アナンダミドおよびモノアラキドノイルグリセロｰルの定量法の検討とその生体内レベルに及ぼす食餌脂肪酸の効果

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(1)1998年度学位論文アナンダミドおよびモノアラキドノイルグリセロールの定置法の検討とその生体内レベルに及ぼす食餌脂肪酸の効果. 兵庫教育大学大学院学校教育研究科（修士課程）. 教科・領域教育専攻生活・健康系コース. 川島三和.

(2) 目次 1．序論 ……1 2．目的 ……11. 3．材料と方法 ……12 3．1．動物、飼料、使用機器、実験材料 ……一…・…一一・……12 3．1−1 供試動物 ……・・…………・…………・……・・……………12 3暉1一一2 飼料 ………一……・・……………・…・・………一…・…・12. 3儘1−3 使用機器 …………・・……・……一……一・……一…・・12 381−4 実験材料. ・…一…………・…………・……・・……………13. 3曹2．ラットの飼育 …………一…・…一…………・……………13. 3．3．ラットの堵殺と臓器の採取 …・…一………・…一…一13. 3．4．臓器からの脂質抽出（Bligh＆Dyer法） …………13 3．5．脂質の分離（薄層クロマトグラフィー） ………………15 3脚5一壌一次元展開 …………・…・…・………・・………・………15. 3、5−2 二次元展開. ……・…………層．’………………’……8…15. 3．6．脂肪酸エタノールアミドの分析 ………………………17 （高速液体クロマトグラフィー）. 3．6−1. 脂肪酸エタノールアミドの化学合成. ………………17. 3．6−2 3．6−3 3．6−4. 蛍光ラベル …・…・…………電…’・……………邑………18. アナンダミドおよびその類縁物質の分離、定量. …20. ラット腎臓および脳中のアナンダミドおよびその類縁物質の微量定量法. ……………・・…・……22. ・・・… 9師・… 門… 一・・・・… 24 3．7．モノアシルグリセロールの分析. （ガスクロマトグラフィー）.

(3) 3層7−4メチル化. …・…………・…………・…・…・……・…………. 3．7−2ラット腎臓および脳中のモノアシルグリセロールおよびその類縁物質の定量法. ・……・…………・……24. 3．8．ラット腎臓および脳中のリン脂質組成の分析. ……25. （ガスクロマトグラフィー）. 4．結果. ……26. 4．1．展開溶媒の検討. 4‘2臓溶出溶媒の検討. ……・…・………・・………・………・……26. 一……………・………一……・……33. 4．3．ラット腎臓および脳中のアナンダミドおよびその類縁物質の測定. …・・……………・………一・……・35. 4．4．ラット腎臓および脳中のモノアラキドノイルグリセロールおよびその類縁物質の測定 …・一…・41. 4．5．ラット腎臓および脳中のリン脂質組成の測定. 5．考察 6．要約 7．文献謝辞. 一・…. ・。・…. @ 55. @61. … 。・・62. ……47. Q4.

(4) 1．序論栄養学で問題にされる脂肪の質は、脂肪（トリグリセリド）に含まれる脂肪酸の質を示すと考えてよい。食物や生体内の脂肪酸は、大部分がエステル結合した形で、脂肪（トリグリセリド）、リン脂質などに含まれているが、脂肪酸には多くの種類があり、炭素の数、二重結合の数および位置によりそれぞれ固有の名称がつけられている。このような脂肪酸分子において、栄養学的な質を決める最も重要な要素は、二重結合の数および位置であり、特に二重結合を. 2っ以上含む多価不飽和脂肪酸は、現代の栄養学で最も注目されている脂肪酸である。. 多価不飽和脂肪酸はn−3系列、n−6系列、 n−9系列の3つのグループに分け. て考えられ、このうち特に重要なものが、n−3およびか6脂肪酸である（図1−. 1，2）。n−3系列とは、メチル基から3番冒に、またn−6系列は6番目に二重結合を有する脂肪酸群を指している。これらはヒト体内では合成することができないため、食物成分として摂取しなければならない栄養学的必須脂肪酸である。さらに、この2つのグループに属する脂肪酸は、体内で代謝を受けても決して相互交換することがないため、それぞれのグループの脂肪酸は異なった働きをすると考えられてきた。を⑤系窮. 1＆2−1a3一リノール酸. ｣一［20：4］一2a4一匝ト2塗5一国. ジホモーγ一. リノレン酸. アラキ. ドコサペンタ. ドン酸. エン酸（DPA）. ・十3系魂. 壌＆3−1a4−2α4一 ?鼾争?な5−2生6一回 α一リノレン酸. エイコサペ. ンタエン酸. ド謙サヘキサ. エン酸（DHA）. （EPA）図1−1：必須脂肪酸の代謝経路（脂肪酸は炭素数：二重結合の数で示した。）. 一1．.

(5) 飽和脂肪酸sa七urated鉛t七y. aciδ（S）. CH3｛CH2，咽2COOH. COOH. ミリスチン酸（14：0）. H3C C塚CH2｝¶4COO”. COOH. パルミチン酸（16：0）. H3C C｝㌔｛CH：訪16COOH. COOH. ステアリン酸（18：0）. h3C. 一価不飽和脂肪酸Inonounsaturated 魚tty. acid（M）. CH3⊂CH2》7CH＝＝CH｛CH2｝7COOH. H3C. オレイン酸（18：1）. COO赫. 多価不飽和脂肪酸polyunsaturated. 鉛tty acid（P）. 氏D6系 CH3｛CH2｝4CH＝＝CHCH2CH＝＝CH｛CH2｝7C◎OH 一. COOH. 一. リノーノレ酸（18 ：2）. H3C CH3⊂CH2｝4｛CH駆CHCH2》3｛CH2｝3COOH ｝. 一. 一. H3C. COOH. γ一リノレン酸（18：3）. CH3｛CH2，4｛CH＝CHCH2，4｛CH2》2COOH 一. 一. 一. COOH. 一. H3C. アラキドン酸（20：4）. n．3系 bH3CH2C捌諾CHCH2CH講CHCH2CH篇CH｛CH2｝7COOH COOH H3 一一一 CH3CH21CH＝CHCH2D5｛CH2D2COOH g3. α一リノレン酸（18：3）. COOH エイコサペンタエン酸（EPA）（20：5）. CH3C｝唖2｛CH躍CHCN2》6CH2COOH. H3. 一. 一. 一. 一. 一. 一. COOH ドコサヘキサエン酸（DHA）（22：6）. 図1−2＝主な脂肪酸の分子構造4）. 一2一.

(6) ヒト体内では、神経系を除きリノール酸（18：2）およびアラキドン酸（20：4）などのn−6脂肪酸が圧倒的に多く存在する。またこれらのn−6脂肪酸はトリグリセリドよりもむしろリン脂質に多く含まれ、特にアラキドン酸ではこの傾向が顕著である。なおアラキドン酸は、植物油には存在せず、動物の脂質、特にリン脂質に多く含まれているが、食物としての摂取量は少ないと. 考えられている。一方、ほとんどの植物油にはリノール酸が含まれ、中でも識一ン油、ベニバナ油は特に多量のリノール酸を含むことが知られており、食物としてのn−6脂肪酸の供給の多くは、これらの植物油からのりノール酸の摂取により行なわれていると考えられる。また、n−3脂肪酸は体内ではドコサヘキサエン酸の形で神経系のリン脂質に多く含まれているが、その他のn−3脂肪酸は、海産物等を多量に摂取した場合を除きほんのわずかしか見られない。食品としてのn−3脂肪酸は、α一リノレン酸が菜種油、大豆油などの植物油（トリ. グリセリド）に、またエイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸が魚介類のトリグリセリド、リン脂質に多く含まれ、n弓脂肪酸の供給はこれらの食品の摂取によって行われている。. このようにn−3脂肪酸とn絡脂肪酸は、体内分布、代謝形態、含有する食：品が大きく異なる脂肪酸であるが、その生理的な役割が解明されている脂肪酸はn−6脂肪酸である。それに対し、n−3脂肪酸の生体内での働きが広く注目されたのは比較的最近のことであり、未だ不明な点も多く残されている。. 生体内におけるリン脂質の機能5）. ヒトの細胞は約60∼100兆個から成ると言われている。個々の細胞は細胞内と細胞外部環境を細胞膜で隔離しており、小胞体、ミトコンドリアなど細胞内小器官もまた、生体膜によって細胞質との境界を形成している。これら生体膜は、脂質二重膜とタンパク質によって構築されており、植物組織を除くほとんどの生物種において脂質二重膜の主成分はリン脂質（P：し）である。リン. 脂質とは、リン酸基を含む脂質の総称であるが、リン脂質の多くはグリセロールを基本骨格として含むグリセロリン脂質に分類される。グリセロリン脂質は、. ．3．.

(7) 図1・3のような構造をとり、グリセロールの3位の位置にリン酸を介してコリン、エタノールアミン、イノシトールなど様々なアル3一ル成分が、また1位と. 2位には脂肪酸が結合している。脂肪酸. としては1位に飽和脂肪酸を、また2位に不飽和脂肪酸をもつ形が多く、一般的. ？ ♀H27一。一C噛R｛. R2糟C脚O−C−H. l 曾. H・C騨0†0騨X o. にリン脂質は、トリグリセリドなどより. 図1−3＝グリセロリン脂質表1−1：リン脂質のリン酸結合部分（一X）. X. 別. 名一. 名（略号）. ボスファチジル灘リン. レシチン（PC）. 脚CH2CH2NH2. ボスファチジル. ケファリン（PE）. etha，n（）1alrLine. エタノールアミン. 一CH2CH−NH2 1. ホスファチジルセリン. 鴨CH2CH2N｛CH3｝3. chorine. COOH. （PS）. serine モノホスホイノシチド（PI）. in．ositol. 不飽和脂肪酸を含む割合が高いことが知られている。このようなリン脂質の脂肪酸は、リン脂質自体の疎水性部分の構成要素として生体膜の隔壁としての作用を主に担うほか、膜の流動性を調節し、また生体膜中のタンパクが機能を発揮するための微細環境を提供するなど、様々な機能を果たしている。さらにリン脂質の脂肪酸は、細胞外刺激に応じてボスホリパーゼの作用で切り出され、自体が生理作用を果たしたり、また様々な生理活性物質の前駆体となる。切り. 出された脂肪酸のうちでも特にアラキドン酸からは、プロスタグランジン、ロ. 卿4口.

(8) イコトリエンなどエイコサノイドと総称される強力な生理作用を持つ種々の生理活性物質が産出され、多彩な細胞機能の発現に関与しでいる。さらに特定の化学構造をもつリン脂質は、それ自体あるいはその代謝成分が、細胞内情報伝達や膜タンパク質の酵素活性調節などの作用をもつ。また血漿リポタンパク質、. 胆汁、肺サーファクタント（肺胞表面の潤滑性を維持する成分）などの構成成分としてもリン脂質は機能している。最近では高脂血症、動脈硬化症との関連. で関心が高いリポタンパク質分泌にボスファチジルほリン（PC）生成物が強く関わっていることも示唆されている。このようにリン脂質は種々の生命活動に必須な生体成分であり、その機能の重要性と多様性は脂質成分の中では群を抜いているといえる。. 食事中のリン脂質5）. 前記のように生体の中におけるリン脂質の重要性は広く認められているのに. 対し、食品成分としてのリン脂質は、トリグリセリド（TG）、コレステロールなどの他の脂質成分に比べるとほとんど顧みられていないといってもよい。生物はリン脂質を必要量にみあって生合成できるとみなされていること、トリ. グリセリドや諏レステロール摂取が直接、肥満、高脂血症、動脈硬化症などの成人病（生活習慣病）と関連しているのに対して、リン脂質摂取と病態との関連はほとんど報告されていないことが栄養学的な関心を引かない理由であり、. また人間が摂取する食品脂質の大部分がトリグリセリドであると考えられてい. ることも理由の一つであろう。我々は、食物性脂質を1β当たり約60g摂取しているとされるが、その内、リン脂質として摂取されるものは5％（約3g ／日）程度であると推定されてはいる。しかし実際にどの程度のリン脂質を摂取しているかその正確な量は明らかではない。リン脂質を多く含む食晶としては、まず鶏卵（卵黄）があげられ、そのほか肝臓などの内臓成分、魚介類、大. 豆などは、ホスファチジル諏リン（PC）のほかホスファチジルエタノールア. ミン（PE）、ボスファチジルイノシトール（PI）などのリン脂質を多く含む。またリン脂質は乳化剤としての性質を持つため、様々な菓子類などに添加. 一5一.

(9) されることもある。このように、リン脂質の摂取量はトリグリセリドと比べた. 場合には僅かであるともいえる反面、決して無視できない量のリン脂質が食品として摂取されていることも事実であり、食生活の形態によっては、トリグリセリドと同等な量を摂取している場合もあると考えられる。. アラキドンとDHAの存在状態3）. 脳の多価不飽和脂肪酸としては主にアラキドン酸とDHAがある。食餌の簑一6対n−3のバランスが変化すると、このアラキドン酸とDHAの脳内のレベルが影響を受け、n−3欠乏の状態ではアラキドン酸が少し増加し、またDH：A が部分的にドコサペンタエン酸に置き換わることが報告されている。. アラキドン酸もDHAも脳の中では、細胞膜を構成しているリン脂質にエステル結合した状態でほとんどが存在している（図1・4）。アラキドン酸は、その一部がホスホリパーゼA2などの酵素により遊離型に切り出されて存在し、この遊離アラキドン酸はさらに、シクロオキシゲナーゼの作用で生理活性を有するプロスタグランジンなどのエイコサノイドへと、また、アナンダミドとい. エステル結合型. 遊離型. 代謝物プロスタグランディン. アナンダミド. （PAF）. FA. DHA. DHA. hコサノイド？. P−Y 図1−4：脳におけるアラキドン酸（AA）とドコサヘキサエン酸（DHA）の存在状態 FA；脂肪酸、 PAF；血小板活性化因子. ．6一.

(10) つた別の生理活性物質へと変換される。これに対して、アラキドン酸の場合に. 対応するような生理活性を持ったDH：A誘導体（ドコサノイド）の存在については、これまでのところ脳では否定的である。すなわち、脳機能への関わり方として、アラキドン酸の場合は遊離型やその代謝物が直接の担い手であり、D HAではむしろリン脂質に結合した状態が重要ではないかと考えられている。最近、生理活性を有する薪しいタイプのアラキドン酸関連物質として、アナ. ンダミド（anandamide，別名N一アラキドノイルエタノールアミン，N・ arachidonoylethanolamin，e）の他に2一アラキドノイルグリセロール（2− arachidnoylglyceroD力瀬告された。これらはカンナビノイド（cannabinoid）受容体に対する結合活性を有しており、様々なカンナビノイド様作用を示すことが明らかにされている。. △9−THCは外来性の、アナンダミドと2一アラキドノイルグリ二一ールは内在性のカンナビノイドのリガンドと考えられている。. 9一瓢一CH、一CH、一◎H. CH3 ＼ミ：. OH. H，c l’ミ H3C. アナンダミド（N一アラキドノイルエタノールアミン）. ◎ ノグ. ♀ ♀HブOH. ム9−THC. 一. 一. C−O麟亨H. CHゴOH 2一アラキドノイルグリセロール. 図1−5＝△9−THC、アナンダミド、および2一一アラキドノイルグリ. セロールの構造. 鱈7脚.

(11) △9−THC △9一テトラヒドロカンナビノール）2）マリファナを摂取すると、時間的・空間的感覚が混乱し、多幸感や離人感を覚えたり、幻覚を見たりするなど、中枢神経系に大きな影響がみられることはよく知られている。マリファナの摂取はこのほかにも、ヒトでは頻脈、結膜の充血、記憶の障害、眼圧低下、気管支拡張など様々な反応を引き起こすことが. 知られている。マリファナのもっこのような作用は、△9一テトラヒドロカンナビノール（△9−tetrahydr◎cannabino1；△9−THC、図1・5）を中心とす. る一連の化合物（カンナビノイドと総称される）によることが1960年代に明らかにされた。. △9−TH：Cは、実験動物ではカタレプシー（無理な姿勢をとらされてもそのままの姿勢でいること）、自発運動量の低下、体温低下、鎮痛、徐脈、免疫. 抑制などを引き起こすことがわかっている。△9−THCの作用機序は長い間不明であったが、受容体が存在することが、1988年に放射性リガンドを用いた実験によって証明され、その作用の多くは受容体を介すると考えられるようになった。このことから、同一のカンナビノイド受容体に結合するアナンダミドの作用が注目されている。. アナンダミド2）. 1992年末になって、アラキドン酸誘導体の一種であるアナンダミドが、 Dev鋤eらによってブタの脳から単離された。アナンダミド（anandamide）という名称はサンスクリット語で至福を表す書葉“ananda”にちなんだものである。. アナンダミドはアラキドン酸にエタノールアミンがアミド結合した単純なもので、これもアラキドン酸由来の代謝物の一つである。生理作用としては、痛覚鈍麻、自発運動の低下、カタレプシーの誘発、体温低下といった作用があり、抗炎症作用もいわれている。. 一8一.

(12) o. ボスファチジン酸. 柵. R唾一。嗣。一 uFH2. 曾早. 曾. 曾￥一N−CHゴCHゼ◎H. CH−O−C−R2 1 1；. C鞘N騨CHブCHゴO†0顧CH2 σ. o. ボスホジエステラーゼ. 〈アナンダミド〉. 〈N一アラキドノイルPE＞ノ. 、. ノ. ノ. 曳アミドヒド滋ダーゼ ♪. 、、、. トランスアシラーゼ. ノメ. ’. 曾. 曾 R1『c−o卿苧2c 曾亨H℃脚曾噸段2 NHゴCHゴCHゴ0一 ?黶Z一H2c O. O。. 十リン脂質の1位に結合したアラキドン酸. 〈アラキドン酸〉. 十睡0廟CH2−CHゴN擁2. 〈ボスファチジルエタノールアミン〉. 〈エタノールアミン〉. 図卜6：アナンダミドの生合成機構と分解機構. アナンダミドの生合成ルートとしては、現在までのところ2っの可能性が考えられている（図1・6）。1つは遊離のアラキドン酸とエタノールアミンが酵素的に縮合してできるルートであり、もう1つのルートは、リン脂質の1位に. 結合しているアラキドン酸が、ボスファチジルエタノールアミン（phosphatidylethanolalnine；PE）のアミノ基（一NH2）に転移して、いったんN一アラキドノイルPEが生成し、これがさらにホスホジエステラーゼの作用によって分解を受け、アナンダミドとホスファチジン酸が生成するというものである。. 2一アラキドノイルグリセロール2）. 1995年にイヌの小腸から、新たな類似作用物質として2一アラキドノイ一9一.

(13) ルグリセ叡山ル〈グリセロールの2位にアラキドン酸の結合したモノグリセリド）が単離同定された（図1・5）。. ㍗ρ 璽＿、∴一… ロ. その他のグリセロ脂質一レDG コ. コ. l 2一アシル型のリゾリン脂質 1 ロ. 一＼2÷淵ノE5… 凹砲r≒タii蛸. アラキドン酸＋グリセロール 2一アラキドノイルグリセロリン酸. 図1−7＝2一アラキドノイルグリセロールの生合成機構と分解・代謝機構. 動物細胞でアラキドン酸は、通常、リン脂質のグリセロール骨格の2位に結合していることから容易に想像できるように、2一アラキドノイルグリセロールは、主としてアラキドン酸含有のリン脂質が分解を受けたときに生成される。. 生成ルートとしては、ボスホリパーゼC（PLC）などの作用によってボスファチジルイノシトール（phosphatidylinosito1；：PI）などのリン脂質から生じ. たアラキドン酸含有のジアシルグリセロール（diacylglycero1；DG）がDGリ. パーゼ（DGL）の作用で分解を受けて2一アラキドノイルグリセロールを生成するルートや、ボスホリパーゼA、（P：LA、）の作用によってアラキドン酸. 含有のリン脂質から生じた2一アシル基のリゾリン脂質が、さらにPLCで分解を受けて2一アラキドノイルグリセロールを生成するルートなどがある。一方、2一アラキドノイルグリセロールの分解・代謝ルートとしては、モノアシ. ルグリセロール（monoacylglycero1；MG）リパーゼによって遊離アラキドン. 酸とグリセロールに分解されるルートや、MGキナーゼ（MGK）の作用によってリン酸化され、リゾボスファチジン酸（1ysophospha泳hc acid；LPA）の一種、2一アラキドノイルグリセロリン酸に変換されるルートなどがある。. 一10・.

(14) 2．目的アナンダミドは、アラキドン酸とエタノールアミンが結合した脂肪酸エタノールアミドの一種であり、マリファナの有効成分であるカンナピノールの受容体に結合し、カンナピノールと同じ作用を示す生体内物質、すなわちカンナ. ビノイド受容体に対する生体内リガンドとして、1992年に発見された。しかし、そのアナンダミドが動物細胞中にどれだけ存在するか、また実際に生体内でどのような役割を果たすかは今もって不明である。. また最近になって、カンナビノイド受容体に対する第二の生体内リガンドとして、モノアラキドノイルグリセロールが同定され、体内ではむしろアナンダミドより主要な役割を果たしている可能性も指摘されている。. 本研究は、カンナビノイド受容体に対して生体内リガンドが、生体内にどの程度存在し、これが食餌により変化するか否かを知ることを目的として、まず、. 高速液体クロマトグラフィーおよびガスクロマトグラフィーを用い、アナンダミドおよびモノアラキドノイルグリセロールを、同じサンプルから分離定量す. 〔亟〕一脂質抽出一. 薄層クロマトグラフィー（TLC）. 十. ㊥脂肪酸エタノールアミド. モノアシルグリセロール. ▽砧冒. ▼. 脂肪酸のメチル化. 蛍光ラベル. ◆. 〆. ガスクロマトグララィー. 高速液体クロマトグラフィー. （GLC）. （HPLC） ▼. ▼. アントロイル化. アラキドン酸メチルエステルの定量. アラキドノイルエタノールアミドの定量. 図2−1＝組織中のアナンダミドおよびモノアラキドノイルグリセロールの. 定■ 一11一.

(15) る方法を検討した。. さらに、この定量法を用い、実際に2週間、脂肪酸組成の異なる飼料を与えた時のアナンダミドおよびモノアラキドノイルグリセロールの量的変化を調べた。. 3．材料と方法 3．1．動物、飼料、使用機器、論敵材料. 3．1−1供試動物ラット6匹×4群. 3．1−2飼料 A群……ラード10％. B群……DHA−PL10％ C群i……DHA−TG10％ D群……リノール酸一TG10％. 3．1−3使用機器・ガスクロマトグラフィーGAS CROMATOG：RA：PH GC・14A；. SHIMADZU製・カラムOm．egawaxTM 250 Fused Silica Capillary Column；. （30m×25mm，0．25μm） SUPELCO製. ・ポンプCHROMATOPAC C・R4A；SH：IMADZU製・遠心分離機Himac CT・6D；H：ITACHI製. ・撹搾・器VORTEX−GENIE2 ・スターラーHERACL：ES・20G； K：OIK＝E PRECISIO：N INSTRUM：E：NTS製. ・：PA：N UV：LANP：PUV・1；TOKYO KOGAKU KIKAI製. ・COLUMN OVEN CTO・10AS vp；SH：IMADZU製一12一.

(16) ・高速液体クロマトグラフィーLIQUID cHROMATOGRAPH：Lc・6A；. SHIMADZU製・蛍光検出器Scanning：Fluorescence De七ector Wiaters474；. Wate■s製. ・ポンプCHROMATOPAC C−R5A；SH：IMADZU製・カラムABZ十Plu．s H：PLC Column（25cm x 4．6mm，5μm）；. SUPELCO製. 。超低温フリーザーMDF−192；三洋電機製. ・小型超純水装置；MILLI−QLabo，日本ミリポア製（HPLC−CL試薬調整に使用）. 3．1−4実験材料・薄層クロマトグラフィー；MERC：K社製・脂質スタンダード圏 i純度99％）；シグマ社製. ・有機溶媒（特級〉；和光純薬製. 3．2．ラットの飼育 2週間、脂肪酸組成を変えた食餌（3．1−2）を与えた。. 3。3．ラットの六七と臓器の採取ラットはエーテル麻酔下で開腹し、臓器を濾紙上に採取し、秤量後、凍結保存した。. 3．4．臓器からの脂質抽出（Bligh＆Dyer法）臓器中のアナンダミド、モノアラキドノイルグリセロールは量的に少なく、また不安定であると予想されたため、臓器を凍結乾燥した。. 凍結乾燥した臓器をメスで出来る限り細かく切る。水L6mlを加え撹搾し、メタノール4m1、クロロホルム2m1の順に加え、クロロホルム：メタノール：. ．13一.

(17) 水＝1；2：0．8となるようにして一晩冷蔵保存した。このとき、内部標準. 物質として、乾燥臓器100mgにっき17：0エタノールアミドまたは20： 1エタノールアミドを1μgと17：0モノグリセリドを50μg加えた。一日放置したら、ホモジナイズし、クロロホルム：メタノール：水二1：2：. 0．8を3．8m1とクロロホルム3m1と生理食塩水3m1で洗い込み、撹搾した。それを遠心分離機に1500rpmで5分かけ、二層に分離させた。二層に分離したら、その下層部分をパスツールピペットで抽出し、遠心用チュー. ブに保存した。残りをクロロホルム61nl×2回で同様にして抽出し、同じ遠. 心用チューブに保存した。そのチューーブを遠心分離機に1500rpmで3分かけ水を分離させた。水をとらないよう溶液を抽出し、ナスフラスコに移して. エヴァポレートし、さらにクロロホルム：メタノール＝2：1で洗い込み、チューブに移した。それをN2でエヴァポレートし、クロロホルム：メタノール. ；2：1を11n1加え、保存した。. 内郁標準物賞として. 17＝0または20：1 エタノー・ルアミドと. ラットから組織を取り. 17；Oモノグリセ. 出し、凍結纈やレ. リドを加える. →. 乾燥する。. →. 凍結乾燥し. た組織を細かく切る. 水を加え撹絆し、. ホモジナイズし、. メタノール・クロロホルムの順に加え、. C：M：H2◎＝1＝2：0．8と. C：M：H20司：2：0．8となるようにして一晩冷. クロロホルムと生理食塩. 蔵保存する. 水を加え、撹拝する。. ↓ 二層の下部を抽出してナスフラスコ. N2でエヴァポレートし、溶媒をとばしたら、. に移し、N2でエヴ. C：M＝2：雪を1m耀え保存. ァポレートし、. する. 遠心分離機で二層に分ける. C：M＝2＝1. ←. でチューブへ洗い. 込む. Llpid抽出尭了. 図3−1＝ラット組織からのLlpid抽出一14・. く唖一■.

(18) 3．5．脂質の分離（薄層クロマトグラフィー）. 3．5−1一次元展開 ⑳⑭. 保存した抽出液のうち100μ1をTLC. ⑪響. で分離精製した。用いる薄層は、スポット. する幅を2．5cmとし、両端にスタンダー. O. O. ドをスポットする位置をそれぞれとった。. スポットする抽出液はチューブに移し、. 圃．■. D’ X. 膨夢. N2でエヴァポレートした。それをクロロ図3−2＝ラット腎臓（TしC）. ホルム：メタノール＝2：150μ1で鉛筆線. 溶解し、薄層にスポットした。収量を上げ. 回るために、同溶媒でさらに2回溶解抽出して薄層に供した。スタンダードとしては、化学合成したアナンダミドを両端. にスポットした。展開溶媒のクロロホルム：メタノール：酢酸＝95：4：1 を用いて薄層を展開し、プレムリンを噴霧してその展開位置を確認した。そして、スタンダードと比較し、アナンダミド画分に相当する部分をかきとった。. かきとったケイ酸にクロロホルム：メタノール：水＝1：2：0．8を3．8 m1加え、スターラーで30回忌出した。その後、クロロホルム、水を各1皿1. 加え、Vbrtexで1分撹寵した。次に、遠心分離機に1500rpmで5分かけ、二層に分離した下層部分を抽出した。また、残りにクロロホルム2mlを加えてよくかき混ぜ、遠心分離機で同様にして下部を抽出した。これを2回繰り返した。抽出した溶液は一度違うチューブに保存しておくが、それを遠心分離機. に1500rpmで1分かけ、水を分離させた。そこから水をとらないようにパスツールピペットで別のチューブに移した。. 3．5−2二次元展開保存した抽出液のうち400μ1（脳の場合は200μD をTLCで分離精製した。10cmX10c血の薄層を用意し、図3・3のようにレーンを引いた。1点にスポットし、スタンダードをスポットする位置をそれぞれとった。. 一15．.

(19) スポットする抽出液はチューブに移し、. 二次元展開. 位置確認のために17：0（20μg／. ml）を30μ1加え、N2でエヴァポレートした。それをクロロホルム：メタ. ノール瓢2：1で1回目50μ1に溶解. 重. してスポットし、さらに2回目20μ1、. 藷↑. スポット点. @ ＼. 3回日20μ1で溶解してスポットした。. 一次元展開溶媒としては、クロロホル. 図3−3：TLC. ム：メタノール：アンモニア：水＝90：. 鉛筆線. 溝. 10：0．5：0．5、二次元展開溶媒としては、ヘキサン：エーテル：アセト. ン：酢酸＝25：35：15：1を用いた。TLCで展開した後、薄層が乾燥したらプレムリンを噴霧し、その展開位置を調べた。スタンダードと比較し、その展開位置が確認できたら、その展開位置のケイ酸をかきとった。次に、そのかき. 図3−4：ラット脳中のTしC画分. とったケイ酸にクロロホルム：メタノー. 020：4エタノ触アミド画分. ル：水＝1：2：0．8を3．8ml加. 畷離》17、0モノグリセリト二分. え、スターラーで30分撹回した。クロ. ⑪中性脂肪画分. ロホルム、水を各1ml加え、 Vbτtexで. ⑭コ以テロール高分. 1分撹面し、遠心分離機に1500rpm. （唖瞼リン憎憎分. で5分かけ二層に分離し、下部を抽出し. ⑭未知妨害物質画分. た。また残りにクロロホルムを2ml加えてよくかき混ぜ、遠心分離磯で同様にして下部を抽出した。これを2回繰り返した。抽出した溶液は、一度違うチューブに保存しておくが、それを遠心分. 離i機に1500rpmで1分かけ、水を分離させた。そこから水をとらないようにパスツールピペットで別のチューブに移した。. 一16一.

(20) 3．6．脂肪酸エタノールアミドの分析（窩速液体クロマトグラフィー）. 3．6−1脂肪酸エタノールアミドの化学合成. まず最初に、50mlナスフラスコに脂肪酸45mgとジクロロメタン3ml を加えた。このときナスフラスコにスターラーを入れて撹搾した。次に、三方コックにアルゴンを満たしたバルーンをつけ、反応器内をアルゴン置換した。. そこに注射器を用いてオキザリルクロリドを2ml加え、2時間放置し、脂肪酸クロリドを得た。また、別の100m1ナスフラスコにモノエタノールアミ. ン100μ1とジクロロメタン2mlを加え、同様の方法でナスフラスコ内を. アルゴン置換した。そこに注射器を用いてジクロロメタン1ml、MSTFA （N・Methyl・N・trimethylsilyl・trifluoroacetimide）1ml、ジクロロメタン1. mlの順に加えアルゴン置換した。冷却しながら2時間スターラーで白搾する. と、TMS化エタノールアミンとなる。2時間放置した脂肪酸クロリドは、反応されていないオキザリルクロリドと溶媒を取り除くため、臭いがなくなるまでジクロロメタンを加えながらエヴァポレートした。脂肪酸むド. ，。曾H 恥翠静・. C＝O. むロ. 曲と℃. むほ. ㈱と・. 曹・・. むロ. むな. 幽殉. 曲と・・. ヨ. 齢・。リヨ. 曲と一・. 才キザリルクロリド. o藺酸ケロリド. 酸・アルカリ側隠倉骨嫁う. ユ. 一くノ窪. ⑭と・・. 油. ，≠〉●一レ. ㊧c・・ H 1隠◎化された. 鱗貌験工タノールア篭ド. ニタノ騨ルアミン. 7繋8化さ糖鑑タノ鞠’レ7墓ン. 図3−5＝アナンダミドおよびその類縁物質の合成. ．17．. ，一くノ㎝ 1. 顧塵羅Dc℃ 0駒鶴ニタノ岬ル7亀ド.

(21) 臭いがなくなったら、ジクロロメタン2ml×2回で洗い込み、注射器を用いてTMS化されたエタノールアミンに滴下した。さらにアルゴン置換した後1 時間撹嘱し、反応させた。次に、未反応の脂肪酸および試薬を取り除き、保護. 基（0−TMS）を取り外してアナンダミドおよびその類縁物質を得るため水・酸・アルカリ処理を行った。. TMS化されたN一脂肪酸エタノールアミンを、溶媒はエヴァポレートし、. 酢酸エチル50ml×2回で洗い込んで分液ロートに移した。そこに、蒸留水 50m1加え、分液ロートをさかさまにして、ときどき空気抜きしながらよく振った。しばらく放置し、二層に分離したら、分離した下部を捨て、上部は残. した。そこに炭酸水素ナトリウム溶液（重曹液pH雛9）を50ml加え、ときどき空気抜きしながらよく振った。同様に下部を捨て、残りに0．3N塩酸. を50ml加え、同様の処理を行った。ただし、塩酸に関しては、同じ工程を 3回行った。水をとらないように残った上部の溶媒をナスフラス認に移し、エヴァポレートした。それをクロロホルム：メタノール篇2：1で洗い込んで、チューブに保存した。. 3．6−2 蛍光ラベル TLCで分離精製した溶液（N一脂肪酸エタノールアミド）の溶媒をN2でエ. ヴァポレートしたのち、アントロイルシアニド0．1％（1rng／ml※溶媒はアセトエトリル：ジクロロメタン隠1：2）を100μ1加えた。次に、. 0．16％（1．6mg／m1※溶媒；はアセトニトリル：ジクロロメタン＝. 1：2）キヌクリジンを50μ1加. ①⑲㌦㍉・．. ・」. ⑰魁. えた。一晩冷蔵保存して反応させた。. 0. 反応後、メタノールを100μ1加え10分置き、反応を止めた。色が. 黄燈油から透明になったらN2でエヴァポレートし、精製するために. TLC（10cm×10cm）に供した。. 図3−6＝↑LC 一18・. 0.

(22) エヴァポレートした蛍光ラベルされたN一脂肪酸エタノールアミン画分を、ク. ロロホルム：メタノール＝2：1で50μ1に溶解してスポットし、さらに同. 溶媒50μ1で2回溶解抽出して薄層にスポットした。スポットした後しばらく乾かし、展開溶媒ヘキサン：エーテル：酢酸＝20：80：1で展開した。薄層の展開位置をスタンダードと比較し、アナンダミドの展開位置をかきとっ. た。かきとったケイ酸に、クロロホルム：メタノール：水＝1：2：0．8を 3．81nl加えて、スターラーで30分撹搾した。その後クロロホルム、水を. 各11n l加えてよく混ぜ、遠心分離機に1500rpmで5分かけ二層に分離した。二層に分離したら、その下部の溶液をパスツールピペットで抽出した。. 残りにクロロホルム2mlを加えよく混ぜた。そして、遠心分離機を用いて同様の方法で下部の溶液を抽出した。これを2回繰り返した。抽出した溶液は、. 一旦チューブに保存しておいた。それを、遠心分離機に1500rpmで1分かけ、水を分離させた。そこから水をとらないようにパスツールピペットで別. のチューブに移した。N2でエヴァポレートしたらアセトンを250μ1加えて、N一脂肪酸エタノールアミドを溶媒に完全に溶かし込み保存した。腹訪酸エタノールアミド. ①アントロイルシアニド. 4℃、オーバーナイト. ③ TLCで分離. ⊂⊃ 00. 蟹光ラペルされたアナンダミド. 宦k⊃. エタ語○ ④ 抽出. ○. 蟹藁のみ. 図3−7＝蛍光ラベル. ・19・.

(23) 3．6−3 アナンダミドおよびその類縁物質の分離、定■ まず、以下の蛍光ラベルされたN一脂肪酸エタノールアミドをスタンダードとして分析することから始めた。. 16：0……パルミトイルエタノールアミド 17：0……ヘプタデカノイルエタノールアミド 18：0……ステアロイルエタノールアミド 18：1……オレオイルエタノールアミド 18：2……リノレオイルエタノールアミド 20：1……エイコセノイルエタノールアミド 20：4……アラキドノイルエタノールアミド（アナンダミド）. 22：6……ドコサヘキサノイルエタノールアミド装置に流す溶出溶媒としては、アセトニトリル：イソプロパノール：水＝80：. 3：17を使用した。分離状態をよくするために、この溶出溶媒の検討も行った。詳細は、結果の方へ記載した。. 8 蛍光検出犠. 万溶出溶媒釣. ’ン. ラム. ⇔ 30。C一定. （流量）. 廃液レコーダー. （溶出溶媒）. アセトニトリル＝イソプロパノール：H20. ＝80：3 ：17 図3−8＝高速液体クロマトグラフィーによるアナンダミドの分離・定量. ここで、HPLCの使用手順について順を追った。まず、ポンプの電源をON. 一20・.

(24) にし、メタノールを30分程度流してカラムを洗浄した。蛍光検出器、レコー. ダーの電源をONにし、溶出溶媒を15分程度、シグナルが安定するまで流した。このとき同時にHPLC条件の設定を行った。条件は次の通りとした。. FILE 5 WIDTH 5 SLOPE 1000 MINAREA 10000 STOP−TM 65 ATTEN 3 SPEED 5. METHOI）＄41. 流速1．2ml／分. この条件を、レ諏一ダーでPARA ENT：ERを押し、設定した。そして、蛍. 光検出器のAUTO ENTERを押し、シグナルを0にした。シグナルが安定したらサンプルをカラムに注入するが、その前に、チャートに設定条件を打ち出. しておいた。操作方法は、LIST PARA ENTERの順に押した。次にサンプルの注入を行った。注入は、注入口を1：NJECTからLOADにまわして行った。. ただし、注入後はしばらくおいてからシリンジをはずし、再びINJECTにまわしておいた。図3・9に、スタンダードの溶出パターンを示した。. SUPELCOS書し ABS＋Plus（25cm×4．6mm，5um）アセ：トニトリル：イソプロパノール＝水＝80：3：17 亀。Zm雛！mきn， 2s ra. Waters 4ア4 Fl継◎rescenGe Detector （Ex 37◎nm，Er物．470nm）. C16：0. C18：1. C20：4. C2α1. C筆8：2. C22：6. C17：0. C18：0. time ◎. 竃◎. 30. 20. 図3−9＝脂肪酸エタノールアミドのHPLC溶出パターン一21．. 4◎. 50.

(25) 3．6−4ラット腎臓および脳中からのアナンダミドおよびその類縁物質の微量定量ラット腎臓および脳中のアナンダミド画分を蛍光ラベルしたものをH：PLC で分析した。. H：PLCの溶出溶媒は、アセトニトリル：イソプロパノール：水＝80：3： 17を使用した。カラム、その他の装置はすべてスタンダード分析の際のものと同じものを使用した。まず最初に、スタンダードとして化学合成したN一脂. 肪酸エタノールアミドの混合サンプルを、H：PLCで分析した。混合するN一. 脂肪酸エタノールアミドは、16：0，17：0，18：0，18：1，18： 2，20：1，20：4（アナンダミド），22：6のそれぞれの脂肪酸をもつ8種類のものとした。. 次に、ラット臓器のアナンダミド画分を蛍光ラベルしたものをそれぞれ猛P LCにかけた。 H：PLC設定条件は次の通りであった。. FILE 5. MINAREA SPEED 5. WIDTH 5 SLOPE 100 1000 STOP−TM 65 ATTEN 2 METHOD＄41 流速1．2ml／分. そうして得られたチャートをスタンダードから得られたチャートと比較し、アナンダミドおよびその類縁物質のそれぞれのピークを特定した。. N一脂肪酸エタノールアミドがそれぞれ特定できたら、次はそのピークの面. 積から重量を特定した。内部標準物質の20：1エタノールアミドはラットの. 乾燥腎臓および脳100mgにっき1μg添加した。この脂肪酸エタノールアミドは一般的に動物細胞中には存在しないので、この重量はほぼ変化しないものと考えた。. よって、20：1エタノールアミドの面積と重量の比から全ての重量を特定していくものとした。. 例えば、20：1エタノールアミドが1μgで面積が754494、アナンダミ一22．.

(26) ドの面積が186759だとすると、アナンダミド量：1μg諜186759：754494 で、その比によって、計算式よりアナンダミド量は0．248μgと特定できた。この計算式を用いて金てのN一脂肪酸エタノールアミドの重量を特定した。. その中でもアナンダミド量に注目し、食餌を変えたラット腎臓および脳中のアナンダミド量の変化について調べた。. C17；0. ＼. C20：4. 図3−10＝高速液体クロマトグラフィーのチャート. 一23一. C20；1. ／.

(27) 3．7．モノアシルグリセロールの分析（ガスクロマトグラフィー）. 3．7−1メチル化二次元展開でかきとった薄層をチューブに移し、0。5Mナトリウムメチラートを500μ1加え、脂肪酸のメチル化を行った。スターラーチップを入れ、. 60分スターラーで擬心した後、6M塩酸を50μ1加えて中和し、反応を停止した。水11n1加え、さらにヘキサン1．5mlを加え、 Vbrtexミキサーでよく撹搾し、上層をパスツールピペットでスピッツチューブにとった。同様に、. ヘキサン抽出を2回繰り返し、脂肪酸メチルエステルをヘキサンにより、完. 全に抽出した。ヘキサンをN2でエヴァポレートし、再びヘキサンを10μ1 加え、ガスクロマトグラフィーのサンプルとした。. 3．7−2ラット腎臓および脳中からのモノアシルグリセロールおよびその類縁物質の定畳法. 3．7−1のように調製した脂肪酸メチルエステルの溶液の内4μ1を10 μ1シリンジでガスクロマトグラフィーに注入し、脂肪酸組成の分析を行った。ガスクロマトグラフィーの分析条件は、次の通りである。. イニシャル尋問：5分. イニシャル温度：170℃ 昇温時問：10分ファイナル時間：15分. ファイナル温度：240℃ AIR（酸素21％、他窒素）：0．5：kg／cm2. HYDROGEN（水素）：0．5kg／cm2 CARRIER（ヘリウム）：1。5：kg／c搬2 各種脂肪酸の同定は、スタンダードのretention tilneと比較して行い、ピ. ・24一.

(28) 一ク面積の比から、各脂肪酸の定量を行った。. 3．8．ラット腎臓および脳中のリン脂質組成の分析（ガスクロマトグラフィー） 3．4．で得たLipid 20μ1を薄層ク. ロマトグラフィーで分離した。. 10c魏×10c紐の薄層を用意し、両端5 mm、各幅3c撒のレーンを引いた。：Lipid. 20μ1をチューブにとり、エヴァポレートし、クロロホルム：メタノール畿2：1 を50μ1加え、Vbrtexミキサーで撹記し、薄層にスポットした（3ヶ所）。. 図3−11＝TLC. 展開溶媒は、ヘキサン：ジエチルエーテル：. 魎》リン脂質に柑当するバンド. 酢酸コ80：20：1で行い、薄層の上部から5mm位置まで展開した。溶媒を乾かした後、0．001％プレムリン／80％アセトン溶液を薄層に噴霧し、薄層の各スポットをuVランプ下で確認した。リン脂質応分に相当する最下部のバンドを硫酸紙上にかきとり、チューブに移した。. 3．7−1の方法でメチル化し、ヘキサンをN2でエヴァポレートした後は、再びヘキサンを40μ1加え、ガスクロマトグラフィーのサンプルとした。. 1μ1を10μ1シリンジでガスクロマトグラフィーにインジェクトし、リン脂質組成の分析を行った。ガスクロマトグラフィーの分析条件は3．7−2 と同様である。. 各リン脂質の同定は、スタンダードの■etention timeと比較して行い、ピーク面積の比較から各リン脂質の組成比を求めた。. ・25一.

(29) 4．結果 4．1．展開溶媒の検討一次元TLCのみでは、高速液体クロマトグラフィーのチャート上で、アナンダミド付近に妨害ピークがみられ、微量のアナンダミドの正確な定：量が行えなかった。. ←妨害物質のピーク 20：4エタノールアミドのピーク. 図4一牡高速液体クロマトグラフィーのチャート. 展開溶媒（クロロホルム：メタノール：酢酸諜95：4：1）. またこの一次元丁：LCでは、モノアシルグリセロールは、脂肪酸エタノールアミドとほぼ同位置に展開され、同じサンプルから両者を定量することができなかった。そこで、まず、展開溶媒の検討から始めた。. 以下、日を追って記載した。. 圏溶媒を変えて調べた。［一次元展開］. ①クロロホルム：メタノール：アンモニア訟80：20：2 ［二次元展開コ. ②ヘキサン：ジエチルエーテル：アセトン：酢酸濡30：40：20：1. ③酢酸エチル：ヘキサン：酢酸：水諜100：50：20：100. ．26一.

(30) ※二次元展開をした場合、上がりすぎるので、溶媒の割合を変えて調べることにした。. 圏 2次元展開で再度溶媒を変えて調べた。. ②ヘキ・サン：ジエチルエーテル：アセトン：酢酸濡30：3『6：20：1. ③酢酸エチル：ヘキサン：酢酸：水＝90：50：20；100 ※上がりすぎるので、さらに溶媒の割合を変えて調べることにした。. ②ヘキサン：ジエチルエーテル：アセトン：酢酸竃30：βq：：1資：1. ③酢酸エチル：ヘキサン：酢酸：水瓢6φ：50：20：100 ※上記の割合でT：LCを行うことに決定した。. 圏圏に決定した割合の溶媒で行った。 1回冒のT：LCはクロロホルム：メタノール：酢酸驚95：4：1. 2回目のTLCは2次元展開 ①ヘキサン：ジエチルエーテル：アセトン：酢酸＝30：36：15：1 ②酢酸エチル：ヘキサン：酢酸：水・驚、6ρ：50：20：100 でラットA−1を用いて行った。【別実験】T：LCにおいて展開溶媒ヘキサン：ジエチルエーテル：アセトン：. 逸品＝30：30：15：1を用いて22：6，20：4，17：0， 16：0を上げた。 ※ほぼ同位置：に上がった。. 匪固HPLC ※チャートのretention time（今後、 tilneと略す。）13．353に小さな. ピーク有り、17：0のピーク無し。. 2次元TLCの少し下をかきとって調べた。. 囮HPLC ※チャーートの七ime 13．046に高さ1／4程度のピーク有り。17：0ピーク無し。. 囲ラットB−3で再度挑戦した。T：LCで①から④の位置をかきとった。. ・27一.

(31) ③. 、鳶毬. ※②の位置に17：0のピーク. 有り。しかし、チャートの. 曾. time 13．07に大きなピークが出た。. ○. 1st ↑. 睡 17：0のみとラット A−2で調べた。. 圃H：PLC 2st ＜ト図4−2：二次元↑しC 17：0のみ……チャートのtime 13．011に少しのピーク。. 17：0には大きなピーク。ラットA−2…………チャートのtime 13．012に大きなピーク。. 17：0のピーク：有り。 ※チャートのtime 13．0付近のピークは、ラット自身に問題有り？ TLC後の抽出時に上層部の溶媒が混入したのが原因か確かめた。 ※上層部の溶媒が混入したためtime 13．0付近にピークが出るのではないようだ。しかし、抽出を丁寧にすると少しは減った。囮［1］time 13．0付近の妨害物質の位置確認……time 13．0付近のピーク. をHPLCで採り出した。17：0，20：4と一緒にT：LCにかけて位置を確認した。. ［2コ水の影響……17：0のみに水を5μ1入れて蛍光ラベルして調べた。. ［3］どの部分にTIME 13．0付近のピークが入るか確認…… 再度TLC. でそれぞれの位置をかきとり、蛍光ラベル後、HPLCで調べた。. 囮HPLC 一28一.

(32) ［1］TLC ※time 13．0のピークは、17：0 と同じぐらいの位置に上がった。［2］time 13．0付近のピークは出なかっ. た。. ．盤一竃5①噛一一緬爾晶輌一繭嶋軸騨②（こじク嚇一一櫛櫛一齢噛一購開脚. 0. O. ※水の影響ではない。. 囮［3］TLC ③一｝學一“鵬鱒一騨周“嚇騨庸. ①、②、③の位置を別々にかきとり、蛍光ラベルした。. ・電. ￠ﾋ：：1：：＝i：・㌦. ↓. ②、③は、さらに細かく区切って. かきとり、HPLCにかけた。. 図4−3：TLC. 囮蛍光ラベル（①∼⑧）. ① ”’. ◎. ③. P室川…. ④. 0 ⑥. 一一齢一一一一一騨昼鳳一輪嚇輌輸的‘. … ”……撚…. 黶D・：圏’‘顧 ■ 覧. ●，，‘噛■島●刷■，曝卿巳●卿，o罵虞腫，■. ・：：＿il：＝・. 図4−4＝蛍光ラベルした後のTLC. 囮HPLC ［3］⑥の位置に17：0検出 ④、⑤、⑧にはtime 13．0付近のピーク無し。⑦に少し有る。. 一29一. ⑧.

(33) ※蛍光ラベル後の17：0の少し下のほうに有りそうだ。. 囮H：PLC ①、②、③にはtime 13．0付近のピーク無し。. 溶媒を変えて実行した。. 蛍光ラベル後 ①ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸＝90：10：1. ②ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸篇30：70：1. 続けて2回上げた。→結果は画へ. 囮8種類のサンプルをTLCで上げた。. ※20：4と17：0は同じ位置に上がった。蛍光ラベルした8種類のサンプルを？LCで上げた。. ※20：4が一番上へ上がり、17：0は低い位置であった。. 囮HPLC time 13．196に大きなピークが出る。17：0のピークがいつもより低かった。. ※かきとる位置が原因ではない。T：LCの毅階で何かできている。. →HPLCの溶媒の割合を変えてみた。. 亟 TLC（A・B群の1，2）→蛍光ラベル MGパルミチン酸と合成セラミドとの位置関係を調べるため、τLCで上げた。. ※ほぼ同位置に上がった。. 睡魍HPLC ※すべてに大なり小なりtilne13，0付近にピークが出た。. 4／27，28，2 TLC（A・B・C・D群の3，4）→蛍光ラベル. ※特に、B−3・C−4・A−4のtime13．0付近に膨大なピークが環れた。. 國溶媒を変えて調べた（20：4とMGと合成セラミドについて） ①ヘキサンニメタノール：酢酸＝95：4：1 一30一.

(34) ②ヘキサン：エーテル：アセトン：酢酸瓢30：30：15：1 ③クロロホルム：メタノール：アンモニア：水. ＝90：10：0． 5：0． 5. ④トルエン：メタノール：酢酸篇95：4：1 ※③が一番離れた。 ↓. ②、③で17：0も加えて調べた。. ※②は20：4・17：0・MG・セラミドの順に上がっていた。 ↓. ②の割合を変えて上げた。. ヘキサン：エーテル：アセトン：酢酸庸25：35：15：1……アヘキサン：エーテル：アセトン：酢酸嵩25：30：20：1……イ ※アは順に上がっているので、この割合の溶媒で行うことに決定した。. 國 C−4で溶媒（ヘキサン：エーテル：アセトン：酢酸瓢25：35： 15：1）を使用した。. 匪lHPLC 17：0のピーク有り。20：4の付近に不純物多し。 ※この溶媒割合では無理。. C−4で溶媒（クロロホルム：メタノール：アンモニア：水篇90：10＝. 0．5：0．5）を使用. 匝｝HPLC 17：0のピーク有り。ti鵬e 15，89のピークは20：4と確認できた。. A−4で溶媒（クロロホルム：メタノール：アンモニア：水＝90：10：. 0．5；0．5）を使用. 匝HPLC 17：0のピーク：有り。time 16．043のピークは20：4と確認できた。 ※溶：媒（クロロホルム：メタノール：アンモニア：水コ90：10：. 0．5：0．5）では、17：0・20：4のピーク共にうまく測れた。一31一.

(35) ※以下の溶媒で二次元展開を行うことに決定した。. 《決定した展開溶媒》. 一次元展開……クロロホルム：メタノール：アンモニア：水＝＝90：10：0． 5：0． 5 二次元展開……ヘキサン：エーテル：アセトン：酢酸. ＝＝25：35：15：1 高速液体クロマトグラフィーで脂肪酸エタノールアミドを分析すると、一次元展開ではチャート上でアナンダミドの近くに大きな妨害ピークが見られ、微量のアナンダミドの正確な定量が行えなかったが、二次元展開することによりこの未知の妨害物質も分離できることがわかった。. ／. 20：4エタノールアミドのピーク. 図4−5＝高速液体クロマトグラフィーのチャート展開溶媒（一次元展開：クロロホルム：メタノール：アンモニア：水. ＝＝90：10：0． 5：0． 5、二次元展開：ヘキサン：エーテル；アセトン：酢酸. 嵩25：35：15：1）また、一次元展開では、モノアシルグリセロールが脂肪酸エタノールアミドとほぼ同位置に展開され、同じサンプルから両者を定量することができなかったが、この方法で行うと、アナンダミドおよびモノアラキドノイルグリセロールを同じサンプルから分離定量できることがわかった。. 一32．.

(36) @9. il O. ・量・輌. 段レスー傷◎. ¥. 働を. 晦. 柱ﾏCl二，肪⊂：フ ”Q. 1st. 1st. ↑. ↑. リン脂質. 2st 一. 2st ＜トー図4−6＝スタンダードの二次元TLC. 図4−7：17＝0哨G，17＝OEtA添加脳. 脂質画分の二次元TLC 薩）ヘプタデカノイルグリセロール（17：0−MG）○アナンダミド温品 ○ アナンダミド（20：4EtA）. 廷聾診アラキドノイルグリセロール品分. ●エイコセノイルエタノールアミド（20：1EtA）（）未知妨害物質画分 ○ヘプタデカノイルエタノールアミド（17：0EtA）. 4．2．溶出溶媒の検討高速液体クロマトグラフィーによるアナンダミドの分離条件をよくするために、溶出溶媒の検討を行った。. アアセトニトリル：イソプロパノール：水隷80二3：17. イアセトニトリル：イソプロパノール：水＝80：3：20 ウアセトニトリル：イソプロパノール：水＝80：3：23 ※ イが妨害物質のピークが一番低くなった。 time 13、0のピークが邪魔する場合、溶出溶媒をアセトニトリル：. イソプロパノール：水雛80：3：20でHPLCにかけることにした。. ・33．.

(37) 妨害ピーク. C2034 ア. C17：0. 妨害ピーク. C20：4. イ. C17 0. 妨害ピーク. C20：4. ウ. 図4−8：高速液体クロマトグラフィーのチャート一34一.

(38) 4．3．ラット腎臓および脳中のアナンダミドおよびその類縁物質の測定表4−1は、ラット腎臓の乾燥重量100mg中のアナンダミドおよびその類縁物質の量である。Aグループのラットにはラード10％食、 BグループにはD. HAを含むリン脂質10％食、CグループにはDHAを含むトリグリセリド10％食、Dグループにはリノール酸を含むトリグリセリド10％食を与えた。表4一霊＝ラット腎臓中のアナンダミドおよび類縁物質の含有量（μg）. AVERAGE STDEV. NAMε. A−1. A−2. A−3. A−4. A−5. A−6. C16：0. α260. 0，291. 0，337. 0，566. 0，549. ◎，292. α382. Oj 38. C1810. O，085. 0，114. 0，102. 0コ76. ◎」74. α146. 0」33. 0，038. C18：霊. α153. Oj 58. 0，272. 0，146. 0，130. 0，117. 0』63. O，056. C18：2. O，122. 0，137. 0，154. 0，290. O，071. 0，122. 0，149. 0，074. C20＝4. 0，029. 0，077. 0』27. 0，022. α015. 0ρ24. 0，049. 0，044. C22：6. 0，018. 0，012. 0，007. NAME. 8−1. B−2. B−3. B−4. B−5. 8−6. C16：0. 0，250. α240. 0229. 0，446. 0，212. 0，231. α8：0. 0，071. 0，088. 0，056. OjO6. 0，077. C肇8：1. OjO8. 0，090. 0，112. α084. 0，085. C18：2. 0」22. α076. 0，113. 0，葉43. O，051. C20＝4. 0，022. 0，025. 0，037. 0，008. 0，013. C22：6. O，020. 0，014. 0，030. NAME. C−1. C−2. C−3. C−4. C−5. C−6. C16：0. 0，206. 0，156. α144. O，272. 0，225. 0，183. Oj 98. 0，047. C18：0. Oj 17. ◎，062. α036. 0，078. O，059. 0．1. α075. 0，029. C18：1. 0，059. α075. 0，079. O，048. 0，105. α081. 0，075. α020. C18：2. 0，159. 0，070. 0，045. 0，046. Oj 10. ◎，135. 0，094. 0，048. 0，018. O，021. 0，005. 0，046. 0，017. 0，021. 0，015. 0，◎25. α◎25. C20＝4. ◎，005. O，012. AVERAGE STDEV 0，268. 0，088. O，080. 0，019. 0，094. 0，013. α107. 0，102. 0，033. 0，021. 0，021. 0，010. 0，020. 0，007. 0，082. 0，017. C2216. 0，037. 0，013. 0，011. 0，011. 0，072. 0，007. NAMEi. D−1. D−2. D−3. D−4. D−5. D−6. AVERAGE STDEV. AVERAGE STDEV. C16：0. 0，229. 0，171. O，284. α313. α218. 0，209. α237. 0，052. C18：0. 0，121. 0，061. 0，095. 0，092. 0，089. 0，099. α093. 0，019. C18：1. 0」47. 0，106. 0，145. Oj 73. OjO6. 0，127. 0，134. 0，026. C18：2. α274. O，110. α685？. 0，864. ◎，100. 0．18. 0，305. 0，320. C20：4. 0，014. 0，047. 0．066？. 0，064. O，052. 0，017. 0，039. 0，022. 0，072. 0，018. 0，043. 0，027. C22：6. 0，038. 一35一.

(39) C22：6. C20：4. 難iii藝萎iiiiiiiiiii. C18：2. ∂. @. −. 卿. ●. 學. 露. @. ■. 奄撃奄奄奄奄奄奄奄奄奄奄奄沿ﾞ1. C18＝1. 印. 邑. @ @. 「. じ O. P. C18：0. C16：0 響. ?. 0. 0．2. の. o. 0．4. 0．6. μg／100mg乾燥重量. 田A：ラード10％圖C＝DHA−TG 10％. 口B：DHA−PL10％國D：リノール酸一一TG 10％. 図4−8：ラット腎臓中の脂肪酸エタノールアミド含有量. 一36一. 0．8.

(40) 図小8は、各グループごとに平均した値をグラフに表した。表杢2は、各グループごとに平均した値を表にした。. 表4−2：ラット腎臓中の脂肪酸エタノールアミドの含有量（μg）脂肪酸. A. 臼. C. D. 0，198. 0，237. 0，382. 0，268. C18：0. 0」33. 0，080. 0，075. 0，093. C18：1. Oj 63. 0，094. 0，075. Oj34. C16：◎. C18：2. 0，149. 0』02. 0，094. 0，305. C20＝4. 0，049. 0，021. α021. 0，039. C22：6. 0，012. α020. 0，025. 0，043. 表4・3は、T検定により各グループ問での有意差を調べた。表中の値：は、両側検定によるp値（危険率）を示す。. 表4−3＝TTEST（P値）脂肪酸. A−B. A−D. A一一C. 8−C. C−D. Oj 9808. C16：0 C18：0. 0」1689 0．◎2α6. ＊. 0．0155璽. ◎．04577 ＊. 0．02016. C18：1 C18：2. 0．01429. ＊. 0．00438 ＊＊. 0．27853. 0．07650. α00124 ＊＊. 0．18474. O．15627. 0．27211. 0．74264. C20：4 C22：6. 0．16497. 0．22021. 0．66209. 0．97508. 0．14092 Oj 8206. 0』4321. 0．40272. 0．12808. 0．72672. 0．3フ033. （＊，p〈0， 05. 0．01網6. ＊. α03675. ＊. 0．11699. ＊. ＊＊， p＜0． 01. ＊. 0．24968. ＊＊＊，p＜0．001）. DHA添加食は16：0、18：0、18：1を減少させた。22：6を増加させ、18：2、脅0：4を減少させる傾向があった。. リノール酸添加食は16：0、18：0を減少させた。18：2、22：6 を増加させ、18：1、2b34を減少させる傾向があった。. ．37．.

(41) 次に、脳中のアナンダミドおよび類縁物質の含有量を表4・4に表した。. 表4−4＝脳中のアナンダミドおよびその類縁物質の含有量（μg） NAMEi. A−1. A−2. A−3. A−4. A−5 1」84. A−6. AVERAGE. STDEV. 1，212. t511. 0，367. 0，441. 0，561. 0，107. C16：0. 1」88. 1，920. 1，951. t613. α8：0. 0，486. α711. 0，637. α612. 0，479. α8：1. O，329. 0，359. α533. α355. 0β23. α333. 0，372. 0，080. C18：2. ◎，◎28. 0，059. 0，033. α023. 0，047. α024. 0，036. 0，015. C20＝4. 0，081. 0，112. 0，116. O，076. 0，088. 0，082. 0，093. 0，017. C22；6. 0，043. α臼1. 0，051. 0，083. 0，033. 0，018. 0，057. 0，035. NAME. B−1. B−2. B−3. B−4. B−5. 8−6. α6：0 C18：0. 0，417. 0，460. α4調. α412. 0，277. C18：1. 0238. 0，299. 0388 0254. t485. 1276. AVERAG匠. t147. 1，598. 0，797. tO18. 0，348. 1，220. STDEV α297 ◎，065. 0247. 0，177. 0，363. 0，202. C1812. α064. 0，059. 0，020. 0．0で0. 0，021. 0，017. 0，032. α023. C20＝4. 0，021. 0ρ53. 0，038. 0，103. 0，078. 0，053. 0，032. 0，046. α◎16？. 0，045. 0，017. α036. α016. C−3. C−4. C−5. C−6. 0，025. C22：6. NAME. C−4. C16：0. 0，852. t977. t596. α8：0. O，309. α599. C18：1. O，271. O，266. 0，020. α019. 0，035. O，038. 0，014. 0，055. C−2. AVERAGE. 0，068. STDEV. 1」84. t327. α606. ◎，424. α468. 0，391. 0，466. 0，118. 0384. O，409. 0343. 0，308. 0，330. O，059. 0，017. 0，018. O，028. αα5. 0，025. 0，040. 0，034. 0，013. 0，023. 0，127. 0，049. 0，046. D−6. 1232. t361. 0，385. C18：2. 0ρ46. 0，◎48. ◎20：4. O，053. 0，014. C22：6. 0ρ27. NAME. D−1. D−2. D−3. D−4. O，974. t242. t840. D−5. C16：0. 0，893. 0，774. tO28. 1，125. C18：0. 0，293. 0，371. 0，553. 0，247. α243. 0，344. 0，342. α料5. C18：1. 0，307. 0，239. 0，428. α242. 0，241. 0，314. O，295. ◎，073. C18：2. α◎72. α083. α031. 0，◎25. 0，◎32. Oj 19. 0，060. α037. C20＝4. O，072. 0，022. 0，043. 0，039. 0，039. 0，055. 0，045. 0，017. C22：6. Oj 43. 0，023. 0，071. 0，066. α041. α029. 0，062. 0，044. 各グループごとに平均した値を、グラフに表した（図4・9）。. ・38一. AVERAGE. STDEV 0，383.

(42) C22：6. C20：4. C18：2. 9艮弓. C18：1. @. ゆ＝. 書瀦. C18：0. @. 電＝＝. C1610. 0. 晴審. 0．5. 1. ●；. t5. μg／100mg乾燥重量. 田A＝ラード1096 團C：DHA−TG 10％. ロB：DHA−PL1096 國D：リノール酸一TG 10％. 図4−9：ラット脳中の脂肪酸エタノールアミド含有量. ．39吻. 2.

(43) 表4−5は、各グループごとに平均した値を表にした。. 衷4−5＝ラット脳中の脂肪酸エタノールアミドの含有量（μg）脂肪酸. A. 8. C. D 1，125. C16＝0. t51肇. 1，220. 1，361. C1810. 056壌. 0，388. O，466. 0342. α8：1. 0，372. 0，254. α330. 0，295. C1812. 0，036. 0，◎32. 0，028. 0，060. C20：4. 0，093. 0，053. 0，034. 0，045. C22：6. 0，057. 0，036. 0，049. 0，062. 表4−6は、T検定により各グループ間での有意差を調べた。. 表4−6：T↑E：ST（P値）脂肪酸. A−B. C16：0. α50584. C18：◎. 0．00695 ＊＊. 0．17608. C18：1. 0．02047. ◎．326判. C18：2 C20：4 C22＝6. 0．72725 0．02326. ＊. O．379171. （＊，p＜0． 05. B−C. C−D. α10498 0．00675 ＊＊. α49272. 0．3凄205. Oj 8178. 0．09436. 0．11389 Oj 6509. 0．06576. 0．38603. 0．75339. 0．07815. α00006＊＊＊ 0．00068 ＊＊. 0．21608. 0．24369. 0．773205. 0．661114. 0．648175. ◎．38543. ＊. A−D. A−C. 0．16154. 0．810696. ＊＊，p〈0． 01. ＊＊＊，p＜0．001）. DHA添加食：ば窪Q：一4を減少させ、16：0、18：0、18：1、22 6を減少させる傾向にあった。. リノール酸添加食は18：0、多0．：4を減少させた。18：2、22：6 を増加させ、16：0、18：1を減少させる傾向にあった。. ，40一.

(44) 4．4．ラット腎臓および膜中のモノアラキドノイルグリ二二ールおよびその類縁物質の測定表4−7は、ラット腎臓の乾燥重量100mg中のモノアラキドノイルグリ運脚ールおよびその類縁物質の量である。Aグループのラットにはラード10％食、. BグループにはDHAを含むリン脂質10％食、 CグループにはDHAを含むトリグリセリド1096食：、Dグループにはリノール酸を含むトリグリセリド10％食を与えた。. 表4−7：ラット腎臓中のモノアラキドノイルグりセ同一ルおよび類縁物質の. 含有量 NAME. （μ9）. A−1. A−2. 13．◎60 C18：0. 3，599. Gで8：1. 5475. 1t6霊6. 4．811. C18：2. tO53. 2．472. STDEV. A−5 7．117. A−3. 3」27. 3．648. 6．758. 4．485. ◎．722. 3．424. 3．257. 2．148. t875. 3」20. 5．836 t640. 0．740. 1．252. NAMε. B−1. 4．599 C18：0. 8．176. 2．◎39. C18：1. B−4. B−5. 1壌．835. 6．603. 6．394. B−3. B−2 4．138. 6．940. 3．732. 3．414. 2，327. 5．260. 5．08マ. 3．437. AV駅AGE. STDεV. 2．664. 3，052. O．834. 3．08. 4、245. 1．878. B−6. t308. 1湘5. C18：2. 0．309. C20：4. 0．997. 3．422. 0．683. 2．080. α586. 2．357. t688. t123. C22：6. 1．023. 2．322. α071. 2．57フ. 0、628. 2，182. 1．467. tO32. NAME. C−1. AVERAGE. STDEV. α644. O531 t199 0507. 0．38壌. 0．436. 10β35 C18：0. C−2. 7，335. 3．624. C18：1. 2．722 3．131. C−4 7．475. 2．095. 2．359. 2．610. 2．405. 2．636. 1、294. 4．657. 3．345. 3．024. 3．090. 0．227. α628. 0．396. C18：2. t643. C20：4. 3．557. 0．756. 0．371. C22：6. t255. 0．215. ◎．給8. NAME. D−1. 12．677. 0．470. C−3 4．244. C−5. 0．923 0．349. C−6. 5．945. 5．332. 0．452. 0．望33. 0227. 1t355. 6．984. G18：0. 4，726. 3」88. C18：1. 8．562. 4．454. 4，985. 6．マ37. 3．56フ. 0．640. 2．789. 0594. α075. 0．500. 0，107. t575. 0．729. C20＝4. C准8：2. 2．110. 0，512. C22＝6. 0．671. 0．228. 3．914. 4．423. t631. 5」07 0．616. 各グループごとに平均した値を、グラフに表した（図4畦0）。. 一41．. STDEV. D−6. D−4. D−2. 1．699. 5．355. 1フ84. 1．326. 0．856. 0β66. 0．262.

(45) iil舞．鰯●層. C22＝6. 幽. @. 脅. P. 膨. …………iiiiiiiiii…i…. C20：4 ，. 暑. 8. lli葺il羅夢…加工＝幽. C18＝2. ●. @. 曾. 噂. @. 趨. C18＝1. ＝聾＝冨’. 高奄撃奄奄奄猿Oiiiiiiiiiiiiiii. ・＝・窪＝虚：：. @. C18＝0. 脚窪・. @. @魅噂謄■ e @ ?. ● 糧．. 畢 ●. ・・’‘酬＝1；…韮≡灘・i講＝’暮・灘・・羅ii藝繋蹴’. 灘灘、韮1．離…1…・. 臓. C16：0. 曾 @. ●. 2. 4. ．1羅lll；韮. ● o. ?. 0. 恣蛯P＝…≡難illli難羅lll……1. 塵. 6. @■. 匿. @. ・. 8. 凶. 10. μg／100mg乾燥重量. 田A：ラード1096 睡C：DHA−TG 1096. □B：DHA−PLI O96 塑D：リノーノレ酸一一TG 1096. 図4−10：ラット腎臓中のモノアシルグリセロール含有量. ．42一. 12.

(46) 表幽8は、各グループごとに平均した値を表にした。. 表4−8＝ラット腎臓中のモノアシルグリセロール量（μg）脂肪酸. A. B. C. D. C16：0. 8，376. 7．40壌. 6，777. 8，592. C18：◎. 3，671. 3，052. 2，636. 4，010. C18：1. 5，836. 4，245. 3，090. 5，355. α8：2. t640. t341. 0，644. 凄．326. C20：4. 1，715. 壌．688. t101. C22：6. 0，328. t467. 0，381. t800 0366. 表4−9は、T検定により各グループ間での有意差を調べた。. 表4−9：TTεSτ（P値）脂肪酸. A−B. A−D. A−C. B−C. C−D. C16：0 C18＝0. 0．50144. 0．24883. 0．88795. α64833. 0．23445. Oj 9931. 0．01782 ＊＊. 0．66261. 0．32621. 0．08790. C18：1 C18＝2 C20：4 C22：6. 0．30962. 0．09834. 0．74966. 0．26724. 0．59659. 0．02162＊＊ 0．513Q6. 0．19383. O．03923 ＊ Oj 2387. 0．95712. α27568. 0．91058. 040682. 0．44235. 0．78537. O．76885. 0．03902. 0．02348. ＊. （＊，p＜0． 05. ＊＊，p＜0。01. ＊. 0．94353. ＊＊＊，p＜0．001）. DHA添加食は18：0、18：2を減少させた。22：6を増加させ、 16：0、18：1、1￡φ114を減少させる傾：向があった。. リノール酸添加食は、16：0、18 ：0、22：6を増加させ、18：1、 18：2を減少させる傾向があった。. ．43．.

(47) 次に、脳中のモノアシルグリセロールの含有量を表4−10に表した。. 表4一重0＝脳中のモノアラキドノイルグリセq一ルおよびその類縁物質の含有量. NAME. ’. A−1. A−2. （μ9）. A−3. A−4. A−5. A−6. AVERAGE STDEV. 12」92. 9，470. 7，007. 8」50. 9，744. 2，248. C16：0. 8，975. 重2．671. C18：0. 1α903. 9，792. 11，856. 11，138. 4，771. 8，420. 9480. 2，600. α8：1. 13，984. 15，481. 12，328. 18，584. 7，552. 11，975. 給，317. 3，フ12. α8：2. 0，519. tO 16. 0，241. C20＝4. t995. 2，126. C22：6. 0，519. 0，692. NAME. 8−1. B−2. 1，924. 0，687. 0β87. t◎85. 0，799. 1，849. t249. t361. 1，751. 0，359. 0，321. α257. 0，460. 0，450. Oコ71. B−4. B−3. B−5. 8，763. 8，250. 壌1．285. 9，944. t584 t395. 唾t574. 17，993. 13，876. 3，384. 0，364. 0，714. 1，871. 0，960. 0，593. 0，952. t318. 1，447. t385. 0，609. 0，500. 0，403. 0，707. 0，385. 9」64. 9，878. 6，215. 8，031. 8515. C18：0. 10，◎16. 8，242. 11，244. 10，629. C18：｛. 14，226. 8，456. 15」92. 15，817. C18：2. t207. 0，645. C20：4. 4．189？. 0，832. 2，377. C22：6. 1．960？. 0，663. t262. C16：0. C−1 8280. α8：0. 8，352. C18：1. C−2「. C−3. AVERAGE STDEV. 壌0，777. C1610. NAME. B−6. C−4. C−5. C−6. AVεRAGEi. STDEV. 5，622. 10，465. 1α542. 7，793. 8，488. t840. 7β45. 9，079. 杜914. 10，614. 6，750. 9，092. 1，890. 12，255. 9，647. 7，906. 22，053. 2α217. 三石42. 13，937. 5，808. C18：2. 0260. t2◎4. 1，070. 0，683. t133. 0，870. O，396. C20：4. 1，056. 1，318. 2235. t733. 2．56壌. 1，776. 0，558. t200. 2，200. 0，492. 0，427. α738. t780 tO12. C22：6. NAME. D−1. 8226. D−2. D−4. D−3. D−5. D−6. 0，730. AVERAGE STDEV. C16：0. 11，328. 9．判5. 6，512. 6，594. 9，642. 8，367. C18：0. 7，460. 壌0．226. 7，093. 7589. 9」95. 7，384. 8』58. t856 1257. 6，540. 9，016. 9」81. 12，305. 壌0．243. 2，584 0，175. C18：1. 13，800. 10，614. C18＝2. 0，804. 0，4◎4. C20＝4. t861. t166. C22：6. 1，101. 0，289. 各グループごとに平均した値を、. 8，593. 0，492. 0β90. α635. 0，545. 2，355. 0，949. 0，948. 2，029. t551. 0，607. 0，969. 0，337. 0，243. α949. 0，648. 0，397. グラフに表した. 一44一. （図4−11）◎.