Gタンパク質共役型受容体刺激応答の多様性を制御する分子メカニズムに関する研究

Gタンパク質共役型受容体刺激応答の多様性を制御

する分子メカニズムに関する研究

著者

中畑 則道

Gタンパク質共役型受容体刺激応答の多様性を

制御する分子メカニズムに関する研究

(課題番号14370737) / 平成1 4-1 5年度二     科学研究費補助金 基盤研究(B)( 2 )研究成果報告書

平成16年3月

/

研究代表者 中畑則道

(東北大学･大学院薬学研究科･教授)

Gタンパク質共役型受容体刺激応答の多様性を

制御する分子メカニズムに関する研究

(課題番号14370737) 平成1 4- 1 5年度文部科学省科学研究費補助金 基盤研究(B)( 2 )研究成果報告書

平成16年3月

研究代表者 中畑則道

(東北大学･大学院薬学研究科･教授)

目次

はしがき･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 3 研究課題･研究組織･研究経費(交付決定額)･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 4 研究発表･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ (1)学会誌論文等･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ (2)国内学会発表･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ (3)国際学会発表･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ (4)出版物(本･総説)･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 研究概要･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ : ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 13 本補助金によって遂行された研究の出版物･ ･ ･ ･ - ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ ･ 17 ●             ●             ● ●             ●             ● 4   4   7   日   ‖

はしがき

現在臨床で用いられている薬物の約半分が､ Gタンパク質共役型受容体(G protein-coupled receptor: GPCR)に作用するものであり､様々な疾病の治療薬 として応用されている｡したがって､ GPCRを介する情報伝達系を解明する ことは､新たな薬物を開発していく上でも､また薬物による副作用を防ぐ合 理的な治療法の開発のためにも重要である｡ 最近のGPCR研究の進展の結果､ 1) 1つの受容体に共役する三量体Gタ ンパク質はl種類とは限らないこと､ 2)受容体からのシグナルを制御するG タンパク質シグナル調節因子群(RGS)によってGタンパク質の活性が制御 される結果､更に情報伝達系に多様性が生まれること､ 3)受容体によっては 受容体自身がホモ二量体や異なった受容体とのヘテロ二量体を形成すること､ 4)受容体活性修飾タンパク質によって受容体の機能に変化がおこること､な どが次々に示され､古典的な概念は塗りかえられつつある｡ われわれは､ GPCRのうち､とくにトロンボキサンA2受容体(TP受容体) の細胞情報伝達機構に関する研究を行ってきた｡すなわち､ TP受容体がグリ ア細胞に存在することを世界ではじめて見出し､その受容体刺激はG｡/ホス ホリパーゼC系の活性化に伴う細胞内ca2+濃度の上昇やプロテインキナ-ゼ

Cの活性化が中心的な情報伝達機構であることを示した(Nakahata et al. EulT. J.

pharmacol. 162, 407-417, 1989･, Brain Res. 583, 1001104, 1992; Sakaiet a1., J.

pharmacol. Exp. Ther. 276, 829-836, 1996)｡一方､血小板のTP受容体刺激効果

を検討したところ､ Gqを介する凝集反応とともに､アゴニストの低濃度領域 においてはGqを介さずに形態変化が見られること､また､ MAPKを介したア

ラキドン酸遊離が引き起こされることを明らかにした(Ohkubo etal., Brit. J. pharmacol. 117, 1095-1104, 1996; Ohkubo et a1., EulT. J. Pharmacol. 298, 175-183,

1996; Ohkubo et al., Prostaglandins 52, 403-413, 1996) ｡ TP受容体には胎盤型

(TP-α)と内皮型(TP-β)の二つのスプライシングバリアント(アイソフォ

ーム)の存在が知られているが､グリア細胞にも両受容体バリアントが存在 することを明らかにするとともに､ TP受容体はGqおよびG12と共役すること

も見出した(Honma et al., Pnostaglandins 55, 1591168, 1998, Honma et aL

prostaglanditw 58, 51162, 1999)｡一方､ジブチリルサイクリックAMPで分化さ

を顕著に活性化し､そのMAPKの活性化経路にはホスフアチジルコリン特異 的ホスホリパーゼCを介したプロテインキナ-ゼCの活性化が介在すること

を見出した(Kobayashi et al., J. Neurochem. 74, 2167-2173, 2000)｡さらに､血管

平滑筋におけるTP受容体刺激による持続的な収縮反応はホスフアチジルコリ

ン特異的ホスホリパーゼCを介してもたらされることを見出した(Nakahataet

al., Eur. J. Pharmacol. 374, 157-160, 1999; Nakahata etal., Llfe Sci･ 66, PL71-76,

2000)｡以前より､血小板と血管では､ TP受容体の異なったサブタイプが発現 している可能性が示唆されていたことから､新しいTP受容体アゴニストであ るAGN192093を用いて､ウサギ血小板と血管におけるその受容体刺激効果に ついて比較した｡その結果､一般的なTP受容体アゴニストであるU46619と 相違し､ AGN192093は､血管に対しては強力な作用をするものの､血小板の 活性化能はほとんど持たず､血管と血小板のトロンボキサンA2受容体を識別 することを明らかにした(Nakatani etal.,生化学71, 1053, 1999)｡ TP-αおよび TP-BはC未部のみが異なっており､リガンド結合部やGタンバク質の結合部 のアミノ酸配列は同じであると推定されることから､アゴニストを識別する 三次構造に相違があるとすれば､受容体の三次構造を修飾する因子の存在が 推定された｡また､ TP-αとTP-βで刺激によって生じるシグナルに相違が見ら れるとすれば､それぞれの受容体C末部に依存した未知の因子によって受容 体機能が調節を受けていることが推定される｡ 以上のような背景に立ち､本研究では(1) TP-αとTP-βのシグナル伝達経路 が異なるか否か､ (2) TP受容体のC末端に結合する機能制御タンパク質を酵 母ツーハイブリッド法により探索し､それら結合タンバク質がどのような作用 を受容体機能に及ぼすか､ (3) TP受容体は受容体自身ホモ二量体あるいはヘテ ロ二量体を形成するかどうか､形成するとすればそのときのシグナルはどのよ うに変化するか､ (4)ジブチリルサイクリックAMPで処理によって形態的分 化した1321Nlヒトアストロサイト-マ細胞を､ TP受容体アゴニストで刺激す ると極めて短時間にその形態が変化するが､この変化はどのようなシグナル伝 達を介するか､などについて検討を加え､ TP受容体の多彩な生理応答の制御メ カニズムを明らかにすることを目的とした｡また､ (5) GPCRのひとつである 副甲状腺ホルモン(FrH)受容体のC末部に会合するタンパク質を探索し､そ の受容体機能に及ぼす作用について解析することにより､ GPCRに共通の制御 系とTP受容体に特異的な制御系の解析も行った｡ 4

研究課題

｢Gタンパク質共役型受容体刺激応答の多様性を制御する分子メカニズムに 関する研究｣ (課題番号14370737) :平成14-15年度文部科学省科学研究費補助 金基盤研究(B)(2)

研究組織

研究代表者 研究分担者 〝 〝 〝 中畑 則道(東北大学･大学院薬学研究科･教授) 吉田  真(東北大学･大学院薬学研究科･助教授) 大久保聡子(東北大学･大学院薬学研究科･助手) 本間 成佳(東北大学･大学院薬学研究科･教務職員) 助川  浮(東北大学･大学院医学系研究科･助教授)

交付決定額(配分額)

平成14年度   6, 700千円 平成15年度   5, 400千円 計    12, 100千円

研究発表

(1)学会誌論文等

1･ Keigo Nakatani, Norimichi Nakahata, Tsutomu Arakawa, Hideyuki Yasuda and Yasushi Ohizumi: Inhibition of cyclooxygenase and prostaglandin E2 Synthesis by Y-mangositine, a xanthone derivative in mangosteen, in C6 rat glioma cell･ Biochem. Pharmacol. 63, 73-79 (2002)

2. Haruhisa Kikuchi, Jun Komiya, Yoshinori Saito, Jun-ichi Sekiya, Shigeyoshi Honma, Norimichi Nakahata and Yoshiteru Oshima: The isolation and synthesis of

two novel N-acetylglucosamine derivatives from Dictyostelium cellular slime

molds which exhibit neurite outgrowth activity･ Tetrahedron Lett･ 43, 1477-1480 (2002)

3. Masatake Kurita, Hirobumi Mashiko, Mayumi Ra主, Tadanori Kumasaka, Sou-ichi Kouno, Shin-ichi Niwa and Norimichi Nakahata: Lithium at the …therapeutic…

concentration reduces Ca2'response in protein kinase C-down regulated human

4. Keigo Nakatani, MasanoriAtsumi, Tsutomu Arakawa, Kenji Oosawa, Susumu

shimura, Norimichi Nakahata and Yasushi Ohizumi: Inhibitions of histamine

release and prostaglandin E2 Synthesis by mangosteen, a Thai medicinal plant･ Biol. Pharm. Bull. 25, 1137-1 141 (2002)

5. Minori Saito, Satoko Ohkubo, Yutaro Obara, Teruyuki YanaglSaWa, Jun-Ichi Kobayashi, Yasushi Ohizumi and Norimichi Nakahata: Theonezolide A, a novel marine macrolide, induces drastic shape change in rabbit platelets by reorganization

of microtubules. Thr10mbosis Res. 108, 133-138 (2003)

6. Norimichi Nakahata, Chikako Tsuchiya, Keigo Nakatani, Yasushi Ohizumi and

Satoko Ohkubo: Baicalein inhibits RafJl一mediated phosphorylation of MEK-1 in C6

rat glioma cells. Eur･ J･ Pharmacol･ 461, I-7 (2003)

7. Yutaka Hirata, Masanori Atsumi, Yasushi Ohizumi, and Norimichi Nakahata: Mastoparan binds to glycogen phosphorylase to regulate sarcoplasmic reticulum

ca2'release in skeletal muscle. Biochem. J. 371, 81-88 (2003)

8. Yasuo Kodama, Lv Xiaochuan, Chikako Tsuchiya, Yasushi Ohizumi, Makoto

Yoshida and Norimichi Nakahata: Dualeffect of saikogenin D; in vitro inhibition of

prostaglandin E2 Production and elevation of intracellular free Ca2'concentration in

C6 rat glioma cells. Planta Medica 69, 765-767 (2003)

9･ Maki Sugai, Masaki Saito, Izumi Sukegawa, Yuriko Katsushima, Yoshitaka

Kinouchi, Norimichi Nakahata, TooruShimosegawa Teruyuki YanagISaWa and Jun

Sukegawa: FTH/PTH-related protein receptor interacts directly with Tctex-1

through its COOH terminus･ Biochem･ Biophyis･ Res･ Commun･ 331･ 24-31

(2003)

10. Sachiko Tsukamoto , Abder Gafur Macabalang, Keigo Nakatani, Yutaro Obara,

Norimichi Nakahata, Tomihisa Ohta: Tricholomalides A-C, new neurotrophic

diterpenes from the mushroom Tricholoma sp･ J･ Nat･ Pr10d･ 66, 1578-81(2003)

ll. Haruhisa Kikuchi, Yasuhiro Miyagawa, Yuko Sahashi, Satoshi lnatomi, Asami

Haganuma, Norimichi Nakahata and Yoshiteru Oshima: Novel splrOCyClic

trichothecanes, spirotenulpeSine A and ち, isolated from entomopathogenic fungus,

Paecilomyces tenuipes. J. Org. Chem･ 69, 352-356 (2004)

12. Takashi Konno, Shin-ya Ohnuma, Kazuhiro Uemoto, Takehiro Uchibori, Akihiko

Nagai, Kentaro Kogi, Kazuki Endo, Tomokazu Hosokawa, and Norimichi Nakahata: Effects of 2-alkynyladenosine derivatives on intraocular pressure in

rabbits. Eur. J. Pharmacol. 486, 307-316 (2004)

(2)国内学会発表 1.大久保聡子､小谷篤史､中畑則道: NGIO8-15細胞に発現するP2Y2受容体 の情報伝達における細胞膜ラフト構造の役割.第75回日本薬理学会年会(熊 本 2002年3月13日-15日) Jpn.∫.Phamacol･88, 174P(2002)･ 2.佐藤ゆかり､志村徳郎､大久保聡子､吉田真､中畑則道:新規トロンボキ サンA2受容体アンタゴニストZ-335のウサギ血小板および血管の細胞情報 伝達系および機能に対する作用.第75回日本薬理学会年会(熊本 2002 年3月13日-15日) Jpn.∫.Pharmacol･88,215P(2002)･ 3.土屋千佳子､大久保聡子､中畑則道:ダイオウおよびその構成成分の抗炎 症作用についての研究.日本薬学会第122回年会(千葉 2002年3月26日 -28日)講演要旨集(4) p29 (2002). 4.吉田 真､志村徳郎､佐藤ゆかり､大久保聡子､中畑則道:ウサギ血管お よび血小板に対する新規トロンボキサンA2受容体遮断薬Z-335の作用.第 44回日本平滑筋学会総会(仙台 2002年7月18-19日)J. SmoothMuscle Res･ 6, ∫-25 (2002). 5.佐々木雅子､助川浮､柳滞輝行､大久保聡子､中畑則道:トロンボキサン A2受容体に会合するタンパク質の解析･第53回日本薬理学会北部会(秋田 2002年9月19-20日)目薬理詰121,6P(2003). 6.本間成任､脊下愛美､大久保聡子､中畑則道:ヒトアストロサイト-マ細 胞のトロンボキサンA2受容体刺激による形態変化について.第53回日本薬 理学会北部会(秋田2002年9月19-20日)目薬理詰121,6P(2003)･ 7.永田耕一､大久保聡子､中畑則道:C6ラットグリオ-マ細胞増殖に対する アデニンヌクレオチド･ヌクレオシドの抑制機序の解析.第53回日本薬理 学会北部会(秋田2002年9月19-20日)目薬理詰121,9P(2003). 8.青木崇､小原祐太郎､大泉康､中畑則道: β-EudesmolによるPC-12細胞の 分化誘導およびノルエビネフリン遊離作用機序.第53回日本薬理学会北部 会(秋田2002年9月19-20日)目薬理詰121,9P(2003). 9.斉藤将樹､須貝異生､勝島由利子､助川泉､大久保聡子､中畑則道､柳滞 輝行､助川浮:副甲状腺ホルモン(PTH)受容体C末結合タンパク質の受 容体機能に及ぼす影響.第53回日本薬理学会北部会(秋田2002年9月19-20日)日薬理誌121, lop(2003). 10.土屋千佳子､吉田真､大久保聡子､中畑則道:ダイオウおよびその成分に ょるアラキドン酸(AA)代謝におよばす作用.第53回日本薬理学会北部 会(秋田2002年9月19-20日)日薬理誌121,lop(2003).

ll.菊地晴久,宮川泰宏,佐橋裕子,稲冨 聡,中畑則道,大島吉輝:冬虫 夏草paecilomyces tenuipesより得られた新規トリコテカンの構造と生物活 性.第44回 天然有機化合物討論会(東京:2002年10月9日-11日). 12.芳賀沼麻美､小原祐太郎､中畑則道:ステロイド様化合物cADによるグリ ア細胞からの神経栄養因子分泌作用.第41回日本薬学会東北支部大会(弘 前2002年10月13日)講演要旨集p46. 13.舟守雅子､大久保聡子､中畑則道:グリア細胞におけるカンナビノイド受 容体の解析.第41回日本薬学会東北支部大会(弘前2002年10月13日) 講演要旨集p49. 14.渥美真徳､平田 豊､大泉 康､中畑則道:マストパランによる骨格筋小 胞体からのグリコーゲンホスホリラ-ゼを介するCa2+遊離作用.第41回日 本薬学会東北支部大会(弘前2002年10月13日)講演要旨集p50. 15.斎藤将樹､掘 恵未､紺屋一美､志津里芳一､大泉 康､大久保聡子､中 畑則道: 2,5,6-Tribromogramine (TBG)によるグリア細胞からの神経栄養因子 分泌機序の解明.第75回日本生化学会大会(京都2002年10月14-17日) 生化学p817 (2000). 16.本間成任､脅下愛美､大久保聡子､中畑則道:ヒトアストロサイトマ細胞 のトロンボキサンA2受容体刺激による形態変化.第76回日本薬理学会年会 (福岡2003年3月24-26日) J. Pharmacol. Sci.91,81P(2003). 17.斎藤将樹､須貝真生､勝島由利子､助川泉､大久保聡子､中畑則道､柳浮 輝行､助川淳:細胞骨格タンパク質4.1GはPTH/PTHrP受容体の細胞表面 への局在を増強する.第76回日本薬理学会年会(福岡2003年3月24-26 日) ∫. Pharmacol. S°i. 91, 240P(2003). 18.佐々木雅子､助川浮､柳滞輝行､大久保聡子､中畑則道:トロンボキサン A2受容体に会合するタンバク質の解析.第76回日本薬理学会年会(福岡 2003年3月24-26日) ∫. Pharmacol. S°i. 91, 241P(2003). 19.土屋千佳子､大久保聡子､吉田真､中畑則道:ダイオウおよびその構成成 分によるアラキドン酸代謝におよぼす影響.第76回日本薬理学会年会(宿 岡2003年3月24-26日) ∫. Pharmacol. S°i. 91,275P(2003). 20.須貝真生､斎藤将樹､助川泉､勝島由利子､木内喜孝､中畑則道､下瀬川 徹､柳揮輝行､助川浮: FrH受容体のintemalizationには､ C末への細胞質 ダイニンTctex-1の結合が必須である.第76回日本薬理学会年会(福岡2003 年3月24-26日) ∫. Pharmacol. S°i. 91, 242P(2003). 21.呂暁川､小玉康生､大泉康､吉田真､中畑則道:サイコゲニンDによるC 6細胞における細胞内ca2+濃度上昇作用.日本薬学会第123年会(長崎2003 年3月27-30日) . 8

22.舟守雅子､大久保聡子､中畑則道:グリア細胞におけるカンナピノイドの 薬理作用の解析.日本薬学会第123年会(長崎2003年3月27-30日). 23.村田篤信､大久保聡子､佐藤ゆかり､舟守雅子､菊地晴久､谷津正晃､古 城健太郎､佐藤進､只野武､大島吉輝､中畑則道:キクラゲ抽出物のアデ ノシンデアミナーゼ抵抗性血小板凝集抑制作用.日本薬学会第123年会(長 崎2003年3月27-30日) . 24.青木 崇､小原祐太郎､中畑則道:蒼苑成分β-ユーデスモールの神経機能 に及ぼす影響.第5回応用薬理シンポジウム(岡山2003年8月29-30日) 要旨集p51.. 25.三代沢勝利､佐々木雅子､大久保聡子､中畑則道:トロンボキサンA2受容 体アイソフォームのシグナル伝達の相違について.第54回日本薬理学会北 部会(仙台2003年10月2-3日)講演要旨集p81. 26.稲垣和幸､佐々木雅子､三代沢勝利､大久保聡子､吉田真､中畑則道:強 制発現トロンボキサンA2受容体の機能におよぼす各種アンタゴニストの作 用の検討.第54回日本薬理学会北部会(仙台2003年10月2-3日)講演要 旨集p82. 27.斉藤将樹､篠原由紀､稲田洋一､中根登紀男､千葉茂俊､吉田真､中畑則 道: pC-12細胞における2型アンギオテンシン受容体(AT2)の発現調節機序. 第54回日本薬理学会北部会(仙台2003年10月2-3日)講演要旨集21. 28.芳賀沼麻美､小原祐太郎､中畑則道:グリア細胞からの神経栄養因子分泌 におけるPKCeの介在.第54回日本薬理学会北部会(仙台2003年10月2-3日)講演要旨集p52. 29.神山幸恵､斉藤真也､丸山由貴子､中畑則道､大泉康:麻黄によるIgE介 在性アレルギー反応抑制効果-RBL2H3細胞におけるヒスタミン放出抑制 およびcAMP含量の増加作用.第54回日本薬理学会北部会(仙台2003年 10月2-3日)講演要旨集p29.

30. Masaki Saito, Maki Sugai, Izumi Sukegawa, Yuriko Katsushima, Norimichi

Nakahata, Teruyuki YanaglSaWa and Jun Sukegawa: Augmentation of parathyroid hormone (PTH) receptor to cell surface localization by cytoskeletal protein 4･lG･

第76回日本生化学会大会(横浜 2003年10月15日-18日)生化学75,1144.

31. Masako Sasaki, Jun Sukegawa, Teruyuki Yanagisawa, Satoko Ohkuboand Norimichi Nakahata: IdentiflCation of proteasome subunit α7and proteasome

activator PA287 as thromboxane A2 reCePtOr (TP)-associated protein.第76回日

本生化学会大会(横浜 2003年10月15日-lS日)生化学75,1144.

容体の役割について.第42回日本薬学会東北支部大会(仙台2003年10月 19日)講演要旨集p36. 33.小池延幸､佐々木雅子､大久保聡子､中畑則道:アデノシンA2人受容体の 細胞膜局在とシグナル伝達.第42回日本薬学会東北支部大会(仙台2003 年10月19日)講演要旨集p37. 34.吉田虞英､舟守雅子､大久保聡子､中畑則道:ケラチノサイトのATP受容 体について.第42回日本薬学会東北支部大会(仙台2003年10月19日) 講演要旨集p37. 35.青木崇､小原祐太郎､中畑則道: β-Eudesmolが神経機能に及ぼす影響と そのメカニズム.第42回日本薬学会東北支部大会(仙台2003年10月19 日)講演要旨集p38. 36.本間成任､脅下愛美､大久保聡子､中畑則道:アストロサイト-マ細胞の トロンボキサンA2受容体刺激による形態変化について.第8回グリア研 究会(名古屋10月25日)プログラムp39. 37.佐々木 雅子､三代沢勝利､助川浮､柳沢輝行､大久保聡子､中畑則道: トロンボキサンA2受容体アイソフォームはプロテアソームにより異なる制 御を受ける.第77回日本薬理学会年会(大阪2004年3月 8-10日) ∫. PharmacoI Sci. 94, 98P (2004). 38.吉田 真､ punnee Nusuetrong､中畑則道:サトラトキシンHによるアポト ーシスにおける活性酸素およびMAPキナ-ゼの関与.第77回日本薬理学 会年会(大阪2004年3月8-10日) ∫. PharmacoI Sci.94, 135P(2004). 39.斎藤 将樹､柳沢輝行､助川浮､中畑則道: prH/PTHrP受容体の細胞内局 在変化とシグナル伝達に対する細胞骨格タンパク質4.1Gの役割.第77回

日本薬理学会年会(大阪2004年3月8-10日)I. PharmacoI Sci. 94, 137P(2004).

40.舟守 雅子､大久保聡子､中畑則道: 1321Nlヒトアストロサイト-マ細胞 におけるカンナビノイド誘発性アポトーシス.第77回日本薬理学会年会(大 阪2004年3月8110日) J. PharmacoI Sci. 94, 283P(2004). 41.芳賀沼 麻美､小原祐太郎､中畑則道: CAD, 5,19-cycl0-9β,10三一 androstane-3,17ldione,によるプロテインキナ-ゼC- 6およびtを介するグ リア細胞における神経栄養因子生合成の促進.第77回日本薬理学会年会(大 阪2004年3月8-10日) ∫.PhmacoI S°i.94,284P(2004). 42.鳥庭靖文､呂暁川､吉田真､中畑則道:サイコゲニンDによるPGE2産生 抑制のメカニズム.日本薬学会第124年会(大阪2004年3月29日-31日). 43.三代沢勝利､佐々木雅子､大久保聡子､中畑則道:トロンボキサンA2受容 体アイソフォームのシグナル伝達の相違.日本薬学会第124年会(大阪2004 10

年3月29日-31日) .

く3)国際学会発表

1. Satoko Ohkubo, Atsushi Kotaniand Norimichi Nakahata.･ Lipid ra允 domains in

NG 1 08- 1 5 cells;the role in P2Y2 reCePtOr-mediated intracellularCa2+ mobilization･

ⅩⅠ血 Wbrld Congress or Phamacology (Sam Francisco) 2002.7.7-12

(Phamacologist 44, A68, 2002)

2. Yutro Obara, Tomihisa Ohta, Yasushi Ohizumi and Norimichi Nakahata:

Scabronines enhance synthesisand secretion of neurotrophic factors fTrom huma

astrocytoma cells, accompanied by the activation of PKC-ち. XIth World Congress

ofPharmacology (San Francisco) 2002.7.7-12 (Phamacologist 44, Al 10, 2002)

3. Norimichi Nakahata, Shigeyoshi Honmaand Satoko Ohkdbo: Thromboxane

A2-induced morphological change of 1321Nl human astrocytoma cells treated with

dibutyryl cyclic AMP. XIth World Congress of Phamacology (San Francisco)

2002.7.7-12 (Phamacologist 44, A136, 2002)

4. Yutaka Hirata, Masanori Atsumi, Norimichi Nakahata, Jiying Zhaoand Jianjie Ma: Mastoparanactivates skeletal muscle ryanodine receptor Ca2+ release cha-el

through binding to glycogen phosphorylase･ Biophysical Society47thAmual

Meeting (Sam Antonio, TX ) 2003.3.1-5

5. Masaki Saito, Maki Sugai, Izumi Sukegawa, 1山riko Katsushima, Norimichi Nakahata, Teruyuki YanaglSaWa and Jun Sukegawa: Ligand-induced intemalization of parathyroid horTone (PTH)仲TH-related protein receptor

requlreS a mOtief on its COOH temlnuS that i山eracts w仙a cytoplasmic dynein light chain, Tctex-1･ The 4th Intemational Symposiumon Receptor Mechanism

Signal Transductionand Drug EtfTects (Fukui) 2003.5. (Abstract 1 16, 2003)

(4)出版物(本･総説)

1. Yutaro Obaraand Norimichi Nakahata: The Signaling Pathway of Neurotrophic

Factor Biosynthesis. Drug Newsand Perspective l15(5), 290-298 (2002)

2.中畑則道､大久保聡子:脂質ラフトとその解析法.日薬理誌122, 419-425

(2003)

3.中畑則道:くすりと健康.HitachiITUser470(9),4-7(2003)

4.中畑則道:細胞情報伝達系への影響より評価した三貴清心湯の作用.薬学

雑誌123, S叩pl. 3, 32-35 (2003) 5.吉田真､呂暁川､小玉康生､大泉 康､中畑則道:サイコゲニンDのグリ ア細胞に対する作用.薬学雑誌123, suppl. 3, 78-81 (2003) 6.青木幸一､神山幸恵､山国徹､斉藤真也､丸山由貴子､中畑則道､大泉康: 麻黄によるNF-I(B依存的転写およびヒスタミン放出の抑制.薬学雑誌123, suppl. 3, 74-77 (2003) 12

研究成果の概要 (1)胎盤型(TP-α)と内皮型(TP一β)のトロンボキサンA2受容体のシグナ ル伝達系の相違 ヒトTP受容体のスプライシングバリアントであるTP-αおよびTP-βのcDNA を作成し､それらをCHO細胞にトランスフェクションして､二つの受容体の 情報伝達系の相違について検討した｡ TP-αおよびTP-βのアミノ酸配列はC末 端のみが異なっており､ TP-αのC未部の15アミノ酸がTP-βでは異なる79ア ミノ酸に置き換わっている｡受容体のC末部は細胞内領域であることから､TP-α およびTP-βのリガンド結合部位は同じであると考えられている｡ TP受容体を 一過性に発現させた細胞において､ TP受容体刺激によるホスフアチジルイノシ トール水解反応がTP-αに比べてTP-βにおいて弱いことが見出された｡この原 因の一つは､細胞内輸送における受容体の細胞膜への移行がTP-αおよびTP-β では相違し､ TP-βは細胞膜に移行し難いことが考えられる｡一方､ TP-αあるい はTP-βを安定発現させ､同程度のホスフアチジルイノシトール水解反応を示す クローンを選択して解析した結果､ Gqを介するホスフアチジルイノシトール 水解反応は両アイソフォームで同様に現れるものの､ Gsを介したサイクリック AMP生成系およびMAPKの活性化に相違が見られることが明らかになった (Miyosawa et al. :日本薬理学会北部会要旨集p81, 2003)｡これらの結果は､ TP-αあるいはTP-βの刺激によって引き起こされるシグナル伝達は相違すること が示されており､ C未部がシグナル伝達に極めて重要な役割を果たしているこ とを示している｡ (2)トロンボキサンA2受容体のC末端に会合する機能制御タンパク質の酵母 ツーハイブリッド法による探索と､それら会合タンパク柴の機能 TPと直接相互作用するタンパク質を同定するために､胎盤型(TP-α)およ び内皮型(TP-β)のTP cDNAのC末部分を作成し､酵母を用いたtwo hybrid システムによって､それぞれのC末部分と相互作用を示すタンパク質をヒト脳 cDNAライブラリから探索した｡その結果､プロテアソームサブユニットα7お よびプロテアソームアクチベーターFA287がTP-βのC末部と強く会合すること

を見出した(Sasaki et al. I. PharmcoL. Sci. 91, 241P, 2003)｡ TPαあるいはTPβ

のC末部をGST融合タンパク質として､また､ α7およびFA287をS tag融合 タンパク質として大腸菌で作製し､それらの結合をpull down assayにて検討し

た｡その結果､ α7およびFA28†はTP-αとはあまり結合せずにTP-βのC未部と 強く会合することが確認された｡さらにTP-βのC末部の欠失体を作製し､結 合部位の解析をしたところ､ TP-βのC末部の326番目から352番目のアミノ酸残 基がα7およびFA287との結合に重要であることが明らかになった｡なお､ TP-β のC未部の339番目のチロシンは会合には大きな意味を持っていなかった｡こ れらプロテアソーム関連タンバク質がGPCRに直接結合することを本研究にお いてはじめて見出した｡ 一方､プロテアソーム阻害薬MG-132はTP-αおよびTP-βの細胞膜発現に異 なった作用を示した｡すなわち､ TP-αおよびTP-βを安定発現させたCHO細胞 をMG-132で処理すると､ TPアンタゴニストの【3HISQ29548の細胞表面への結 合がTP-α発現細胞でのみ劇的に増加し､ TP-β発現細胞ではほとんど変化しなか った｡このTP-α受容体タンパク質の細胞膜における増大は､ TP-αmRNAレベ

ルの顕著な増加を伴って現れた(Sasaki et al. J. Pharmcol. Sci. 94, 98P ,

2004)｡さらに内因性にTP-αおよびTP-βを発現している1321Nlヒトアストロ サイト-マ細胞においても､プロテアソーム阻害薬によってTP-αmRNAのみ が増大した｡これらの結果は､プロテアソームによってTP受容体の発現が調 節され､その調節はアイソフォーム依存的であることを示しており､今後の興 味ある研究対象である｡ (3)トロンボキサンA2受容体の二量体化あるいは多量体化の解析 トロンボキサンA2受容体のスプライシングバリアントであるTP-αおよび TP-βを可視化できるように､それぞれにFLAGタグおよびHAタグを付加した

cDNAを含むプラスミドを作成した｡すなわち､ FLAG-TP-α､ FLAG-TP-β､

HA-TP-αおよびHA-TP-βの4つのプラスミドを作成した｡異なったタグのプラ スミドをHEK293細胞に共発現させ､ 1% Triton X-100を含むバッファーにて可 溶化した後､抗HA抗体にて免疫沈降し､電気泳動をした後､抗FLAG抗体で ウエスタンブロッテイングを行った｡その結果､ FLAG-TP-cLとHA-TP-αを共発 現させた場合には､高分子量にFLAG抗体に反応するバンドが確認されたこと から､ TP-α同士が会合している可能性が示唆された｡強度は弱いものの､ TP-α とTP-β､ TP-βとTP-βの組み合わせでも会合体が認められたoこのトロンボキ サンA2受容体同士の会合は､生理的にどのような意味を持っているのかは十分 には理解されていないことから､受容体刺激時における会合体の変化や､シグ 14

ナルの伝達における受容体多量体化の意義などを今後明らかにしていくことが 必要であると思われる｡ (4)ジブチリルサイクリックAMP処理1321ヒトアストロサイトーマ細胞に おけるトロンボキサンA2受容体刺激による形態変化のシグナル伝達 ジブチリルサイクリックAMPで処理したヒトアストロサイト-マ細胞では TP受容体刺激によって形態変化が引き起こされるが､そのシグナル伝達系につ いて解析を行った｡ TP受容体刺激による形態変化は､ TP受容体遮断薬の sQ29548によって抑制された｡また､ムスカリニック受容体やHlヒスタミン 刺激によって形態変化が起こらないことからGq/PLPLCの経路以外のシグナル 伝達が関与しているものと思われた｡一方､この形態変化はNa+/H+交換系阻害 薬の やRhoキナ-ゼ阻害薬のY27632によって抑制されたが､ MAPK阻害薬 のPD98059によっては抑制されなかった｡ C3毒素によってもTP受容体を介 する形態変化は抑制されることから､そのシグナル伝達には低分子量Gタンパ ク質のRhoの介在が推定された｡実際にRhoの活性型であるGTP型の量がTP 受容体刺激によって増加した｡次に､ GcL.2およびGq.,の機能を抑制するC末 ペプチドを発現する遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクターを用いて､ TP を介する形態変化のシグナルの解析を行った｡その結果､ Gqに加えてG.2ファ ミリーのGタンパク質系も重要なシグナル伝達系であり､ TP受容体を介する アストロサイト-マの形態変化はG12ファミリーのGタンバク質を介し､低分 子量Gタンパク質Rhoを介する反応である可能性が示唆された(Honmaetal. I. Pharmcol. Sci. 91, 8lP, 2003) ｡ (5)副甲状腺ホルモン(PTH)受容体のC未部に会合するタンパク質の探索 と､それら会合タンパク質の機能 FrH受容体のC末に会合するタンパク質を酵母ツーハイブリッド法にてヒト 脳cDNAライブラリイから探索した｡その結束､ Tctex-1と4.1Gを見出した｡ Tctex_1は14 kDaの分子量を持つ細胞質ダイニン複合体を形成するタンパク質 であり､ 4.1Gは細胞膜の裏打ちタンパク質である｡ PrH受容体C未部の欠失 体を作製し､ Tctex-1との結合を解析した結果､ 478番目から511番目のアミノ 酸残基が重要であることが明らかになった｡その配列中の486番目のK､ 488 番目のR､ 500番目のV､および501番目のSをAに変換したKRVSを作製し 15

たが､この変異体はTctex-1との結合能力を失っていた｡ KRVS変異PTH受容

体を発現させた細胞においては､受容体刺激による受容体のインターナリゼ-ションが起こりずらくなっていた｡すなわち､ Tctex-1はFrH受容体に直接結

合して受容体のインターナリゼ-ションに寄与しているものと推測された

(sugai et al. Biochezzl. Biophyis. Res. Co皿皿un･ 331, 24-31, 2003)｡一方､ 4･lG

はPTH受容体の細胞膜への固定化をもたらし､細胞膜表面の受容体数を増加さ せるとともに､ FrH受容体を介するシグナル伝達であるMAPKのリン酸化な

どの促進作用をもたらした(Saitoet al. J. PhamcoL Sci. 94, 137P , 2004)｡

したがって､ 4.1GがpTH受容体の機能制御に重要な役割を担うことをはじめ て見出した｡ まとめと将来の展望 以上のように本研究においてGPCRの多彩なシグナル伝達調節系のいくつか を新たに明らかにした｡すなわち､ 1) TP-αあるいはTP-βの刺激によって引き 起こされるシグナル伝達は相違し､ C未部がシグナル伝達に極めて重要な役割 を果たしていること､ 2) TP-βのC未部はTP-αと相達し､プロテアソームサブ ユニットα7およびプロテアソームアクチベーターpA287が比較的特異的に結合 すること､ 3)プロテアソーム阻害薬はTP-αタンパク質をそのmRNAの発現 を介して増加させ､ TP-βには影響を与えないこと､ 4) TP-qおよびTP-βは二 量体を作って存在する可能性があること､ 5)ヒトアストロサイト-マ細胞にお けるTP受容体刺激による形態変化は､ G12ファミリーのGタンパク質および低 分子量Gタンパク質Rhoを介すること､ 6)副甲状腺ホルモン(PTH)受容体 C末部に結合するTctex-1と4.1Gを見出し､それぞれ受容体のインターナリゼ -ションと細胞膜への保持に関与することを明らかにした｡ 本研究結果は生物学的に重要なGPCRのいくつかの機構を解明する必要性を 示唆している｡たとえば､ GPCRのC末のシグナル伝達における意義､受容体 発現におけるプロテアソームの役割､スプライシングバリアント生成の制御機 構､受容体の多量体化の生理的な意義､ GPCRが各種Gタンパク質と共役する ときの条件とその制御機構､ GPCRの細胞内局在の制御の分子メカニズムの解 明､などが挙げられる｡今後これらの課題を解決することを通して､ GPCRの 機能発現とその制御機構を明らかにし､より有効な薬物の開発が期待される｡ 16

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