Kwon et al., 2008; Collins et al., 2003; Assaad et al., 2004; Bhat et al., 2005; Kwon et al., 2008) 。 こ の よ う に 、 小 胞 輸 送 が 免 疫 に 関 与 し て い る こ と が 明 ら か に な り つ つ あ る が 、 詳 細 な メ カ ニ ズ ム や 制 御 機 構 に つ い て は 未 だ 不 明 な ま ま で あ る 。

パ タ ー ン 認 識 受 容 体 か ら の シ グ ナ ル 伝 達 に よ っ て 誘 導 さ れ る 免 疫 反 応 の 一 つ に 一 過 的 な 活 性 酸 素 の 発 生 が あ る 。 こ の 活 性 酸 素 の 発 生 は rboh (Respiratory burst oxidase homologue) と 呼 ば れ る NADPH オ キ シ ダ ー ゼ を 介 し て 誘 導 さ れ て お り 、 病 原 菌 認 識 後 、 極 め て 早 い 段 階

に 認 め ら れ る の が 特 徴 で あ る 。 こ の 系 で は 、 細 胞 膜 外 の 間 隙 で あ る ア ポ プ ラ ス ト に 活 性 酸 素 種 の 一 種 で あ る ス ー パ ー オ キ シ ド ア ニ オ ン (O2-) を 発 生 さ せ る 。 こ の 発 生 し た O2-は 、 す ぐ に Superoxide dismutase (SOD) に よ っ て 、過 酸 化 水 素 (H2O2) に 変 換 さ れ る 。こ の H2O2は 直 接 的 な 殺 菌 作 用 、細 胞 壁 で の ヒ ド ロ キ シ プ ロ リ ン に 富 む 糖 タ ン パ ク 質 の 酸 化 的 架 橋 反 応 の 促 進 、PR タ ン パ ク 質 を 誘 導 す る サ リ チ ル 酸 生 合 成 経 路 の 活 性 化 を 引 き 起 こ し 、 病 原 菌 の 増 殖 お よ び 進 入 阻 害 に 寄 与 し て い る こ と が 示 さ れ て い る (Bradley et al., 1992; Leon et al., 1995; Yoshioka et al., 2004)。rboh は ヒ ト の 好 中 球 に あ る NADPH オ キ シ ダ ー ゼ の 活 性 中 心 で あ る gp91phox_{と 相 同 性 を 有 す る 分 子 で あ り 、} 6 ヶ 所 の 膜 貫 通 領 域 、FAD 結 合 部 位 お よ び NADPH 結 合 部 位 、電 子 を 受 け 渡 す ヘ ム と の 結 合 に 必 要 な 4 つ の ヒ ス チ ジ ン 残 基 が 保 存 さ れ て い る 。 し か し 、 植 物 の rboh は ヒ ト gp91phox_{と は 異 な り 、 細 胞 質 に 存 在} す る と 考 え ら れ る N 末 端 親 水 性 領 域 を 持 っ て お り 、こ の 領 域 に は Ca2 ＋_{と 特 異 的 に 結 合 す る 2 つ の EF hand モ チ ー フ が 存 在 す る (Keller et} al., 1998)。 動 物 の 好 中 球 や マ ク ロ フ ァ ー ジ に 存 在 す る NADPH オ キ シ ダ ー ゼ は 、細 胞 膜 に 存 在 す る シ ト ク ロ ム b558 (gp91phox、p22phox) と

細 胞 質 因 子 (p67phox_、p47phox_{、small GTPase Rac2) か ら 構 成 さ れ る}

複 合 酵 素 体 で あ る 。 こ の 酵 素 は p47phox _{が あ る 種 の 刺 激 に 応 答 し て リ} ン 酸 化 さ れ 、p67phox_{、Rac2 と 共 に 細 胞 膜 に 移 行 し た 後 、 細 胞 膜 因 子} と 複 合 体 を 形 成 し て 活 性 化 す る 。活 性 化 し た NADPH オ キ シ ダ ー ゼ は 、 細 胞 質 の NADPH の 酸 化 と 共 役 し て 、 細 胞 外 の 酸 素 分 子 (O2) を １ 電 子 還 元 し て ス ー パ ー オ キ シ ド (O2-) を 生 成 す る 。好 中 球 や マ ク ロ フ ァ ー ジ は 病 原 菌 を エ ン ド サ イ ト ー シ ス に よ り 取 り 込 み 、 細 胞 内 で こ の 活 性 酸 素 種 を 用 い て 殺 菌 を 行 っ て い る (Babior, 2004)。一 方 、植 物 に は Rboh と Rac2 と ホ モ ロ ジ ー を 有 す る Rac/Rop GTPase、 OsRac1 以 外 の 活 性 化 因 子 は 存 在 し な い (Torres et al., 2005)。OsRac1 は コ シ ャ ペ ロ ン で あ る RAR1、SGT1、Hsp70、Hsp90、Hop/Sti1、足 場 タ ン パ ク 質 で あ る OsRACK1、リ グ ニ ン 合 成 酵 素 で あ る OsCCR1 の よ う な 様 々 な タ ン パ ク 質 と 相 互 作 用 し 、 複 合 体 を 形 成 し て い る こ と が 報 告 さ れ て い る (Kawasaki et al., 2006, Thao et al., 2007, Nakashima et al., 2008, Chen et al., 2010)。 さ ら に 、 OsRac1 は 活 性 酸 素 種 の ス カ ベ ン ジ ャ ー で あ る MT2b の 発 現 を 抑 制 す る こ と か ら 、活 性 酸 素 種 の 発 生 を 調 節 し て い る こ と が 示 唆 さ れ て い る (Wong et al., 2007、Wong et al., 2004)。 ま た 、 Rboh の 活 性 は N 末 端 部 位 の リ ン 酸 化 と EF hand モ チ ー フ へ の Ca2+_{の 結 合 に よ っ て 制 御 さ れ て い る こ と も 示 さ れ て い る}

(Ogasawara et al., 2008; Takeda et al., 2008; Kimura et al., 2012)。 こ れ ら の こ と か ら 、 植 物 に お け る NADPH oxidase を 介 し た 活 性 酸 素 の 発 生 と そ の 制 御 機 構 は 、 動 物 と は 異 な る こ と が 示 さ れ て い る 。 当 研 究 室 で は 、褐 条 病 細 菌 Acidovorax avenae を 用 い て 病 原 菌 の 認 識 及 び 免 疫 反 応 誘 導 機 構 に つ い て 研 究 を 行 っ て き た 。A. avenae は イ ネ 等 の 単 子 葉 植 物 を 宿 主 と す る グ ラ ム 陰 性 の 植 物 病 原 細 菌 で あ り 、 本 菌 に 感 染 し た イ ネ は 葉 鞘 か ら 葉 身 に か け て 褐 色 の 細 長 い 条 斑 が 現 れ 、 個 体 の 衰 弱 や 成 長 抑 制 、 葉 鞘 の 屈 曲 や 倒 状 、 枯 死 と い っ た 病 徴 を 示 す (Kadota, 1990)。 こ の 菌 の 特 徴 は 、 そ れ ぞ れ の 菌 株 の 宿 主 特 異 性 が 植 物 の 種 レ ベ ル で 厳 密 で あ り 、 一 つ の 菌 株 が 感 染 で き る 植 物 種 は ほ ぼ 一 種 に 限 定 さ れ て い る こ と で あ る 。例 え ば 、イ ネ を 宿 主 と す る K1 菌 は 、 イ ネ に は 感 染 で き る が 、 イ ネ 以 外 の 植 物 種 に は 感 染 で き ず 、 ま た 、 シ コ ク ビ エ を 宿 主 と す る N1141 菌 は シ コ ク ビ エ 以 外 の 植 物 種 に 感 染 す る こ と は で き な い 。 こ れ ま で の 研 究 で 、A. avenae の イ ネ に 対 し て 非 病 原 性 で あ る N1141 菌 株 を イ ネ に 接 種 し た 場 合 、核 DNA の ラ ダ ー 化 や 細 胞 膜 収 縮 と い っ た 動 物 の ア ポ ト ー シ ス 様 の 形 態 変 化 を 伴 う 過 敏 感 細 胞 死 や 活 性 酸 素 の 発 生 、免 疫 反 応 に 関 与 す る と 考 え ら れ て い る EL2、 EL3、抗 菌 性 物 質 で あ る フ ァ イ ト ア レ キ シ ン 合 成 に 関 与 す る PAL、キ チ ナ ー ゼ を コ ー ド す る Cht-1、 ジ ャ ス モ ン 酸 の 生 成 に 関 与 す る リ ポ キ シ ゲ ナ ー ゼ を コ ー ド す る LOX、PBZ-1 等 の 抵 抗 性 関 連 遺 伝 子 の 発 現 等 の 一 連 の 免 疫 反 応 が 誘 導 さ れ る こ と が 示 さ れ た 。 一 方 、 イ ネ に 対 し て 病 原 性 で あ る K1 菌 株 を 接 種 し た 場 合 に は こ の よ う な 免 疫 反 応 は 誘 導 さ れ な い こ と か ら 、 こ の 菌 の イ ネ に 対 す る 宿 主 特 異 性 に は イ ネ に よ る 病 原 菌 の 認 識 と 免 疫 反 応 誘 導 が 関 与 す る こ と が 明 ら か と な っ た (Che et al., 1999; Iwano et al., 2002)。 さ ら に 、 非 病 原 性 N1141 菌 株 と 病 原 性 K1 菌 株 の イ ネ に よ る 特 異 的 な 認 識 に 関 わ る 物 質 と し て 、 鞭 毛 を 構 成 す る タ ン パ ク 質 で あ る フ ラ ジ ェ リ ン が 同 定 さ れ た 。 非 病 原 性 N1141 菌 株 の フ ラ ジ ェ リ ン を イ ネ 培 養 細 胞 に 処 理 す る と 活 性 酸 素 種 発 生 や 、EL2 や EL3 等 の 抵 抗 性 関 連 遺 伝 子 の 発 現 が 誘 導 さ れ る が (Minami et al., 1996)、 病 原 性 K1 菌 株 の フ ラ ジ ェ リ ン を 処 理 し て も こ の よ う な 抵 抗 性 反 応 は 誘 導 さ れ な か っ た (Che et al., 2000)。 こ の こ と か ら 、 こ の 菌 の フ ラ ジ ェ リ ン は イ ネ に 対 し て 特 異 的 な 免 疫 反 応 を 誘 導 す る 物 質 で あ る こ と が 明 ら か に な っ た 。 シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ で は フ ラ ジ ェ リ ン の N 末 端 共 通 部 分 か ら 合 成 さ れ た 22 ア ミ ノ 酸 か ら な る flg22 が FLS2 に よ っ て 認 識 さ れ MAPK カ ス ケ ー ド を 介 し て そ の 情 報 が 伝 達 さ れ る こ と が 知 ら れ て い る 。 興 味 深 い

こ と に 、A. avenae N1141 菌 株 の フ ラ ジ ェ リ ン は シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ に 対 し て 免 疫 反 応 を 誘 導 す る が 、flg22 は イ ネ に 対 し て 顕 著 な 免 疫 反 応 を 誘 導 し な い こ と が 示 さ れ た 。 さ ら に 、A. avenae N1141 菌 株 の フ ラ ジ ェ リ ン の 様 々 な 部 分 を 大 腸 菌 で 発 現 さ せ 、 そ れ ぞ れ の ド メ イ ン に お け る 免 疫 誘 導 活 性 を 調 べ た と こ ろ 、 イ ネ は シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ と は 異 な り フ ラ ジ ェ リ ン の flg22 部 位 で は な く 、 C 末 端 部 分 を 認 識 す る こ と が 明 ら か に な っ た 。 ま た 、 シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ に お い て flg22 の 認 識 受 容 体 で あ る FLS2 の イ ネ オ ル ソ ロ グ は 存 在 し て い る も の の 、 実 際 の フ ラ ジ ェ リ ン 認 識 に は ほ と ん ど 関 与 し て お ら ず 、 イ ネ に は FLS2 と は 異 な る フ ラ ジ ェ リ ン 受 容 体 が 存 在 し て い る こ と が 示 さ れ た 。 さ ら に 、 イ ネ に 疑 似 リ ン 酸 化 さ れ た OsMKKDD_{を 過 剰 発 現 さ せ る と 活 性 酸 素 の 発 生 は 誘 導} さ れ ず 、 細 胞 死 の み が 誘 導 さ れ る が 、 タ バ コ に OsMKKDD_{を 過 剰 発 現} さ せ る と 活 性 酸 素 の 発 生 と 細 胞 死 の 両 方 が 誘 導 さ れ る こ と が 報 告 さ れ た (Kishi-Kaboshi et al., 2010)。以 上 の こ と は 、イ ネ は タ バ コ や シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ と は 異 な る フ ラ ジ ェ リ ン の 認 識 機 構 と そ の 情 報 伝 達 機 構 を 有 す る こ と を 示 し て い る 。 し か し 、 イ ネ に お け る フ ラ ジ ェ リ ン の 認 識 と そ の 情 報 伝 達 機 構 、 お よ び 免 疫 反 応 誘 導 の 機 構 に つ い て は ほ と ん ど 明 ら か に な っ て い な い 。 イ ネ に お け る 耐 病 性 機 構 を 明 ら か に す る た め に は 、 特 に 、 病 原 菌 の 認 識 情 報 が ど の 様 に 細 胞 内 に 伝 達 さ れ る の か を 明 ら か に す る こ と が 非 常 に 重 要 と な る 。そ こ で 本 研 究 で は 、A. avenae N1141 菌 株 の フ ラ ジ ェ リ ン 認 識 の イ ネ 細 胞 内 情 報 伝 達 機 構 を 分 子 レ ベ ル で 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し た 。 ま ず 第 1 章 で は 、A. avenae N1141 菌 株 の フ ラ ジ ェ リ ン 認 識 に よ っ て 誘 導 さ れ る 活 性 酸 素 発 生 の 制 御 機 構 を 調 べ る た め 、 様 々 な 情 報 伝 達 阻 害 剤 が 活 性 酸 素 発 生 に 与 え る 影 響 を 調 べ た 。 そ の 結 果 、 フ ラ ジ ェ リ ン 認 識 後 の 活 性 酸 素 の 発 生 に は 細 胞 内 Ca2+_{濃 度 の 上 昇 と タ ン パ ク 質} の リ ン 酸 化 が 関 与 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。 さ ら に 、Ca2+_{依 存 的 に}

タ ン パ ク 質 を リ ン 酸 化 す る Calcium-dependent protein kinase (CPK) を 調 べ る こ と に よ り 、免 疫 反 応 誘 導 時 に 発 現 誘 導 さ れ る 6 つ の OsCPK 遺 伝 子 を 明 ら か に す る と 共 に 、OsCPK12 に よ っ て 活 性 酸 素 の 発 生 が 制 御 さ れ て い る こ と を 示 し た 。 第 2 章 で は 、 OsCPK12 の 活 性 酸 素 発 生 の 制 御 機 構 を 明 ら か に す る た め 、OsCPK12 の 基 質 を 探 索 し た 。 ま ず 、 キ ナ ー ゼ と 基 質 の よ う な 一 過 的 な 相 互 作 用 を 検 出 す る こ と が 出 来 る 検 定 系 を 構 築 し た 。 こ の 検 定 系 を 用 い て OsCPK12 の 基 質 分 子 を 探 索 し た と こ ろ 、 OsrbohA と Syntaxin-like protein13b (OsSYP13b) を 基 質 候 補 タ ン パ ク 質 と し て 同 定 し た 。 さ ら に 、 植 物 細

胞 内 に お い て OsCPK12 と OsrbohA、OsSYP13b と の 相 互 作 用 を BiFC 法 に よ り 解 析 し た 結 果 を 示 す と 共 に 、OsCPK は カ ル モ ジ ュ リ ン 様 ド メ イ ン に Ca2+_{が 結 合 し な い と 活 性 化 さ れ な い た め 、キ ナ ー ゼ 以 降 を 欠} 損 さ せ た OsCPK12 恒 常 活 性 体 や 、 活 性 中 心 の ア ス パ ラ ギ ン 酸 を ア ス パ ラ ギ ン に 置 換 し た OsCPK12 の 変 異 体 を 用 い て 相 互 作 用 を 解 析 し た 結 果 に つ い て も 述 べ る 。 こ れ ら の 結 果 を 踏 ま え て 、 植 物 免 疫 に お け る 情 報 伝 達 機 構 に つ い て 議 論 し て い き た い 。

第 1 章

A . a v e n a e N 1 1 4 1 菌 株 の フ ラ ジ ェ リ ン 認 識 に よ っ て 誘 導 さ れ る 活 性 酸 素 発 生 の 制 御 機 構 の 解 析

第 1 章 A . a v e n a e N 1 1 4 1 菌 株 の フ ラ ジ ェ リ ン 認 識 に よ っ て 誘 導 さ れ る 活 性 酸 素 発 生 の 制 御 機 構 の 解 析 1 - 1 緒 言 A. avenae 非 病 原 性 N1141 菌 の フ ラ ジ ェ リ ン は 、イ ネ に 対 し て 過 敏 感 細 胞 死 や 活 性 酸 素 種 発 生 の 誘 導 、EL2 や EL3 等 の 抵 抗 性 関 連 遺 伝 子 の 発 現 な ど の 植 物 免 疫 反 応 を 誘 導 す る 特 異 的 な エ リ シ タ ー と し て 作 用 す る こ と が 報 告 さ れ て い る (Minami et al., 1996)。N1141 菌 株 の フ ラ ジ ェ リ ン が 誘 導 す る こ の よ う な 免 疫 反 応 の 中 で も 、 活 性 酸 素 の 発 生 は フ ラ ジ ェ リ ン 認 識 後 、 比 較 的 早 期 に 誘 導 さ れ 、 直 接 的 な 殺 菌 作 用 、 細 胞 壁 で の ヒ ド ロ キ シ プ ロ リ ン に 富 む 糖 タ ン パ ク 質 の 酸 化 的 架 橋 反 応 の 促 進 、PR タ ン パ ク 質 を 誘 導 す る サ リ チ ル 酸 生 合 成 経 路 の 活 性 化 を 引 き 起 こ す こ と で 、 病 原 菌 の 増 殖 お よ び 進 入 阻 害 に 寄 与 す る こ と が 示 さ れ て い る (Bradley et al., 1992; Leon et al., 1995; Yoshioka et al., 2004)。 そ こ で 、 第 1 章 で は 、 こ の 活 性 酸 素 発 生 の 制 御 機 構 を 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し 、 研 究 を 行 っ た 。

1 - 2 材 料 お よ び 方 法

1. イ ネ 培 養 細 胞 の 培 養 と 継 代

イ ネ 培 養 細 胞 は 、Oc 細 胞 (Oryza sativa L. C5924) を 用 い た (Baba et al., 1986)。培 養 細 胞 は 100 ml 三 角 フ ラ ス コ に R2S 培 地 (39.6 mM KNO3 、 2.5mM (NH4)2SO4 、 1.0 mM MgSO4•7H2O 、 1.0 mM

CaCl2•2H2O 、 1.7 mM NaH2PO4•2H2O 、 20.1 µM EDTA•2Na

(DOJINDO)、 19.8 µM FeSO4•7H2O、 6.6 µM MnSO4•4H2O、 7.7 µM

ZnSO4•4H2O 、 0.5 µM CuSO4•5H2O 、 48.5 µM H3BO3、0.6 µM

NaMoO4•2H2O、 1% [w/v] Murashige and Skoog vitamin powder

[Sigma]、18 µM 2,4-dichlorophenoxyacetic acid、87.6 mM Sucrose、 pH 5.6) 20 ml を 入 れ 、 そ こ に 、 培 養 後 7 日 目 の 培 養 細 胞 液 2 ml を 加 え 、 培 養 温 度 30℃ 、108 rpm、連 続 光 下 で 振 盪 培 養 を 行 っ た 。細 胞 は 一 週 間 ご と に 植 え 継 ぎ 、 継 代 か ら 4 日 目 の も の を 実 験 に 用 い た 。

2 . 細 菌 と そ の 保 存 • 培 養 条 件

植 物 病 原 細 菌 の Acidovorax avenae イ ネ か ら 単 離 さ れ た K1 菌 株 (MAFF 301755; イ ネ 親 和 性 ) (Fukumoto et al., 1997) と 、 シ コ ク ビ エ か ら 単 離 さ れ た N1141 菌 株 (MAFF 301141; イ ネ 非 親 和 性 ) (Che et al., 2000; Kadota et al., 1996) を 用 い た 。菌 体 の 保 存 の た め 、各 菌 株 は Pseudomonas agar F 寒 天 培 地 (1% [w/v] Bacto Tryptone [BD]、 1% [w/v] Protease Peptone No. 3 [BD]、0.15% [w/v] K2HPO4、0.15%

[w/v] MgSO4、1.5% [w/v] Bact TM agar [BD]) 上 で 30℃ 、一 晩 培 養 し 、

ス キ ム ミ ル ク 培 地 (10% [w/v] Skim milk powder 、 1.5% [w/v] L-glutamic acid monosodium salt) 1 ml に 懸 濁 し た 。 こ れ を 50 µl ず つ 分 注 後 、-80℃ で 凍 結 保 存 し 、 こ れ を ス ト ッ ク 菌 株 と し た 。 3 . イ ネ 培 養 細 胞 へ の 接 種 A. avenae の ス ト ッ ク 菌 株 50 µl を Pseudomonas F 寒 天 培 地 に 塗 布 し 、30℃ で 一 晩 培 養 し た 。こ の 菌 体 を 白 金 耳 で 掻 き 取 り 滅 菌 水 中 に 懸 濁 し 、 分 光 光 度 計 に よ り 波 長 610 nm の 吸 光 度 を 測 定 し 、 下 記 の 式 を 用 い て 菌 体 数 を 概 算 し た (Tsuge, 1997) 。 概 算 後 、 懸 濁 液 を 1.0×107 cfu/µl に 調 整 し 、 イ ネ 培 養 細 胞 へ 終 濃 度 1.0×108 _{cfu/ml に な る よ う に} 接 種 し た 。 [cfu/µl] = (OD610 − 0.0797) /3.78×108× (希 釈 倍 率 /50)

4 . プ ラ ス ミ ド の 作 製

1 ) O s C P K R N A i 形 質 転 換 体 作 製 用 の コ ン ス ト ラ ク ト の 作 製 各 OsCPK の RNAi 株 を 作 製 す る た め 、OsCPK フ ァ ミ リ ー 内 で 比 較 的 保 存 性 の 低 い ORF の 3’側 と 3’ UTR を 含 む 領 域 を 増 幅 す る プ ラ イ マ ー を 設 計 し た (Fig. 7)。 ま た 、 作 製 し た プ ラ イ マ ー を 用 い て 各 遺 伝 子 を 増 幅 し た 場 合 、Oriza sativa 内 の 他 の 遺 伝 子 と 相 同 性 が ほ と ん ど な い こ と を NCBI の デ ー タ ベ ー ス か ら Blast N で 確 認 し た (Data not shown)。こ の 作 製 し た プ ラ イ マ ー を 用 い て イ ネ 培 養 細 胞 の cDNA を テ ン プ レ ー ト と し て PCR 反 応 を 行 っ た 。 反 応 液 (10×PCR buffer for Blend Taq 2 µl、 2 mM dNTPs 2 µl、 Blend Taq [TOYOBO] 0.08 µl、 滅 菌 水 13.2 µl、10 µM Primer F 1 µl、10 µM Primer R 1 µl、Total vol. 20 µl) を 調 製 し て 、94℃ 2 分 、 (96℃ 30 秒 、55℃ 1 分 、72℃ 1 分 30 秒 ) ×30 サ イ ク ル で PCR を 行 っ た 。 PCR 後 、 PCR 反 応 液 3 µl を 1.25％ TAE Agarose ゲ ル に ア プ ラ イ し 、 100 V で 約 25 分 電 気 泳 動 を 行 い 、OsCPK7、OsCPK8、OsCPK10、OsCPK12、OsCPK13、OsCPK19 の 増 幅 断 片 が 522 bp、 520 bp、 490 bp、 527 bp、 515 bp、 542 bp と な る こ と を 確 認 し た 。 増 幅 し た PCR 産 物 を pENTR-D-TOPO cloning kit (Invitrogen) を 用 い て pENTR-D-TOPO vector へ ラ イ ゲ ー シ ョ ン し た 。DH5α コ ン ピ テ ン ト セ ル 50 µl に 上 記 の ラ イ ゲ ー シ ョ ン 溶 液 を 2 µl 加 え 、緩 や か に 攪 拌 し 氷 上 で 20 分 間 静 置 し た 後 、42℃ で 50 秒 間 ヒ ー ト シ ョ ッ ク 、氷 上 で 2 分 静 置 し 、SOC 培 地 (2%BactoTM _Tryptone、

0.5%BactoTM _{Yeast Extract、85 mM NaCl、20 mM Glucose、10 mM}

MgCl2、10 mM MgSO4、pH7.0) 950 µl を 加 え て 37℃ で 1 時 間 振 盪 培

養 し た 。 こ れ を LB 寒 天 培 地 (カ ナ マ イ シ ン 終 濃 度 50 µg/ml) に 塗 布 し 、37℃ で 一 晩 静 置 培 養 し た 。生 育 し て き た そ れ ぞ れ の コ ロ ニ ー が 導 入 し た プ ラ ス ミ ド を 保 持 し て い る か コ ロ ニ ーPCR で 確 認 し た 。挿 入 断 片 が 確 認 さ れ た _{PCR 産 物 5 µl に ExoSAP-IT (GE Healthcare) を 2 µl} 加 え 、37℃ で 30 分 反 応 さ せ た 後 、80℃ で 15 分 間 処 理 す る こ と で 失 活 さ せ た 。 サ イ ク ル シ ー ク エ ン ス 反 応 溶 液 (BigDye Premix [Applied Biosystems] 2.5 µl、ExoSAP-IT 処 理 済 み PCR 産 物 2 µl、1 µM primer F 1 µl) を 調 製 し 、 (96℃ 10 秒 、 50℃ 5 秒 、 60℃ 4 分 ) ×40 サ イ ク ル の 条 件 で サ イ ク ル シ ー ク エ ン ス 反 応 を 行 っ た 。 反 応 終 了 後 、 反 応 液 に _{250 mM EDTA を 含 む 1.5M 酢 酸 ナ ト リ ウ ム 溶 液 (pH8.0) 1 µl、} 99.5％ エ タ ノ ー ル 25 µl 加 え 、Vortex で よ く 攪 拌 し て 15 分 静 置 し た 。 15,300×g、 室 温 、 TOMY MX300 (TOMY) を 用 い て 15 分 間 遠 心 分 離

を 行 っ た 後 、上 清 を デ カ ン ト で 取 り 除 き 、70％ エ タ ノ ー ル 100 µl を 加 え 、 転 倒 混 和 し 、15,300×g、 室 温 で 10 分 間 TOMY MX300 を 用 い て 遠 心 分 離 を 行 っ た 。 上 清 を 取 り 除 き 、 沈 殿 を 風 乾 し た 後 、Hi-Di Formamide (ABI) を 25 µl 加 え た 。こ の 溶 液 を 96-well Reaction Plate に 移 し 、MicroAmp Full Plate Cover (Applied Biosystems) で 蓋 を し た 。95℃ 、 2 分 熱 処 理 を 行 い 、 直 ち に 氷 中 で 急 冷 し た 後 、 DNA シ ー ク エ ン サ ー (3130 genetic analyzer) で 配 列 解 析 を 行 っ た 。 目 的 導 入 遺 伝 子 の 配 列 と 完 全 一 致 す る 遺 伝 子 を 持 つ プ ラ ス ミ ド を エ ン ト リ ー ク ロ ー ン と し た 。作 製 し た エ ン ト リ ー ク ロ ー ン (OsCPK7_RNAi/pENTR、 OsCPK8_RNAi/pENTR 、 OsCPK10_RNAi/pENTR 、 OsCPK12_RNAi/pENTR 、 OsCPK13_RNAi/pENTR 、 OsCPK19_RNAi/pENTR [100 ng/µl]) 1.5 µl、 デ ス テ ィ ネ ー シ ョ ン ベ ク タ ー (pANDA [100 ng/µl]) 1.5 µl、 TE buffer 5 µl に 、 LR clonase Enzyme Mix kit (Invitorogen) の LR clonase enzyme mix を 2 µl 加 え 、室 温 で 1 時 間 静 置 し た 。そ の 後 Proteinase K を 1 µl 入 れ 、37℃ 、 10 分 間 静 置 す る こ と に よ り 反 応 を 停 止 さ せ た 。 そ の 反 応 液 3 µl を DH5αに 加 え 、 ハ ナ ハ ン 法 で 形 質 転 換 後 、 37℃ で 一 晩 培 養 し た 。 生 育 し て き た コ ロ ニ ー が 導 入 し た プ ラ ス ミ ド を 保 持 し て い る か コ ロ ニ ー PCR で 確 認 し た 。目 的 遺 伝 子 の 増 幅 が 見 ら れ た コ ロ ニ ー を LB 液 体 培 地 (カ ナ マ イ シ ン 終 濃 度 50 µg/ml) 3 ml で 37℃ 一 晩 振 盪 培 養 し 、 4,200×g、 4℃ 、 5 分 間 遠 心 分 離 し た 。 菌 体 を 回 収 後 、 QIAprep Spin Miniprep kit (QIAGEN) を 用 い て プ ラ ス ミ ド を 単 離 し た 。こ れ ら の プ ラ ス ミ ド を そ れ ぞ れ 、DNA シ ー ク エ ン サ ー で 配 列 解 析 し 、目 的 導 入 遺 伝 子 と 完 全 一 致 す る 配 列 を 有 す る プ ラ ス ミ ド を OsCPK RNAi 形 質 転 換 体 作 製 用 の コ ン ス ト ラ ク ト と し た 。 こ の よ う に し て 作 製 し た コ ン ス ト ラ ク ト を OsCPK7_RNAi/pANDA 、 OsCPK8_RNAi/pANDA 、 OsCPK10_RNAi/pANDA 、 OsCPK12_RNAi/pANDA 、 OsCPK13_RNAi/pANDA、 OsCPK19_RNAi/pANDA と 名 付 け た 。 使 用 し た プ ラ イ マ ー セ ッ ト 目 的 遺 伝 子 断 片 を 増 幅 す る た め の プ ラ イ マ ー セ ッ ト ＜OsCPK7＞ Forward

：

5’-TGGAGAACATAACATGGAGG-3’ Reverse

：

5’-GGAACGCAAGCATTGAGATT-3’

＜OsCPK8＞ Forward

：

5’-AGAGCTTAGAGAGGCCTTGG-3’ Reverse

：

5’-AGAATTTCACGCCGCTTGTA-3’ ＜OsCPK10＞ Forward

：

5’-GGTGAGTTCATCGCTGCAA-3’ Reverse

：

5’-CAATCGAACCAATGACCCAA-3’ ＜OsCPK12＞ Forward

：

5’-TCGGAGTTCCTCACAGCTAT-3’ Reverse

：

5’-TGTCATTGACGCTTCAACTGA-3’ ＜OsCPK13＞ Forward

：

5’-AGAGGAACATCTTGTGGCAG-3’ Reverse

：

5’-TACGAGCTAGTTCACCGAAC-3’ ＜OsCPK19＞ Forward

：

5’-GCAGGATTAGCCAAACTTGG-3’ Reverse

：

5’-ATCACTACACCATACACGGG-3’ コ ロ ニ ーPCR 用 の プ ラ イ マ ー セ ッ ト ＜pENTR-D-TOPO＞ Forward

：

5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’ Reverse

：

5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’ ＜pANDA＞ ･GUS linker Forward

：

5’-CATGAAGATGCGGACTTACG-3’ Reverse

：

5’-ATCCACGCCGTATTCGG-3’ ･HPTⅡ Forward

：

5’-GAGCCTGACCTATTGCATCTCC-3’ Reverse

：

5’-CATGAAGATGCGGACTTACG-3’

2 ) O s C P K 1 2 過 剰 発 現 体 の コ ン ス ト ラ ク ト の 作 製

OsCPK12 と カ ル モ ジ ュ リ ン 様 ド メ イ ン を ト ラ ン ケ ー ト と し た OsCPK12CA の ORF 領 域 を 増 幅 す る た め に OsCPK12 (J075191E21) の イ ネ 完 全 長 cDNA ク ロ ー ン (独 立 行 政 法 人 農 業 生 物 資 源 研 究 所 か ら 分 与) を テ ン プ レ ー ト に 用 い て PCR 反 応 液 (PrimeSTAR buffer 4 µl、2 mM dNTPs 2 µl、PrimeSTAR Taq [Takara] 0.1 µl、滅 菌 水 13.1 µl、10 µM Primer F 0.4 µl、10 µM Primer R 0.4 µl、Total vol. 20 µl) を 調 製 し て 、98℃ 5 分 、 (98℃ _{30 秒、55℃ 15 秒、72℃ 2 分 30 秒)} ×30 サ イ ク ル 、 72℃ 5 分 の 条 件 で PCR を 行 い 、 目 的 の 断 片 が 増 幅 し て い る か を 確 認 し た 。 増 幅 し た PCR 産 物 を pENTR-D-TOPO cloning kit (Invitrogen) を 用 い て pENTR-D-TOPO vector へ ラ イ ゲ ー シ ョ ン し た 。上 記 の ラ イ ゲ ー シ ョ ン 反 応 液 3 µl を DH5αに 加 え て 、ハ ナ ハ ン 法 で 形 質 転 換 し た 後 、_{LB 寒 天 培 地 (カ ナ マ イ シ ン 終 濃 度 50 µg/ml) に} 塗 布 し 、37℃ で 一 晩 静 置 培 養 し た 。生 育 し て き た そ れ ぞ れ の コ ロ ニ ー が 導 入 し た プ ラ ス ミ ド を 保 持 し て い る か コ ロ ニ ーPCR で 確 認 し た 。確 認 出 来 た PCR 産 物 の 配 列 解 析 を 行 い 、 目 的 導 入 遺 伝 子 と 完 全 一 致 す る こ と を 確 認 し 、 エ ン ト リ ー ク ロ ー ン と し た 。 作 製 し た エ ン ト リ ー ク ロ ー ン (OsCPK12_sc/pENTR、OsCPK12CA_sc/pENTR) と デ ス テ ィ ネ ー シ ョ ン ベ ク タ ー (pMDC32) を 用 い て LR clonase 反 応 を 行 い 、そ の 反 応 液 を DH5αに 加 え 、ハ ナ ハ ン 法 で 形 質 転 換 後 、37℃ で 一 晩 培 養 し た 。 生 育 し て き た そ れ ぞ れ の コ ロ ニ ー が 導 入 し た プ ラ ス ミ ド を 保 持 し て い る か コ ロ ニ ーPCR で 確 認 し た 。目 的 断 片 の 増 幅 が 見 ら れ た コ ロ ニ ー を LB 液 体 培 地 (カ ナ マ イ シ ン 終 濃 度 50 µg/ml、 ハ イ グ ロ マ イ シ ン 終 濃 度 _{50 µg/ml) 3 ml で 37℃ 一 晩 振 盪 培 養 し 、 4℃ 、 4200×g、 5 分} 間 遠 心 分 離 し た 。 菌 体 を 回 収 後 、 QIAprep Spin Miniprep kit (QIAGEN) を 用 い て プ ラ ス ミ ド を 単 離 し た 。こ れ ら の プ ラ ス ミ ド の 配 列 を DNA シ ー ク エ ン サ ー で 解 析 し 、 目 的 導 入 遺 伝 子 と 完 全 一 致 す る 配 列 を 有 す る プ ラ ス ミ ド を 過 剰 発 現 体 作 製 用 の コ ン ス ト ラ ク ト と し た 。 こ の よ う に し て 作 製 し た コ ン ス ト ラ ク ト を OsCPK12_sc/pMDC32、 OsCPK12CA_sc/pMDC32 と 名 付 け た 。 使 用 し た プ ラ イ マ ー セ ッ ト 目 的 遺 伝 子 断 片 を 増 幅 す る た め の プ ラ イ マ ー セ ッ ト

＜OsCPK12＞ Forward

：

5’-CACCATGGGCAACTGCTTCACCAA-3’ Reverse

：

5’-TCAGGTTTGTATTCCTTTCCTCATCA-3’ ＜OsCPK12CA＞ Forward

：

5’-CACCATGGGCAACTGCTTCACCAA-3’ Reverse

：

5’-TCAGAGCCATCGATGTTCTAAGGCCT-3’ コ ロ ニ ーPCR 用 の プ ラ イ マ ー セ ッ ト ＜pENTR-D-TOPO＞ Forward

：

5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’ Reverse

：

5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’ ＜pMDC32＞ Forward

：

5’-ATTATCGAACCACTTTGTACAAGAAA-3’ Reverse

：

5’-GCCAAGCTATCAAACAAGTTTGTACA-3’ 5 . フ ラ ジ ェ リ ン の 精 製 LB 液 体 培 地 を 350 ml 分 注 し た 三 角 フ ラ ス コ 3 本 に 、 そ れ ぞ れ A. avenae の ス ト ッ ク 菌 株 を 接 種 し 、30℃ で 36 時 間 振 盪 培 養 し た 。培 養 後 、各 培 養 液 を 250 ml 遠 心 管 に 入 れ 、6,000×g、4℃ 、30 分 間 、himac CR 20G (HITACHI) を 用 い て 遠 心 分 離 し 、 培 地 を 取 り 除 い て 菌 体 を 回 収 し た 。菌 体 に 、氷 冷 25 mM TBS (137 mM NaCl、8.1 mM Na2HPO4、 2.68 mM KCl、 1.47 mM KH2PO4) を 遠 心 管 1 本 に つ き 50 ml ず つ 加 え 懸 濁 し 、 菌 体 を 洗 浄 し 、 再 度 上 記 の 条 件 で 遠 心 分 離 し た 。 得 ら れ た 菌 体 を 、遠 心 管 1 本 に つ き 氷 冷 TBS 10 ml で 懸 濁 し 、あ ら か じ め 冷 や し て お い た MX-X57-P フ ァ イ バ ー ミ キ サ ー (National) に 全 量 移 し た 。 1 分 間 の 切 断 処 理 後 、 5 分 間 の 氷 上 静 置 を 7 回 繰 り 返 す こ と に よ り 、 菌 体 か ら 鞭 毛 を 分 離 し た 。 菌 体 破 砕 液 を 50 ml チ ュ ー ブ 4 本 に 移 し 、 6,000×g、 4℃ で 30 分 間 TOMY MX300 を 用 い て 遠 心 分 離 し た 後 、 上 清 を 100 ml 遠 心 管 2 本 に 移 し 、16,000×g、4℃ で 60 分 間 、himac CR 20G を 用 い て 遠 心 分 離 し た 。得 ら れ た 上 清 を 超 遠 心 分 離 用 10 ml 遠 心 管 4 本 に 移 し 182,000×g、4℃ で 60 分 間 himac CP 70MX を 用 い て 超 遠 心 分 離 し た 。 沈 殿 物 を 氷 冷 滅 菌 水 で 洗 浄 し た 後 、 遠 心 管 1 本 に つ き 氷 冷 滅 菌 水 500 µl に 懸 濁 し 、20,000×g、4℃ で 20 分 間 TOMY MX300

で 遠 心 分 離 し 、 上 清 を フ ラ ジ ェ リ ン 画 分 と し て 回 収 し た 。 フ ラ ジ ェ リ ン 画 分 の タ ン パ ク 質 量 は Quick start Brad ford Dye Reagent (BIO-RAD) を 用 い て BSA で 作 製 し た 検 量 線 よ り 濃 度 を 算 出 し た 後 、 SDA-PAGE に よ り 純 度 を 確 認 し た 。 6 . 活 性 酸 素 の 定 量 1 ) G E N E L I G H T G L - 2 0 0 に よ る 測 定 24 穴 プ レ ー ト に 1 ml の R2S 培 地 を 入 れ 、継 代 4 日 目 の イ ネ 培 養 細 胞 を ろ 紙 上 で 水 分 を 除 き 、9.5∼ 10.5 mg を 量 り 取 っ た 。30℃ で 1.5 時 間 振 盪 培 養 し 、 阻 害 剤 _{(2 mM EGTA 、 1 mM Nifedipine 、 5 µM} Staurosporine、5 µM K252a、10 µM DPI [終 濃 度 ]) を そ れ ぞ れ 加 え 、 30 分 間 振 盪 培 養 後 、 さ ら に 非 親 和 性 N1141 菌 株 の フ ラ ジ ェ リ ン を 終 濃 度 200 nM に な る よ う に 処 理 し た 。 コ ン ト ロ ー ル と し て 純 水 を 等 量 加 え た も の を 用 い た 。 培 地 10 µl を 測 定 チ ュ ー ブ に 量 り 取 り 、 50 mM KH2PO4 (pH 7.9) 160 µl、 1.1 mM ル ミ ノ ー ル 10 µl、 14 mM K3 [Fe

(CN)6] 20 µl を 加 え Vortex 後 、 す ぐ に GENE LIGHT 55 (マ イ ク ロ テ

ッ ク・ニ チ オ ン) の RLU MODE で 10 秒 間 化 学 発 光 を 測 定 し た 。フ ラ ジ ェ リ ン を 加 え る 前 を 0 時 間 と し 、 フ ラ ジ ェ リ ン を 加 え て か ら 30 分 毎 に 3 時 間 ま で 測 定 し た 。 2 ) P H E L I O S に よ る 測 定 24 穴 プ レ ー ト に 1 ml の R2S 培 地 を 入 れ 、継 代 4 日 目 の イ ネ 培 養 細 胞 を ろ 紙 上 で 水 分 を 除 き 、9.5∼ 10.5 mg を 量 り 取 っ た 。30℃ 、2 時 間 振 盪 培 養 、非 親 和 性 N1141 菌 株 の フ ラ ジ ェ リ ン を 終 濃 度 200 nM に な る よ う に 処 理 し た 。 コ ン ト ロ ー ル と し て は 純 水 を 等 量 加 え た も の を 用 い た 。_{10 µl の 培 地 を PHELIOS (ATTO) 用 96 穴 プ レ ー ト に 量 り 取 り 、} そ こ に _{1.1 mM ル ミ ノ ー ル を 10 µl 加 え 、 こ の プ レ ー ト を PHELIOS} に セ ッ ト し 、50 mM KH2PO4 (pH 7.9) 160 µl と 14 mM K3 [Fe (CN)6] 20 µl の 混 合 溶 液 を 自 動 分 注 し 、 10 秒 間 化 学 発 光 を 測 定 し た 。 フ ラ ジ ェ リ ン を 加 え る 前 を 0 時 間 と し 、 フ ラ ジ ェ リ ン を 加 え て か ら 30 分 毎 に 3 時 間 ま で 測 定 し た 。 7 . パ ー テ ィ ク ル ボ ン バ ー ド メ ン ト 法 に よ る イ ネ 培 養 細 胞 の 形 質 転 換 継 代 4 日 目 の イ ネ 培 養 細 胞 (100 ml 容 三 角 フ ラ ス コ 1 本 分 ) を シ ャ

ー レ に 移 し て 培 地 の み を 除 去 し 、20 ml の R2O 液 体 培 地 (R2S 培 地 、 165mM Mannitol、165 mM Sorbitol、pH 5.6) を 加 え て 懸 濁 し た 。先 切 り チ ッ プ を 用 い て _{500 µl の 細 胞 懸 濁 液 を 取 り 、7 mm 径 の ろ 紙 の 中} 央 に 細 胞 が 重 な ら な い よ う に 広 げ た 。こ の ろ 紙 を R2O 寒 天 培 地 (R2O 培 地 、0.3% Ager) の プ レ ー ト 上 に 乗 せ 、30℃ 、3 時 間 、遮 光 し て 静 置 培 養 し た 。 次 に 、 分 注 し た 金 粒 子 50 µl に YC 3.6/pAHC17 プ ラ ス ミ ド _{(藤 原 博 士 よ り 供 与 ) 5 µg、2.5 M CaCl}2 50 µl、0.1 M Spermidine 20 µl を 加 え て 3 分 間 撹 拌 し た 。そ の 後 、10,000×g で 10 秒 間 遠 心 分 離 し て 上 清 を 除 去 し 、99.5%エ タ ノ ー ル (HPLC グ レ ー ド ) 250 µl を 加 え て 懸 濁 し た 。 同 条 件 で 再 度 遠 心 分 離 し 上 清 を 除 去 し た 。 上 清 を 除 去 後 、 99.5%エ タ ノ ー ル 50 µl を 加 え て 懸 濁 し た 。 Macro carrier を Macro carrier holder に セ ッ ト し 、 上 記 で 調 製 し た 溶 液 を よ く 懸 濁 し Macro carrier の 中 央 に 10 µl 分 注 し た 。 乾 燥 さ せ た 後 、 パ ー テ ィ ク ル ガ ン Biolistic PDS-1000/He (Bio-Rad) 内 に 、 1,100 psi の Rupture disk、 Stopping screen と 共 に セ ッ ト し 、 プ ラ ス ミ ド を 付 着 さ せ た 金 粒 子 を 減 圧 装 置 と ヘ リ ウ ム ガ ス の 圧 力 を 利 用 し て 、 イ ネ 培 養 細 胞 に 撃 ち 込 む こ と に よ り 目 的 遺 伝 子 を 導 入 し た 。 こ れ を 30℃ 、 遮 光 し て 16 時 間 静 置 し 、 イ ネ 培 養 細 胞 に YC3.6 を 発 現 さ せ た 。

8 . Y e l l o w c a m e l e o n 3 . 6 に よ る 細 胞 内 C a2 +_{動 態 の 解 析}

ご く 少 量 の YC 3.6 導 入 細 胞 を 24×40 mm の Micro cover glass (Matsunami) 上 に 移 し 、N1141 菌 株 、K1 菌 株 の 精 製 フ ラ ジ ェ リ ン 懸 濁 液 ( 終 濃 度 200nM) を 加 え て 18×24 mm の Micro cover glass (Matsunami) を 上 か ら 被 せ た 。カ バ ー ガ ラ ス の 上 か ら や さ し く 押 さ え て 細 胞 を 均 一 に し 、 ペ ー パ ー ボ ン ド で カ バ ー ガ ラ ス を 固 定 し 、 す ば や く 共 焦 点 レ ー ザ ー 顕 微 鏡 FV-1000 (Olympus) に よ る 測 定 を 開 始 し た 。 な お 、そ れ ぞ れ の フ ラ ジ ェ リ ン は 、急 な 浸 透 圧 変 化 の 影 響 を 除 く た め 、 R2S 培 地 に 懸 濁 し た も の 用 い た 。ま た 、測 定 中 は 常 に 焦 点 が ず れ な い よ う に 微 調 整 し 、蛍 光 強 度 が 擬 似 的 に 変 化 す る の を 防 い だ 。YC 3.6 の ス ペ ク ト ル は 、458 nm の 励 起 波 長 で 468 nm か ら 548 nm の 蛍 光 波 長 領 域 を 10 nm 間 隔 で 、 5 秒 間 隔 で 取 得 し た 。 得 ら れ た デ ー タ を CFP 像 と YFP 像 に ス プ リ ッ ト し 、 ECFP と EYFP の 蛍 光 強 度 の 値 を そ れ ぞ れ 得 た 。 こ の 値 か ら EYFP/ECFP の Ratio 値 を 算 出 し た 。

9 . イ ネ 培 養 細 胞 の リ ン 酸 化 タ ン パ ク 質 の 検 出

加 え 、30 分 間 振 盪 培 養 後 、A. avenae の N1141 菌 株 の フ ラ ジ ェ リ ン (終 濃 度 200 nM) を 加 え 、 経 時 的 に 培 養 細 胞 を 回 収 し た 。 回 収 し た 培 養 細 胞 に 液 体 窒 素 を 加 え 、 乳 棒 と 乳 鉢 を 用 い て パ ウ ダ ー 状 に な る ま で 磨 砕 し た 。予 め 4℃ に 冷 や し て お い た Extraction buffer (50 mM HEPES、 pH7.4、5 mM EDTA、5 mM EGTA、5mM DTT、10 mM NaF、10 mM Na3VO4、50 mM β-glycerophosphate 、 1 mM AEBSF 、 Protease

inhibitor cocktail for plant cell and tissue extracts [SIGMA]、 1% Triton-100X) 1 ml に 磨 砕 し た サ ン プ ル を 全 量 加 え 、懸 濁 後 、20,400×g、 4℃ で 40 分 間 TOMY MX300 を 用 い て 遠 心 分 離 し た 。遠 心 分 離 後 の 上 清 を Elution buffer (20 mM HEPES、pH7.4、1 mM MgCl2、1 mM NaF、

11 mM Na3VO4、5 mM β-glycerophosphate 、 Protease inhibitor

cocktail for plant cell and tissue extracts) で 平 衡 化 し た NAP-5 カ ラ ム (GE Healthcare) に 加 え 、そ の 後 Elution buffer 1 ml で 溶 出 し た 。 こ の 溶 出 画 分 を Pierce 660 nm Protein Assay Reagent (Thermo) を 用 い て タ ン パ ク 質 定 量 し 、 タ ン パ ク 質 10 µg に 、 等 量 の 2×Sample buffer (125 mM Tris-HCl、 pH 6.8、 4% SDS、 β-mercaptoethanol、 20% Glycerol、0.01% BPB) を 加 え た 。ラ ピ ダ ス ･ミ ニ ス ラ ブ 電 気 泳 動 槽 (ATTO) に 少 量 の 泳 動 バ ッ フ ァ ー (25 mM Tris、192 mM Glycine、 0.1%SDS) を 浸 し 、ミ ニ ス ラ ブ ゲ ル 作 製 キ ッ ト (ATTO) で 作 製 し た ゲ ル (10％ 分 離 ゲ ル : 10％ SDS 40 µl、1.5 M Tris-HCl、pH 8.8、2.25 ml、 30％ Acrylamide/Bis Solution 3 ml、超 純 水 3.75 ml、10％ APS 90 µl、 TEMED 5 µl、 濃 縮 ゲ ル : 10％ SDS 10 µl、 0.5 M Tris-HCl、 pH 6.8、 0.75 ml、30％ Acrylamide/Bis Solution 0.45 ml、超 純 水 1.8 ml、10％ APS 36 µl、TEMED 5 µl) を セ ッ ト し 、サ ン プ ル を ア プ ラ イ 後 、100 V 定 電 圧 で 2 時 間 SDS-PAGE を 行 っ た 。 泳 動 後 、 ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル の 濃 縮 ゲ ル を 取 り 除 き 、 転 写 バ ッ フ ァ ー (25mM Tris 、 192 mM Glycine、 0.05% [v/v] SDS、 20%Methanol) で 30 分 間 振 盪 し た 。 同 様 に 、 ゲ ル よ り 一 回 り 大 き く 切 っ た ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 (PROTRAN BA85 [Whatman]) 1 枚 、濾 紙 6 枚 も 別 の 転 写 バ ッ フ ァ ー に 浸 し て お い た 。セ ミ ド ラ イ ブ ロ ッ タ ー (TRANS-BROT SD CELL [Bio-Rad]) に 、 転 写 バ ッ フ ァ ー に 浸 し て お い た ゲ ル や 濾 紙 を 、下 か ら 濾 紙 3 枚 、ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 、 ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 、 濾 紙 3 枚 の 順 に 重 ね 、 セ ミ ド ラ イ ブ ロ ッ タ ー の 蓋 を 閉 め 、10 V 定 電 圧 で 2 時 間 転 写 を 行 っ た 。転 写 後 、TBST (20 mM Tris-HCl、 pH 8.0、 150 mM NaCl、 0.05% [v/v] Tween 20) に 移 し 、 5 分 間 振 盪 後 、 TBST を 捨 て 、 ブ ロ ッ キ ン グ バ ッ フ ァ ー (TBST 、 5%PhosphoBLOCKER Blocking Reagent [CELL

BIOLABS, INC.]) を 加 え 、1 時 間 振 盪 さ せ た 。ブ ロ ッ キ ン グ 後 、TBST で ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 を 5 分 間 5 回 洗 浄 し た 。洗 浄 後 、ブ ロ ッ キ ン グ バ ッ フ ァ ー で 抗 リ ン 酸 化 セ リ ン 抗 体 (abcam) を 1/2000 に 希 釈 し た 一 次 抗 体 溶 液 を 加 え 、1 時 間 振 盪 後 、4℃ で 一 晩 静 置 し た 。ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 を 5 分 間 5 回 洗 浄 後 、 ブ ロ ッ キ ン グ バ ッ フ ァ ー で IgG Mouse 抗 体 を 1/2000 に 希 釈 し た 二 次 抗 体 溶 液 を 加 え 、1 時 間 振 盪 し た 。ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 を TBST で 5 分 間 5 回 洗 浄 し た 。洗 浄 液 を よ く き っ た ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 に ECL-prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare) の A 液 と B 液 が 1： 1 に な る よ う に 加 え 、 遮 光 し て 5 分 間 静 置 後 、 ル ミ ノ ・ イ メ ー ジ ア ナ ラ イ ザ ー LAS-4000 (FUJI FILM) を 用 い て バ ン ド を 検 出 し た 。 す べ て の レ ー ン に タ ン パ ク 質 が 等 量 ア プ ラ イ 出 来 て い る か を 確 認 す る た め 、 同 様 の 条 件 で SDS-PAGE を 行 い 、そ の ゲ ル を CBB 染 色 液 (0.25%CBB-250R、50% Methanol 、 5%CH3COOH) に 浸 し 、 1 時 間 振 盪 後 、 脱 色 液 (25% Methanol、 10%CH3COOH) で 脱 色 し た 。 1 0 . R e a l t i m e R T - P C R 法 に よ る m R N A の 定 量 1 ) S Y B R g r e e n を 用 い た 定 量 A. avenae の K1 菌 株 、 N1141 菌 株 そ れ ぞ れ を イ ネ 培 養 細 胞 に 接 種 後 、 経 時 的 に 細 胞 を 回 収 し 、 こ れ ら イ ネ 培 養 細 胞 か ら RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) を 用 い て Total RNA を 抽 出 し た 。 各 目 的 遺 伝 子 の 発 現 確 認 の た め 、150 bp 程 度 の PCR 産 物 が 得 ら れ る よ う に プ ラ イ マ ー を 設 計 し 、QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit (QIAGEN) を 用 い て 反 応 液 (2×Quanti Tect SYBR Green PCR Master Mix 10 µl、 10 mM Primer F 0.6 µl、10 mM Primer R 0.6 µl、Total RNA 100 ng、 滅 菌 水 _{6.8 µl、Total vol. 20 µl) を 調 製 後 、ABI PRISM 7000 sequence} detection system (Applied Biosystems) に て 50℃ 30 分 、 95℃ 15 分 、 (94℃ 15 秒 、 55℃ 30 秒 、 72℃ 1 分 ) ×40 サ イ ク ル の 反 応 条 件 で Real time RT-PCR 反 応 を 行 っ た 。 反 応 終 了 後 、 得 ら れ た 増 幅 曲 線 デ ー タ よ り 、 指 数 関 数 的 増 幅 域 に 閾 値 を 設 定 し 、 閾 値 と 増 幅 曲 線 が 交 わ る 点 を Ct 値 と し て 算 出 し た 。 水 処 理 0 時 間 後 の サ ン プ ル よ り 得 ら れ た Ct 値 を コ ン ト ロ ー ル と し て 、ΔΔCt 法 に よ り 各 遺 伝 子 の 発 現 量 比 算 定 を 行 っ た 。な お 、蛍 光 検 出 方 法 に は イ ン タ ー カ レ ー タ ー 法 (SYBR Green) を 用 い 、 PCR 反 応 終 了 後 、 融 解 曲 線 分 析 を 行 う こ と で 正 し い 増 幅 が 行 わ れ て い る こ と を 確 認 し た 。 用 い た プ ラ イ マ ー は 以 下 に 記 述

す る 。 使 用 し た プ ラ イ マ ー セ ッ ト ＜OsCPK1＞ Forward

：

5’-GACAATGCACATGAACAGATTGGAG-3’ Reverse

：

5’-GTTGGGAGCAATCTCAGGGTT-3’ ＜OsCPK2＞ Forward

：

5’-AGCAAGCGCTGAGGGAGAAAGG-3’ Reverse

：

5’-CGTCCCGTCGCTTCTTGGGATT-3’ ＜OsCPK3＞ Forward

：

5’-TGGCAAGATTAGCTATGACGAA-3’ Reverse

：

5’-CACTCATTGACCAGTTTTACGG-3’ ＜OsCPK4＞ Forward

：

5’-GCATGCAGATAAAGTTTCGGT-3’ Reverse

：

5’-CAGGCAACTTTATTGCGATGA-3’ ＜OsCPK5＞ Forward

：

5’-AGAATTCATTGCTGCTACTCTG-3’ Reverse

：

5’-ACGTCATCGAGAAAAGCATC-3’ ＜OsCPK6＞ Forward

：

5’-TCAATTCACAACTCCGACTCAC-3’ Reverse

：

5’-GGTACCCACATATACAAATTGCTTC-3’ ＜OsCPK7＞ Forward

：

5’-CTATGGAGACAATAGCATGAG-3’ Reverse

：

5’-TAGAGTTACGCAAACATGAC-3’ ＜OsCPK8＞ Forward

：

5’-CACGCAATAGACTGGACAGAGA-3’ Reverse

：

5’-ATCGCTGCTGGTAAGCACAA-3’

＜OsCPK9＞ Forward

：

5’-TTGGGTTTTCCATTTCGTCCAA-3’ Reverse

：

5’-CCACCGTTACCACATAATTACACC-3’ ＜OsCPK10＞ Forward

：

5’-CTTGAGGATGTCTTGGGAAAC-3’ Reverse

：

5’-CTCTACGCCTGTACGTACAC-3’ ＜OsCPK11＞ Forward

：

5’-ATGAGCTTCAAAAGGCATGT-3’ Reverse

：

5’-CTATGCTGACCCATTTTACCC-3’ ＜OsCPK12＞ Forward

：

5’-GATTACTCGGAGTTCCTCACA-3’ Reverse

：

5’-TGTCTTTGTCAACTTCATCCAG-3’ ＜OsCPK13＞ Forward

：

5’-TTCCTGCCCAACGAACTCCT-3’ Reverse

：

5’-AGAGTTGAGCAATGGCGTACGA-3’ ＜OsCPK14＞ Forward

：

5’-ACCTCTACACCGCGTTCCAGT-3’ Reverse

：

5’-AGCGCTTGCTCGAGCTCTTC-3’ ＜OsCPK15＞ Forward

：

5’-TGGTTCCATCTTAGGGAAGTGAG-3’ Reverse

：

5’-AACATATGGCCAGAAAGCACAA-3’ ＜OsCPK16＞ Forward

：

5’-ACCCACTAAGCAGAGACCTT-3 Reverse

：

5’-CAACAAGCATGGGTACAGTGA-3’ ＜OsCPK17＞ Forward

：

5’-ACACAAGAAAGCCACGTACT-3’ Reverse

：

5’-GTCAAAGCTTCACCGTCTCA-3’

＜OsCPK18＞ Forward

：

5’-GCAAGCATGAGTTCACGCAA-3’ Reverse

：

5’-CTAGCTTCAGTCCTACATGTCCA-3’ ＜OsCPK19＞ Forward

：

5’-CCTATGAGGCTCAAATAGTCTG-3’ Reverse

：

5’-AGGACATTCAAATCACTACACC-3’ ＜OsCPK20＞ Forward

：

5’-AGCATTAGGTGATTGTTGGAAG-3’ Reverse

：

5’-CGTGTGTTGTAAGTTCAGTCTC-3’ ＜OsCPK21＞ Forward

：

5’-AGCAGGAGGCTCTGCAAGGATAC-3’ Reverse

：

5’-CGCATCGTGTTGCCACTCCAA-3’ ＜OsCPK22＞ Forward

：

5’-TCAGTTGCATAGATGACAAGGTTCA-3’ Reverse

：

5’-ACATTTGGTAAGTGGATTGCATGTC-3’ ＜OsCPK23＞ Forward

：

5’-CACCCCAAGTATACTGAACTC-3’ Reverse

：

5’-GCTATTAGGTACTAAGAGAGTCTTC-3’ ＜OsCPK24＞ Forward

：

5’-CGCTGAAGAATTTTCGTAGCAGT-3’ Reverse

：

5’-CCCCAACTATCAACAATGTTCAGTC-3’ ＜OsCPK25、 26＞ Forward

：

5’-GCACATGAACAAAATGGATCGAG-3’ Reverse

：

5’-AATCTATCCGCCCATCCTACA-3’ ＜OsCPK27＞ Forward

：

5’-GACATGATAGGCGAAGTAGATCAGG-3’ Reverse

：

5’-AAGGCATCCCTAAAACCGCTAA-3’

＜OsCPK28＞ Forward

：

5’-CTGCGAACAGTTTGGCCTTT-3’ Reverse

：

5’-CAAACTCGCTGTAATCAATTTGTCC-3’ ＜OsCPK29＞ Forward

：

5’-AGATGTCAAAGAGCAGGCTT-3’ Reverse

：

5’-AATATGAGATTCGGCCTACCTC-3’ ＜PAL＞ Forward

：

5’-GGCGAGGACTGCAACAAGGTGTT-3’ Reverse

：

5’-TGGGTGTATGGCAATGGCAATGA-3’ ※OsCPK25、OsCPK26 は ORF の 塩 基 配 列 が 99.6%一 致 し て お り 、特 異 的 な プ ラ イ マ ー の 設 計 が 出 来 な か っ た 。 ア ミ ノ 酸 配 列 で は 100%同 じ 配 列 で あ る の で 、2 つ の CPK は 同 じ も の と 考 え 、同 一 の プ ラ イ マ ー で mRNA を 定 量 し た 。 2 ) T a q M a n P r o b e を 用 い た m R N A の 定 量 N1141 菌 株 の フ ラ ジ ェ リ ン を 処 理 し た イ ネ 培 養 細 胞 や RNAi 形 質 転 換 培 養 細 胞 、 過 剰 発 現 培 養 細 胞 な ど か ら RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) を 用 い て Total RNA を 抽 出 し た 。プ ラ イ マ ー は Universal Probe Library (Roche) の ア ッ セ イ デ ザ イ ン セ ン タ ー で 目 的 遺 伝 子 を 特 異 的 に 増 幅 す る よ う に 設 計 し た も の を 用 い た 。Total RNA (100 ng) を テ ン プ レ ー ト と し 、Super script Ⅲ (Invitrogen) を 用 い て 逆 転 写 反 応 を 行 い 、cDNA を 合 成 し た 。こ の cDNA を テ ン プ レ ー ト と し 、Fast Start Universal Probe kit (Roche) を 用 い て 反 応 液 (Fast Start Universal Probe [Roche] 12.5 µl、25 mM 加 水 分 解 プ ロ ー ブ 0.25 µl、 10 mM Primer F 2.25 µl、 10 mM Primer R 2.25 µl、 cDNA 2 µl、 滅 菌 水 _{5.75 µl、Total vol. 25 µl) を 調 製 し 、ABI PRISM 7000 sequence} detection system (Applied Biosystems) に て 95℃ _{15 分、 (94℃ 15} 秒 、55℃ 30 秒 、 72℃ 1 分 ) ×40 サ イ ク ル の 反 応 条 件 で Real time RT-PCR 反 応 を 行 っ た 。な お 、PCR 反 応 終 了 後 、ア ガ ロ ー ス ゲ ル 電 気 泳 動 で 正 し い 増 幅 が 行 わ れ て い る こ と を 確 認 し た 。 用 い た 加 水 分 解 プ ロ ー ブ 、 プ ラ イ マ ー は 以 下 に 記 述 す る 。

使 用 し た 加 水 分 解 プ ロ ー ブ OsCPK7 : #118 OsCPK8 : #113 OsCPK10 : #92 OsCPK12 : #38 ま た は #113 OsCPK13 : #165 OsCPK19 : #165 EDS1 : #146 Act-1 : #9 RNAi 形 質 転 換 体 の 確 認 用 の プ ラ イ マ ー セ ッ ト ＜OsCPK7＞ Forward

：

5’-GGAAGCGGCACACAACG-3’ Reverse

：

5’-GCTCGTTGAAGCTTGTCAACT-3’ ＜OsCPK8＞ Forward

：

5’-ATATTTGTCAGTCAGGCGGC-3’ Reverse

：

5’-CCAAGTTTACGTATGCCAGCC-3’ ＜OsCPK12＞ Forward

：

5’-CAGAAGTGGCACAATCACGG-3’ Reverse

：

5’-GCTGCCACTCTTGTCTACGT-3’ ＜OsCPK19＞ Forward

：

5’-GTTCTCCAACATCCCTGGCT-3’ Reverse

：

5’-CGCTGTTGTCTGTGTCCATG-3’ 各 OsCPK 遺 伝 子 の 発 現 量 確 認 用 の プ ラ イ マ ー セ ッ ト ＜OsCPK7＞ Forward

：

5’-GGAGTTGCCACTGATCAAGC-3’ Reverse

：

5’-CCTCTGAAAGACGCTCAGCTA-3’

＜OsCPK8＞ Forward

：

5’-CTTTGCGGTGTACCACCAT-3’ Reverse

：

5’-CGTATAATTGCCTGCGCTACT-3’ ＜OsCPK10＞ Forward

：

5’-TTGACAGCTCATGAAGTTTTAAGG-3’ Reverse

：

5’-CGAGATAGAACAGCAGAATCCA-3’ ＜OsCPK12＞ Forward

：

5’-TTAGTGAAGCCGAGGTTCAGA-3’ Reverse

：

5’-TGCTGCCACTCTTGTCTACG-3’ ＜OsCPK13＞ Forward

：

5’-TCTCGCTCAAGGCCATAGAT-3’ Reverse

：

5’-CAACAACACTTCTGGAGCTACG-3’ ＜OsCPK16＞ Forward

：

5’-CCATCTTCTTCAAGCCTGGT-3’ Reverse

：

5’-CAGGTCCATAGTTTCTCTTCAGC-3 ＜OsCPK19＞ Forward

：

5’-TCTCGCTCAAGGCCATAGAT-3’ Reverse

：

5’-CAACAACACTTCTGGAGCTACG-3’ ＜OsEDS1＞ Forward

：

5’-CAGGGGTTCTTGAGGCTGT-3’ Reverse

：

5’-AACACTACTGCCTTGCCTCTG-3’ OsCPK12 過 剰 発 現 体 の 発 現 量 確 認 用 の プ ラ イ マ ー セ ッ ト ＜OsCPK12＞ Forward

：

5’-TTAGTGAAGCCGAGGTTCAGA-3’ Reverse

：

5’-TGCTGCCACTCTTGTCTACG-3’

＜OsCPK12CA＞

Forward

：

5’-TGGGGTGATATTGTATATCCTTCTATG-3’ Reverse

：

5’-AGCATCGAATATGCCTTTCTCT-3’

1 1 . 各 形 質 転 換 イ ネ の 作 製

1 ) ア グ ロ バ ク テ リ ウ ム の コ ン ピ テ ン ト セ ル 作 製

Agrobacterium tumefacience EHA105 株 を YEP 液 体 培 地 (1%Bacto Peptone、 1%Bacto Yeast extract、 85 mM NaCl) 100 ml に 植 菌 し 、28℃ で 振 盪 培 養 を 行 っ た 。 OD600が 0.6 付 近 に な っ た 時 点 で 培 養 を 終 了 し 、氷 冷 し た 50 ml チ ュ ー ブ 4 本 に 回 収 し た 。3,300×g、 4℃ 、 5 分 間 遠 心 分 離 を 行 い 、 上 清 を 除 去 し 、 ペ レ ッ ト に 10％ グ リ セ ロ ー ル を 2.5 ml ず つ 加 え た 。 穏 や か に 懸 濁 し た 後 、 1 本 に ま と め 、 3,300×g、 5 分 、 4℃ で 遠 心 分 離 を 行 い 、 上 清 を 除 去 し た 。 ペ レ ッ ト に 10％ グ リ セ ロ ー ル を 10 ml ず つ 加 え 、穏 や か に 懸 濁 し た 後 、3,300×g、 4℃ 、5 分 間 遠 心 分 離 を 行 い 、上 清 を 除 去 し た 。こ の 操 作 を さ ら に 繰 り 返 し た 後 、_{10％ グ リ セ ロ ー ル 500 µl に 懸 濁 し 、1.5ml チ ュ ー ブ に 50 µl} ず つ 分 注 し 、 液 体 窒 素 で 凍 結 さ せ-80℃ で 保 存 し た 。 2 ) ア グ ロ バ ク テ リ ウ ム へ の プ ラ ス ミ ド 導 入 A. tumefacience EHA105 株 の コ ン ピ テ ン ト セ ル 50 µl に プ ラ ス ミ ド を _{0.1 µg 加 え 、穏 や か に 攪 拌 し た 。こ れ を あ ら か じ め 冷 や し て お い た} 1 mm Pluser Cuvette (Bio-Rad) に 移 し 、 Gene Pulser Xcell (BIORAD) を 用 い て Voltage : 1.25 kV 、 Capacitance : 25 µF 、 Resistance (LOW RANGE) : 200 Ω 、 Cuvette で エ レ ク ト ロ ポ レ ー シ ョ ン を 行 っ た 。 エ レ ク ト ロ ポ レ ー シ ョ ン 後 、SOC 培 地 1 ml を キ ュ ベ ッ ト に 注 ぎ 懸 濁 し 、1.5 ml チ ュ ー ブ に 移 し た 。 30℃ 、 1.5 時 間 振 盪 培 養 を 行 っ た 後 、_{LB 寒 天 培 地 (カ ナ マ イ シ ン 終 濃 度 50 µg/ml、 ハ イ グ} ロ マ イ シ ン 終 濃 度 _{50 µg/ml) に 塗 布 し 、遮 光 下 30℃ で 2 日 間 静 置 し た 。} 生 育 し て き た コ ロ ニ ー に 各 プ ラ ス ミ ド が 導 入 さ れ て い る こ と を 確 認 し た 後 、_{LB 液 体 培 地 (カ ナ マ イ シ ン 終 濃 度 50 µg/ml、 ハ イ グ ロ マ イ シ} ン 終 濃 度 _{50 µg/ml) 30 ml で 28℃ 一 晩 振 盪 培 養 し 、 800×g、 4℃ 、 5 分} 間 遠 心 分 離 を 行 い 、菌 体 ペ レ ッ ト を 回 収 後 、HMFM (3.6 mM K2HPO4、

1.1 mM NaH2PO4・2H2O、 1 mM MgSO4・7H2O、 4.4%Glycerine、

2.2 mM Na-citrate) 5 ml に 懸 濁 し た 。 1.5 ml チ ュ ー ブ に 500 µl ず つ 分 注 し 、 液 体 窒 素 中 で 凍 結 さ せ 、-80℃ で 保 存 し 、 HMFM ス ト ッ ク 菌

体 保 存 液 と し た 。

3 ) イ ネ カ ル ス の 作 製

イ ネ (金 南 風 、Oriza sativa L. sp. japonica cv. kinmaze) 種 子 の 籾 殻 を 取 り 除 き 、50 ml チ ュ ー ブ へ 移 し 、 純 水 で 3 回 洗 浄 し た 。 次 に 、 70％ エ タ ノ ー ル に 浸 し 10 分 振 盪 し た 後 、1％ 次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム に 浸 し 、30 分 振 盪 し 種 子 表 面 の 殺 菌 を 行 っ た 。滅 菌 水 で 5 回 洗 浄 し た 後 、 胚 が 上 向 き に な る よ う に MS 寒 天 培 地 (MS 培 地 用 混 合 塩 類 [Wako] 1 pack、 2%Sucrose、 2 mg/l 2,4-Dichloro-Phenoxyacetic Acid、 1%KM Vitamin Solution [SIGMA]、 0.9%Agarose typeI [SIGMA]) に 留 置 し た 。30℃ 、連 続 光 下 で 1 週 間 静 置 培 養 し た 後 、新 し い MS 寒 天 培 地 に 留 置 し 、 さ ら に 2 週 間 同 条 件 で 静 置 培 養 し た 。 4 ) ア グ ロ バ ク テ リ ウ ム の イ ネ カ ル ス へ の 感 染 感 染 3 日 前 に MS 寒 天 培 地 上 の カ ル ス を 前 培 養 培 地 (MS 寒 天 培 地 、 10%イ ネ 培 養 細 胞 ) に 移 し 30℃ で 静 置 培 養 し た 。ま た プ ラ ス ミ ド を 導 入 し た ア グ ロ バ ク テ リ ウ ム HMFM ス ト ッ ク 菌 体 保 存 液 を AB 培 地 (17.2 mM K2HPO4、19.2 mM NaH2PO4・2H2O、 18.7 mM NH4Cl、

18.7mM MgSO4・7H2O、 2 mM KCl、 91 µM CaCl2・2H2O、 9 µM

FeSO4・7H2O) に 塗 布 し 、 遮 光 下 22℃ で 3 日 間 静 置 培 養 し た 。 感 染 当 日 、 前 培 養 培 地 上 の カ ル ス を 50 ml チ ュ ー ブ に 移 し た 。 ま た AB 培 地 で 生 育 し た ア グ ロ バ ク テ リ ウ ム を 一 部 掻 き 取 り 、 ア グ ロ バ ク テ リ ウ ム 感 染 液 体 培 地 に OD600 が 0.01 0.04 に な る よ う に 懸 濁 し た 。 こ れ を カ ル ス の 入 っ た 50 ml チ ュ ー ブ に 5~6 ml 加 え 軽 く 攪 拌 し 、 室 温 で 5 分 静 置 し た 。カ ル ス を 濾 紙 の 敷 い た シ ャ ー レ に 移 し 、培 地 を 取 り 除 い た 後 、 感 染 培 地 に 移 し 遮 光 下 、25℃ で 3 日 間 静 置 培 養 し た 。 5 ) 形 質 転 換 カ ル ス の 選 抜 感 染 か ら 3 日 後 の カ ル ス を 50 ml チ ュ ー ブ に 移 し 、 ク ラ フ ォ ラ ン (Wako) の 濃 度 が 250 µl/ml に な る よ う に 調 製 し た 滅 菌 水 で 数 回 洗 浄 を 行 っ た 。 カ ル ス を 濾 紙 に 敷 い た シ ャ ー レ に 移 し 、 滅 菌 水 を 取 り 除 い た 後 、 細 か く ほ ぐ し な が ら 一 次 選 抜 培 地 (MS 寒 天 培 地 、 ク ラ フ ォ ラ ン 終 濃 度 500 µg/ml、 ハ イ グ ロ マ イ シ ン 終 濃 度 50 µg/ml) に 移 し 、 連 続 光 下 、30℃ 、 3 週 間 静 置 培 養 し た 。 一 次 選 抜 培 地 上 で 生 育 し て き た カ ル ス を 二 次 選 抜 培 地 (39.6 mM KNO3、2.5mM (NH4)2SO4、1.0 mM

µM EDTA•2Na (DOJINDO) 、 19.8 µM FeSO4•7H2O 、 6.6 µM

MnSO4•4H2O、7.7 µM ZnSO4•4H2O、0.5 µM CuSO4•5H2O、48.5 µM

H3BO3、0.6 µM NaMoO4•2H2O、 1% [w/v] Murashige and Skoog

vitamin powder、 1.8 µM 2,4-dichlorophenoxyacetic acid、 87.6 mM Sucrose、165 mM Sorbitol、1%Agarose、pH 5.6) に 移 し 、連 続 光 下 、 30℃ 、 2 週 間 静 置 培 養 し た 。 2 週 間 後 、 新 し い 二 次 選 抜 培 地 に 移 し 、 連 続 光 下 、30℃ で 2 週 間 静 置 培 養 し た 。培 養 後 、生 育 し た 形 質 転 換 体 カ ル ス の 一 部 を 1.5 ml チ ュ ー ブ に 移 し 、液 体 窒 素 で 凍 結 し 、ペ ッ ス ル と 電 気 ド リ ル を 用 い て 破 砕 し た 。 破 砕 後 、DNA 抽 出 buffer (200 mM Tris-HCl、 pH7.5、 250 mM NaCl、 25 mM EDTA、 0.5%SDS) 50 µl を 加 え 、 上 清 _{1 µl を テ ン プ レ ー ト と し て コ ロ ニ ー PCR 行 い 、 遺 伝 子} が 導 入 さ れ て い る こ と を 確 認 し た 。