terminal region C-terminal region OsrbohB-Vn

/OsCPK12 D236N-Vc

OsrbohD-Vn /OsCPK12 D236N-Vc OsrbohA-Vn

/OsCPK12 D236N-Vc

Fig. 37 BiFC法を用いたOsrbohとOsCPK12DCA236Nのタンパク質間相互作用の解析

 各Vn融合タンパク質発現ベクター (

OsrbohDN-Vn/pBI221、OsrbohAC-Vn/pBI221、OsrbohBC-Vn/pBI221、 OsrbohDC-Vn/pBI221) とOsCPK12D236N-Vc/pBI221

をPEG法によりイネプロトプラストに導入 し、30℃、遮光下で静置培養した。導入後16時間の細胞を共焦点レーザー顕微鏡によ りBiFC蛍光を観察し、それぞれのOsrbohのN末端細胞内ドメイン、C末端細胞内ドメ インとOsCPK12との相互作用を確認した。B.F. : Bright field

111

2 - 4 考 察

本 章 で は ま ず 、OsCPK12 に よ る シ グ ナ ル 伝 達 機 構 の 全 容 を 明 ら か に す る た め に 、OsCPK12 の 基 質 と な る タ ン パ ク 質 の 同 定 を 行 っ た 。 タ ン パ ク 質 間 相 互 作 用 を 検 出 す る ハ イ ス ル ー プ ッ ト な ス ク リ ー ニ ン グ 系 は い く つ か 存 在 す る が 、 最 も 広 く 使 わ れ て い る ス ク リ ー ニ ン グ 系 は Yeast two-hybrid 法 で あ る 。Yeast two-hybrid 法 と は 、転 写 活 性 化 因 子 で あ る GAL4 タ ン パ ク 質 の Binding Domain (BD) と Activatig Domain (AD)が 分 離 可 能 で あ る こ と を 利 用 し た 方 法 で あ る 。BD 断 片 を bait タ ン パ ク 質 に 、AD 断 片 を Prey タ ン パ ク 質 に そ れ ぞ れ 融 合 し た も の を 酵 母 内 で 発 現 さ せ た 際 に 、Bait と Prey タ ン パ ク 質 が 相 互 作 用 す る と 、BD と AD が 近 接 す る こ と で AD が 転 写 開 始 領 域 に 近 接 し 、 レ ポ ー タ ー 遺 伝 子 の 転 写 が 活 性 化 さ れ る 。 し か し 、 こ の 方 法 に お け る タ ン パ ク 質 間 相 互 作 用 の 検 出 に は 、Bait と Prey タ ン パ ク 質 間 の 継 続 的 な 相 互 作 用 が 必 要 と な る た め 、 キ ナ ー ゼ や 基 質 な ど の よ う な 一 過 的 な 相 互 作 用 の 検 出 に は 適 さ な い と 考 え ら れ る 。 加 え て 、Yeast two-hybrid 法 は 自 律 活 性 が 問 題 と な る な ど の デ メ リ ッ ト が 存 在 す る 。 そ こ で 、 キ ナ ー ゼ と そ の 基 質 の よ う な 一 過 的 な 結 合 で も 検 出 で き る 新 た な 検 定 系 を 構 築 す る 必 要 が あ っ た 。 本 研 究 で 用 い た BiFC 法 と は 、 N 末 端 側 と C 末 端 側 に 分 断 さ れ 、蛍 光 を 失 っ た タ ン パ ク 質 断 片 が 会 合 す る こ と で 元 の 構 造 が 回 復 し 、 同 時 に 蛍 光 を 回 復 す る 性 質 を 利 用 し た 方 法 で あ る 。 再 構 築 さ れ た 蛍 光 タ ン パ ク 質 は 融 合 タ ン パ ク 質 同 士 の 相 互 作 用 が 失 わ れ て も 蛍 光 が 継 続 的 に 観 察 で き る と い う 特 徴 を 持 つ た め 、 キ ナ ー ゼ と 基 質 間 の よ う な 一 過 的 な 相 互 作 用 の 検 出 に 適 し て い る 。 さ ら に 、Yeast two-hybrid 法 で 問 題 と な る 自 律 活 性 が あ る 場 合 で も ス ク リ ー ニ ン グ を 行 う こ と が 出 来 る と い う 利 点 が あ る 。 そ こ で 、 大 腸 菌 Rosetta-gamiB と イ ネ プ ロ ト プ ラ ス ト を 用 い て 、BiFC 法 に よ る キ ナ ー ゼ と 基 質 間 の 特 異 的 な 相 互 作 用 を 検 出 す る こ と が で き る 新 規 の ス ク リ ー ニ ン グ 系 の 確 立 を 行 っ た 。 確 立 し た ス ク リ ー ニ ン グ 系 を 用 い て 、 OsCPK12 と 相 互 作 用 す る タ ン パ ク 質 の 探 索 を 行 っ た 結 果 、OsSYP13b と OsrbohA が 基 質 候 補 タ ン パ ク 質 と し て 同 定 さ れ た 。特 に 、OsrbohA は CPK の 基 質 と な る 可 能 性 が 報 告 さ れ て い る こ と か ら 、 今 回 新 た に 構 築 し た ス ク リ ー ニ ン グ 系 は 効 率 よ く キ ナ ー ゼ の 基 質 を 探 索 で き る 有 用 な 系 で あ る と 思 わ れ る 。

新 し く 構 築 し た BiFC 法 を ベ ー ス と し た 検 定 系 を 用 い て 、OsCPK12 と 相 互 作 用 す る タ ン パ ク 質 と し て 、OsSYP13b が 同 定 さ れ た (Fig.

20A)。 こ れ ま で に 、OsSYP13b と 同 様 に 細 胞 膜 シ ン タ キ シ ン で あ る SYP122 が flg22 処 理 3 分 間 で リ ン 酸 化 さ れ る 膜 タ ン パ ク 質 と し て 同 定 さ れ 、 実 際 に In vitro kinase assay で Ca²⁺依 存 的 に リ ン 酸 化 さ れ る こ と が 報 告 さ れ た(Nühse et al., 2003)。 さ ら に 、SYP122 の リ ン 酸 化 部 位 を 特 定 し た と こ ろ 、Ser-6 と Ser-8 で あ る こ と も 明 ら か と な っ た 。 こ の 二 つ の セ リ ン 残 基 は Syp1 フ ァ ミ リ ー 内 で 保 存 さ れ て い る 箇 所 で あ り 、OsSYP13b に も 保 存 さ れ て い た 。こ の こ と か ら OsSYP13b に お い て も 、 こ の 二 つ の セ リ ン 残 基 が リ ン 酸 化 さ れ て い る 可 能 性 は 高 い と 考 え ら れ る 。大 腸 菌 内 で OsCPK12 と 相 互 作 用 す る OsSYP13b タ ン パ ク 質 断 片 は N 末 端 領 域 で あ り 、こ の Ser-6 と Ser-8 も 含 ま れ て い た 。 こ の こ と か ら 、OsCPK12 が Ca²⁺に よ っ て 活 性 化 さ れ OsSYP13b タ ン パ ク 質 の Ser-6 と Ser-8 を 特 異 的 に リ ン 酸 化 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ る 。現 時 点 で は OsSYP13b が OsCPK12 に よ っ て 直 接 リ ン 酸 化 さ れ て い る か ど う か を 明 ら か に す る デ ー タ は 得 ら れ て い な い が 、 今 後 OsSYP13b タ ン パ ク 質 と OsCPK12 タ ン パ ク 質 を 精 製 し 、In vitro で OsSYP13の リ ン 酸 化 を 確 認 す る こ と でOsCPK12に よ っ てOsSYP13b が リ ン 酸 化 さ れ る か ど う か 、 ま た そ の リ ン 酸 化 部 位 に つ い て 明 ら か に な る で あ ろ う 。

本 研 究 に お い て 、大 腸 菌 で 発 現 さ せ た GST-OsCPK12CA-Flag タ ン パ ク 質 は 分 子 量 の 異 な る 二 つ の タ ン パ ク 質 と し て 精 製 さ れ た が 、 活 性 中 心 に 変 異 を 入 れ た GST-OsCPK12CAD215N-Flag と GST-OsCPK12CAD236N-Flag で は 一 本 の バ ン ド と し て 回 収 さ れ た (Fig. 32)。CPK の 一 部 が 自 己 リ ン 酸 化 さ れ る こ と で 、バ ン ド が シ フ ト す る こ と が 報 告 さ れ て い る (Kwon C et al., 2013)。 こ の こ と か ら 、 GST-OsCPK12CA-Flag は 、 一 部 が 自 己 リ ン 酸 化 さ れ て い る が 活 性 中 心 に 変 異 を 入 れ た GST-OsCPK12CAD215N-Flag 、 GST-OsCPK12CAD236N-Flag で は 自 己 リ ン 酸 化 活 性 が 失 わ れ て い る と 推 定 さ れ る 。 そ こ で 、OsCPK12 の 配 列 を 詳 細 に 解 析 し た と こ ろ 、 CPK の リ ン 酸 化 サ イ ト (B-X-X-S) が OsCPK12CA 中 に 3 箇 所 存 在 す る こ と が 示 さ れ た 。GST-OsCPK12CA-Flag タ ン パ ク 質 で 認 め ら れ た 二 つ の タ ン パ ク 質 間 に お け る 差 は 、 非 常 に 小 さ く 、1 kDa 以 下 で あ る と 推 定 さ れ る 。OsCPK12CA の 3 カ 所 の セ リ ン 残 基 が す べ て リ ン 酸 化 さ れ て い る と 考 え る と 、 こ の 差 は 合 理 的 に 説 明 出 来 る か も 知 れ な い 。 GST-OsCPK12CA-Flag が 本 当 に リ ン 酸 化 さ れ て い る の か ど う か を 明 ら か に す る た め に は 、 得 ら れ た リ コ ン ビ ナ ン ト タ ン パ ク 質 の 詳 細 な 分 子 量 を 質 量 分 析 計 で 調 べ る か 、 抗 セ リ ン リ ン 酸 化 抗 体 を 用 い た ウ エ ス

タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ な ど に よ る 実 験 が 必 要 と な る で あ ろ う 。

大 腸 菌 を 用 い た ス ク リ ー ニ ン グ に よ り OsCPK12 と 相 互 作 用 す る タ ン パ ク 質 と し て OsrbohA の N 末 端 細 胞 内 領 域 が 同 定 さ れ た (Fig.

20B)。し か し 、イ ネ プ ロ ト プ ラ ス ト 内 で の 相 互 作 用 解 析 を 行 っ た と こ ろ 、OsrbohAN だ け で な く 、比 較 対 照 と し て 用 い た OsrbohAC も 相 互 作 用 を 示 し た (Fig. 27)。Osrboh の N 末 端 領 域 は C 末 端 側 の FAD/NADPH 結 合 領 域 と 相 互 作 用 し て お り 、Ca²⁺の 結 合 に よ っ て 構 造 変 化 を 引 き 起 こ す こ と が 知 ら れ て い る (Oda et al., 2010)。 こ の こ と か ら 、OsCPK12 が OsrbohA の 全 長 と 相 互 作 用 す る 時 、OsCPK12 は OsrbohA の N 末 端 細 胞 内 ド メ イ ン と C 末 端 細 胞 内 ド メ イ ン と の 両 方 と 相 互 作 用 し て い る 可 能 性 が あ る と 思 わ れ る 。 序 論 で も 述 べ た が 、 OsCPK12 は N 末 端 に キ ナ ー ゼ ド メ イ ン を 、C 末 端 に 4 つ の EF hand モ チ ー フ を 含 む カ ル モ ジ ュ リ ン 様 ド メ イ ン を 有 し て い る (Fig. 12)。ま た 、こ の 実 験 で 用 い た OsCPK12CA は こ の カ ル モ ジ ュ リ ン 様 ド メ イ ン を 失 っ て い る 。こ の 様 な 状 況 を 考 え る と 、OsCPK12 が 全 て の Osrboh の N 末 端 細 胞 内 ド メ イ ン 、C 末 端 細 胞 内 ド メ イ ン と 相 互 作 用 し た こ と は 、OsCPK12 の カ ル モ ジ ュ リ ン 様 ド メ イ ン を 介 し た 結 合 な の か も 知 れ な い 。一 方 、OsCPK12CAの 結 合 は キ ナ ー ゼ ド メ イ ン を 介 し て お り 、 こ の 二 つ の 分 子 間 で 認 め ら れ た OsrbohA と の 相 互 作 用 は 、 全 く 性 質 が 異 な る も の だ と 思 わ れ る 。 特 に 、OsCPK12 が OsrbohA, B, D の 全 て と 相 互 作 用 す る が 、OsCPK12CA は OsrbohA の N 末 端 細 胞 内 ド メ イ ン と の み 相 互 作 用 す る と い う こ と か ら も 、 こ の 二 つ の 相 互 作 用 が 全 く 異 な る 様 式 で 起 き て い る と い う 考 え 方 を 支 持 す る 。C 末 端 細 胞 内 ド メ イ ン の FAD/NADPH 結 合 ド メ イ ン は 保 存 性 が 高 い こ と が 明 ら か と な っ て お り 、OsCPK12 の カ ル モ ジ ュ リ ン 様 ド メ イ ン を 介 し た 結 合 は 比 較 的 特 異 性 が 低 い の か も 知 れ な い 。 一 方 、 キ ナ ー ゼ ド メ イ ン を 介 し た OsrbohA の N 末 端 細 胞 内 ド メ イ ン と の 結 合 は 、 キ ナ ー ゼ 活 性 を 必 要 と す る こ と か ら 、 高 い 特 異 性 が 存 在 す る と 思 わ れ る 。 こ の 様 な 、 同 一 の 分 子 間 で 異 な る 相 互 作 用 様 式 が 存 在 す る こ と は 非 常 に 興 味 深 い 現 象 で あ る 。 こ の 様 な 異 な る 相 互 作 用 様 式 の 機 構 を 明 ら か に す る た め に は 、 カ ル モ ジ ュ リ ン 様 ド メ イ ン に 点 変 異 を 入 れ た OsCPK12 を 用 い た 相 互 作 用 解 析 が 有 効 で あ る と 思 わ れ る 。

OsCPK12は キ ナ ー ゼ 活 性 依 存 的 に OsrbohANと 相 互 作 用 し た (Fig.

35)。OsrbohA の CPK に よ る リ ン 酸 化 サ イ ト は 不 明 だ が 、ジ ャ ガ イ モ の StrbohA、Bに お い て は 2 カ 所 で あ る と 報 告 さ れ て い る (Kobayashi et al., 2007)。し か し 、今 回 OsCPK12CA と 相 互 作 用 し た OsrbohA の

N 末 端 細 胞 内 ド メ イ ン に は こ の 予 想 リ ン 酸 化 ア ミ ノ 酸 残 基 は 存 在 し て い な い 。 こ の こ と か ら OsCPK12CA に よ る OsrbohA と の 結 合 が リ ン 酸 化 と 関 係 し て い る な ら 、OsCPK12CA は StrbohA、B と は 異 な る ア ミ ノ 酸 残 基 を リ ン 酸 化 し て い る の で あ ろ う 。 現 時 点 で は OrbohA が OsCPK12 の 直 接 的 な 基 質 で あ る か ど う か は 確 定 し て い な い が 、 発 現 タ ン パ ク 質 な ど を 用 い て 実 際 の リ ン 酸 化 を 明 ら か に し た い 。

OsSYP13b と OsCPK12 と の BiFC 法 を 用 い た 相 互 作 用 で は 、 細 胞 膜 上 で ド ッ ト 状 の 蛍 光 と し て 観 察 さ れ た (Fig. 24)。こ れ ま で に 、い く つ か の シ ン タ キ シ ン は ゴ ル ジ 体 や エ ン ド ソ ー ム に 局 在 す る こ と が 確 認 さ れ て い る (Uemura et al., 2004)。こ の こ と か ら ド ッ ト 状 に 観 察 さ れ た BiFC 由 来 の 蛍 光 は 細 胞 膜 付 近 に 移 動 し た エ ン ド ソ ー ム に 由 来 す る か も 知 れ な い 。 事 実 、OsSYP13b は 分 泌 型 の SNARE で あ る た め 、 エ ン ド ソ ー ム に 取 り 込 ま れ て い る 可 能 性 が 高 い と 考 え る 。 今 後 、 こ の エ ン ド ソ ー ム 由 来 の OsSYP13b と OsCPK12と の 相 互 作 用 の 生 理 的 意 義 を 明 ら か に す る こ と で 、 植 物 免 疫 反 応 の メ カ ニ ズ ム 研 究 だ け で な く 、 細 胞 輸 送 の メ カ ニ ズ ム 研 究 に 対 し て も 新 規 の 知 見 を 与 え る こ と が 出 来 る か も 知 れ な い 。

参 考 文 献

Asai T, Tena G, Plotnikova J, Willmann MR, Chiu WL, Gomez-Gomez L, Boller T, Ausubel FM, Sheen J.

MAP kinase signalling cascade in Arabidopsis innate immunity.

Nature. 2002 Feb 28; 415 (6875) : 977-83.

Assaad FF, Qiu JL, Youngs H, Ehrhardt D, Zimmerli L, Kalde M, Wanner G, Peck SC, Edwards H, Ramonell K, Somerville CR, Thordal-Christensen H.

The PEN1 syntaxin defines a novel cellular compartment upon fungal attack and is required for the timely assembly of papillae.

Mol Biol Cell. 2004 Nov; 15 (11) : 5118-29.

Babior BM.

NADPH oxidase.

Curr Opin Immunol. 2004 Feb; 16 (1) : 42-7.

Bhat RA, Miklis M, Schmelzer E, Schulze-Lefert P, Panstruga R.

Recruitment and interaction dynamics of plant penetration resistance components in a plasma membrane microdomain. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Feb 22; 102 (8) : 3135-40.

Boudsocq M, Willmann MR, McCormack M, Lee H, Shan L, He P, Bush J, Cheng SH, Sheen J.

Differential innate immune signalling via Ca²⁺ sensor protein kinases. Nature. 2010 Mar 18; 464 (7287) : 418-22.

Böhlenius H, Mørch SM, Godfrey D, Nielsen ME, Thordal-Christensen H.

The multivesicular body-localized GTPase ARFA1b/1c is important for callose deposition and ROR2 syntaxin-dependent preinvasive basal defense in barley. Plant Cell. 2010 Nov; 22 (11) : 3831-44.

Bradley DJ, Kjellbom P, Lamb CJ.

Elicitor- and wound-induced oxidative cross-linking of a

proline-rich plant cell wall protein: a novel, rapid defense response.

Cell. 1992 Jul 10; 70 (1) : 21-30.

Che FS, Nakajima Y, Tanaka N, Iwano M, Yoshida T, Takayama S, Kadota I, Isogai A.

Flagellin from an incompatible strain of Pseudomonas avenae induces a resistance response in cultured rice cells.J Biol Chem.

2000 Oct 13; 275 (41) : 32347-56

Chen L, Shiotani K, Togashi T, Miki D, Aoyama M, Wong HL, Kawasaki T, Shimamoto K.

Analysis of the Rac/Rop small GTPase family in rice: expression, subcellular localization and role in disease resistance. Plant Cell Physiol. 2010 Apr; 51 (4) : 585-95.

Chinchilla D, Zipfel C, Robatzek S, Kemmerling B, Nürnberger T, Jones JD, Felix G, Boller T.

A flagellin-induced complex of the receptor FLS2 and BAK1 initiates plant defence. Nature. 2007 Jul 26; 448 (7152) : 497-500.

Collins NC, Thordal-Christensen H, Lipka V, Bau S, Kombrink E, Qiu JL, Hückelhoven R, Stein M, Freialdenhoven A, Somerville SC, Schulze-Lefert P.

SNARE-protein-mediated disease resistance at the plant cell wall.

Nature. 2003 Oct 30; 425 (6961) : 973-7.

Doke N, Miura Y, Sanchez LM, Park HJ, Noritake T, Yoshioka H, Kawakita K

The oxidative burst protects plants against pathogen attack:

mechanism and role as an emergency signal for plant bio-defence--a review. Gene. 1996 Nov 7; 179 (1) : 45-51

Dubiella U, Seybold H, Durian G, Komander E, Lassig R, Witte CP, Schulze WX, Romeis T.

Calcium-dependent protein kinase/NADPH oxidase activation circuit is required for rapid defense signal propagation. Proc Natl