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様式5
論 文
内
容
要
旨
題 目 : シ ェー グ レ ン 症 候 群 疾 患 モ デ ル マ ウスにおけるエス トロジ ェ ン の役 割 著 者 : 石 丸 直 澄内容要旨(和文約
1
，5
0
0
字)
自己免疫疾患の発症に性差が存在することはよく知られているが、その詳細なメ カニズ ム に 関 し て は 全 く 不 明 で あ る。シェーグレン症候群疾患モデル NFS/sldマウスにおいて も 雌優位に自己免疫性唾液腺炎・涙腺炎を発症することから、本研究は本モデルマウスにお ける自己免疫病変の発症におけるエストロジェンの役割を詳細に解析し、性差のメカニズ ムを解明することを目的とする。 NFS/sJd雌 マ ウ ス に 生 後3
日目に胸腺を摘出 (Tx) した後、卵巣摘出 (Ovx)を施し、 自 己免疫病変の動態、免疫調節系への影響を観察し、さらに、 Tx+Ovxマウスへのエストロ ジェン，そのアンタゴニス ト ( タ モ キ シ フ ェ ン ) や テ ス ト ス テ ロ ン の 投 与 に よ る 病 態 の 変 動を+食言すした。また、i
n
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i
v
o
及 び invjtro~こおけるエフェクター細胞のエストロジェンに 対する反応性・エストロジェンレセプターの発現について検索したO 加えて、エストロ ジ ェンが標的臓器に及ぼす影響を腺組織破壊という観点から解析した。 シェーグレン症候群疾患モデル NFS/sJdマウスにおいて、Ovxを施すことにより、自己免 疫 病 変 は さ ら に 増 悪 す る こ と が 判 明 しt
:
.
0 そ の 病 変 局 所 に お い てCD4陽性T細 胞 の 浸 潤 が 主体を成し、各種炎症性サイトカイン (IL-Is，]し4，IL-7， TNF-α)の産生充進が認められ た。Tx+Ovxによる変化として、 T細胞系では Txマウスに比較して牌細胞中の CD8陽性細胞 の有意な低下が認められ、 B細胞系では唾液腺特異的な自己抗原 (α-fodrin)に対する自己抗 体 の 産 生 が 允 進 し て い た。また、 Tx+Ovxに よ っ て 増 悪 し た 自 己 免 疫 病 変 は エ ス ト ロ ジェ ン 投 与 に よ り 回 復 し 、 エ ス ト ロ ジ ェ ン が 自 己 反 応 町 細 胞 の 活 性 化 を 抑 制 す る 作 用 の あ る ことが判明した。そのメカニズムのーっとして、i
n
vjtro~こおいて CD8 陽性細胞がエストロ ジェンに対して有意に反応し、エストロジェンレセプターの強い発現が認められたことか ら、レセプターを介した CD8陽性細胞のサプレッサー機能をエストロジェンが制御してい る可能性が示唆された。さらに、 adoptive transferにより CD4陽性細胞が直接病態形成を調 節 す る こ と が 判 明 し た。一 方 、 標 的 臓 器 で あ る 唾 液 腺 の 組 織 破 壊 の メ カ ニ ズ ム にFasjFas Ligand( FasL)を介したアポトーシスが関与し、エストロジェンは唾液腺細胞の Fぉ発現及び 浸潤Tリンパ球の FasL発 現 の 両 者 に 影 響 を 与 え て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た。本実験系から 得られた結果はヒトの自己免疫疾患発症における性差のメカニズムを解明する上で有用で、 あり、シェーグレン症候群の病因に基づいた治療法の開発に重要な知見をもたらすものと 考えられた。。
シェーグレン症候群疾患モデルマウス
におけるエストロジェンの役割
著 者 :
石 丸 直 澄
所 属 :
徳島大学歯学部口腔病理学講座
(
主
任 : 林 良 夫 教 授
)
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論 文 表 題 著 者 名 所 属 キ ー ワ ー ド 1 . 原 著
2
.原 稿 総 枚 数3
. 連 絡 先ァーーーーーー一一ー-ーーで
二
.
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一
シ ェ ー グ レ ン 症 候 群 疾 患 モ デ ル マ ウ ス に お け る エ ス ト ロ ジ ェ ン の 役 割石 丸
直 澄 徳 島 大 学 歯 学 部 口 腔 病 理 学 教 室(主
任 : 林
良 夫 教 授 ) 自 己 免 疫 疾 患 、 シ ェ ー グ レ ン 症 候 群 エ ス ト ロ ジ ェ ン 、 N F S / s l d マ ウ ス 4 3枚 (表 題 l枚 、 本 文 2 8枚、 文 献 7枚 、 図 の 説 明 5枚、 英 文 抄 録 2枚 )表
2枚 図 1 2枚，
石 丸
直 澄 徳 島 大 学 歯 学 部 口 腔 病 理 学 講 座緒 己 自 己 免 疫 疾 患 の 多 く は 中 年 以 降 の 女 性 に 高 頻 度 に 発 症 す る こ と が よ く 知 ら れ て い る が そ の 発 症 の メ カ ニ ズ ム と 性 差 と の 関 連 性 に つ い て は 不 明 な 点 が 多 い 。 従 来 ま で 、 全 身 性 エ リ ト マ ト ー デ ス の モ デ ル で あ る NZB川Z W Flマ ウ ス お よ び 肘fRL/Jpfマ ウ ス 、 多 発 性 硬 化 症 の モ デ ル で あ る Lewisラ ッ ト や SJL/Jマ ウ ス 慢 性 関 節 リ ウ マ チ の モ デ ル で あ る B10:RlIIマ ウ ス 、 I型 糖 尿 病 の モ デ ル で あ る non-obasediabetic(NOD)マ ウ ス な ど の 自 己 免 疫 疾 患 の モ デ ル 動 物 を 用 い て 性 ホ ル モ ン と 病 態 発 症 と の 関 連 性 に つ い て 多 く の 報 告 が な さ れ て い る ト 8)。 そ の 中 で 女 性 ホ ル モ ン で あ る エ ス ト ロ ジ ェ ン カ {1 L -6 、 1 L -1、 T N F ー σ 、 1N F -y な ど の サ イ ト カ イ ン の 産 生 パ タ ー ン や 抗
o
N A 抗 体 な ど の 自 己 抗 体 の 産 生 に 影 響 し 、 自 己 免 疫 病 変 を 大 き く 修 飾 す る こ と が 知 ら れ て い る 6 ・ 7 )。 ま た 自 己 免 疫 性 涙 腺 炎 の モ デ ル h侭L
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マ ウ ス で は 男 性 ホ ル モ ン で あ る テ ス ト ス テ ロ ン を 十 支 与 す る こ tと に よ り 、 病 変 が 劇 的 に 回 復 し た と い う 報 告 も あ る 8)。 し か し 自 己 免 疫 病 変 の 発 症 機 構 に 関 与 す る エ ス ト ロ ジ ェ ン の 役 割 に つ い て 組 織 レ ベ ル 細 胞 レ ベ ル 遺 伝 子 レ ベ ル に お け る 分 子 病 理 学 的 な 詳 細 な 解 析 を 加 え た 報 告 は み ら れ な い 。 ン エ ー グ レ ン 症 候 群 (Sjりgren'ssyndrome: 以 下 SSと 略 ) は、 2一
一
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孟
二
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] 9 3 3年 ス ウ ェ ー デ ン の 眼 科 医 ・ シ ェ ー グ レ ン に よ り 最 初 に 記 載 さ れ た 慢 性 唾 液 腺 炎 ・ 乾 燥 性 角 結 膜 炎 に よ る 乾 燥 症 候 群 を 主 徴 と す る 難 治 性 の 自 己 免 疫 疾 患 で あ る 。 こ の
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に お い て も 中 年 以 降 の 女 性 に 好 発 す る こ と は 既 に よ く 知 ら れ て い る 。 55の モ デ ル 動 物 と し て 、 NZB州Z WFlマ ウ ス 、 MRUlprマ ウ ス 、NOD
マ ウ ス な ど の 他 の 自 己 免 疫 疾 患 の モ デ ル に 55類 似 の 自 己 免 疫 性 唾 液 腺 炎 お よ び 涙 腺 炎 が 随 伴 す る こ と 、 あ る 種 の 系 統 の 老 化 マ ウ ス に 自 己 免 疫 性 唾 液 腺 炎 が 発 症 す る こ と 、 な ど が 報 告 さ れ て い る が ト I3 )、 い ず れ も 臓 器 特 異 性 と い う 重 要 な 点 に 関 し て は 不 十 分 な 疾 患 モ デ ル で あ っ た 。 19 9 4年 、 当 教 室 で 確 立 さ れ たNF
5
1
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1
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マ ウ ス は 、 生 後 3 日 目 の 胸 腺 摘 出 に よ り 雌 優 意 に 唾 液 腺 ・ 涙 腺 に 限 局 し た 病 変 を 発 症 し 、 他 臓 器 に は 病 変 を 認 め な い 臓 器 特 異 的 な 原 発 性 ヒ トSS
に 極 め て 類 似 し た 疾 患 モ デ ル と し て 重 要 で あ る I4 )。 本 研 究 で は 、S
S
疾 患 モ デ ルN
F
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マ ウ ス を 用 い 、 自 己 免 疫 病 変 の 発 症 に お け る エ ス ト ロ ジ ェ ン の 役 割 を 解 析 す る 目 的 で 、 卵 巣 摘 出 に よ る 唾 液 腺f
t
戻 腺 組 織 に お け る 自 己 免 疫 病 変 の 病 態 形 成 へ の 影 響 全 身 の 免 疫 系 へ の 影 響 、 卵 巣 摘 出 マ ウ ス へ の エ ス ト ロ ジ ェ ン 投 与 に よ る 病 態 の 変 動 な ど に つ い て 検 討 し た 。 ま た 、 invitroに お け る エ フ エ ク タ ー 細 胞 の エ ス ト ロ ジ ェ ン に 対 す る 反 応 性 お よ び エ ス ト ロ ジ ェ ン レ セ プ タ ー の 発 現 に つ い て 検 索 し た 。 さ ら に 、 標 的 臓 器 に お け る 自 己 免 疫 病 変 の 発 3症 に 及 ぼ す エ ス ト ロ ジ ェ ン の 影 響 を 腺 組 織 破 壊 と い っ 観 点 か ら も 解 析 を 加 え た 。
4
4
実 験 材 料 と 実 験 方 法 1 . 動 物 お よ び 処 置 NFS/sJdマ ウ ス は 実 験 動 物 中 央 研 究 所 (111 崎 ) よ り 購 入 し 、 放 射 線 滅 菌 試 料 CL-2( 日 本 ク レ ア 社 、 東 京 ) 、 滅 菌 水 を 常 時 与 え 、 SPF(Specific pathogen-free)下 で 繁 殖 飼 育 し た。
雌
NFS/sldマ ウ ス を 用 い 生 後3
日 目 に 胸 腺 摘 出 ( 以 下T
x
と 略 ) を 施 し 4 週 齢 に て 卵 巣 摘 出 ( 以 下 Ovxと 略 ) を 行 っ た 。2
. 実 験 群 生 後 8 週 齢 ・ 12週 齢 ・ 16週 齢 ・ 2 0週 齢 に お い て 、 Tx マ ウ ス と Tx+Ovxマ ウ ス と を 各 群 5・ 7匹 を 用 い て 比 較 し た 。 ま た 、 Tx+Ovxマ ウ ス に 生 後 4週 齢 か ら 8週 齢 ま で 6 0 mg!kglweekの エ ス ト ロ ジ ェ ン (Ovahormine depo: 帝 園 臓 器 東 京 ) を 筋 肉 内 投 寺 、 2 5 mg!kgldayの テ ス ト ス テ ロ ン (和 光 純 薬 、 大 阪 ) ・2 . 5 mg!kgldayの タ モ キ シ フ エ ン (Research Biochemica1s IntemationaI， Natick， MA， USA) を 皮 下 投 与 し 、 8週 齢 で 比 較 検 討 し た o 対 照 と し て 、 オ リ ー ブ オ イ ル (和 光 純 薬 ) の 皮 下 投 与 群 を 用 い た 。 エ ス ト ロ ジ ェ ン 、 テ ス ト ス テ ロ ン 、 タ モ キ シ フ ェ ン 投 与 群 を 、 そ れ ぞ れ Tx+Ovx+E，群 (n=5) Tx+ovx+Tes群 (n=5)， Tx+ T如1群 (n=5) と 略 す 。 ま た 、 正 常 対 照 群 と し て B札 B/cマ ウ ス を 適 宜 使 用 し た 。3
病 理 組 織 学 的 検 討 雌 Tx マ ウ ス お よ び Tx+Ovxマ ウ ス を8
週 齢 か ら 20
週 齢 ま で 経 時 的 に 屠 殺 し 、 全 身 諸 臓 器 を 採 取 し た o 各 臓 器 5は 10 % 中 性 緩 衝 ホ ル マ リ ン に て 固 定 し 、 軟 パ ラ フ イ ン 包 埋 後 、 4 11 m の 組 織 切 片 を 作 成 し ヘ マ ト キ シ リ ン エ オ ジ ン 染 色 (以 下 H.E染 色 と 略 ) を 施 し た 。 唾 液 腺 お よ び 涙 腺 に お け る 炎 症 性 病 変 の 組 織 学 的 評 価 は 以 下 に 示 す 如 く 、 Whiteら の 分 類 I 5 )に 準 じ た 。
G
r
a
d
e
0
:浸 潤 巣 を 認 め ず 。G
r
a
d
e
1
:倍 率150
倍 で 、20
個 以 上 の 単 核 細 胞 よ り な る 浸 潤 巣 がl
視 野 中 に1 - 5
個 認 め る 。G
r
a
d
e 2
同 様 に 浸 潤 巣 が5
個 以 上 認 め ら れ 、 実 質 の 破 壊 を イ 半 わ な い 。G
r
a
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e 3
: 浸 潤 巣 は 多 数 認 め ら れ 、 実 質 の 中 等 度 の 変 性 破 壊 を 伴つ
。
G
r
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e
4
:多 数 の 浸 潤 巣 に よ り 著 し い 実 質 の 破 壊 を 伴、
っ
。
4
.免 疫 組 織 化 学 的 観 察 各 種 リ ン パ 球 表 面 抗 原 の 検 出 を 免 疫 組 織 化 学 的 手 法 ア ピ ジ ン ・ ビ オ チ ン ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 複 合 体 法a
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;
以 下 ABC法 と 略 ) 守 よ り 実 施 し た o 唾 液 腺 組 織 の 凍 結 切 片 を 作 成 し 、 内 因 性 ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 活 性 を 阻 止 す る た め 、o.
3%
(容 量 / 容 量 ; 以 下 V N と 略 ) 過 酸 化 水 素 水 を 含 む エ タ ノ ー ル で 処 理 し 、 リ ン 酸 緩 衝 生 理 食 塩 水 (P
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;
以 下PBS
と 略 、pH
7 . 0 ) で 洗 浄 し た 後 、 至 適 濃 度 に 希 釈 し た 各 種 1 次 抗 体 と 室 温 に て1
時 間 反 応 さ せ た 。2
次 抗 体 と し て ビ オ 6チ ン イヒ抗 マ ウ ス 抗 体 (Vector Laboratories、Inc.，Burlingam， CA， USA) を
用 い 、 室 温 に て 3 0分 間 反 応 さ せ た 後 、 A
8
C 試 薬 (Yector Lavoratories， Inc.) と 反 応 さ せ 、 3、 3-ジ ア ミ ノ ベ ン チ ジ ンSigma， 1nc.， S Lt. uis， Mo， USA) を 用 い て 発 色 さ せ た 。 各 種 の 抗 マ
ウ ス モ ノ ク ロ ー ナ ル l 次 抗 体 は 抗 Thy1.2，抗L3T4(CD4)，抗Lyt2
(CD8) (Becton Dickinson 1nc.， San Jose， Ca， USA)、抗B220，抗MHCclassII(I-Aq) Pharmingen， 1nc.， San Diego， CA， USA)を 使 用 し た 。
5 . フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー (FACS)解 析 各 群 マ ウ ス を 屠 殺 後 、 直 ち に 牌 臓 を 摘 出 し 、 2% (VN) Fetal calf serum (FCS)含 有 PBS中 で ホ モ ジ ナ イ ズ し 、 ト リ ス 塩 化 ア ン モ ニ ウ ム 溶 液 (Tris-HCI， pH8 . 0お よ び
o
.
8 3 % 塩 化 ア ン モ ニ ウ ム 1 :9
混 合 溶 液 ) 処 理 に よ り 溶 血 さ せ 、 洗 浄 後 1 X 1 0 6個 に 調 製 し た 。 以 下 に 示 す 各 種 抗 体 と 反 応 さ せ た 後 に 、 細 胞 自 動 解 析 装 置 (EP1CS，Coulter， Miami， FL， USA )を 用 い て 解 析 し た 。 PE標 識 抗 マ ウ ス CD4(L3T4)モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 (CedarLane Laboratories Ltd. Ontario， Canada) F1TC標 識 抗 マ ウ ス CD8(Ly 2) モ ノ ク ロ ナ ル 抗 体 (Ced紅 Lane Laboratories Ltd.) F1TC標 識 抗 マ ウ ス CD44，CD45RB， Mel-14モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 (Pharmingen， 1nc.) ビ オ チ ン 標 識 坑 Fasモ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 (Pharmingen，Inc.)抗 Fasポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 体 (SantaCruz Biotechnology， Inc.， Santa Cruz，
CA， USA)
6
. リ ン パ 球 分 画 分 離 法雌
NFS/sldマ ウ ス よ り 摘 出 さ れ た 牌 臓 か ら リ ン パ 球 浮 遊 液 に 調 製 し 、 T 細 胞 分 離 用 ナ イ ロ ン ウ ー ル (和 光 純 薬 ) と イ ム ノ マ グ ネ テ ィ ッ ク ビ ー ズ (Oynal，CA， USA) に よ り C04陽 性 お よ び CD8陽 性 T 細 胞 を 分 離 し 、 細 胞 増 殖 反 応 、 ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト 法 、 RT-PCR法 (以 下 に 記 載 ) に 用 い た 。 ま た 、 発 症 マ ウ ス 唾 液 腺 組 織 内 の 浸 潤 リ ン パ 球 は Ficollリ ン パ 球 分 離 液 (CederLane Laboratories Ltd.)に て 分 離 ・ 洗 浄 後 1 X 1 0 6個 に 調 製 し 、 F A C S 解 析 に 用 い た 。7
. 細 胞 増 殖 反 応 リ ン パ 球 分 離 法 に て 調 製 さ れ た 10%
(V N) FCS含 有 RPMI16 4 0 培 地 (日 本 水 産 、 東 京 ) 浮 遊 液 と し た リ ン パ 球 5 X 1 0 5 / weIlを 9 6穴 マ イ ク ロ タ イ タ ー プ レ ー ト (Becton DickinsonLabware， FranklinLakes， NJ， USA)に 分 注 し 、 各 種 マ イ ト ー ジ ェノ 2. 0 ILg/凶 ConA(Concanabalin A:EY Laboratories， Inc.lSan Mateo， CA， USA)、4μ
g/mg LPS (Lipopolysaccaride:O
f
F
CO Laboratories， Oetoroit， MI， USA)お よ びl O.9M s - エ ス ト ラ ジ オ ル (以 下 E，と略 ) (和 光 純 薬 ) 、 10・ 9 M タ モ キ シ フ ェ ン (以 下 T仰 と 略 ) (RBI)
に て 72 時 間 3 7
o
c
で 培 養 し 、 最 終 20 時 間 に お け る [3 H チ ミ ジ ン (NENLife Science Products Boston， M A， USA)の 取 り 込 み を オUSA
)
に て 計 測 し 、 増 殖 反 応 の 評 価 を 行 っ た ヲ8
. ウ エ ス タ ン ブ ッ ロ ト 法 当 教 室 で 精 製 し た 唾 液 腺 特 異 的 自 己 抗 原 トf
o
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l613
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を 10 % ( 重 量 /容 量 、 以 下WN
と 略 ) ア ク リ ル ア ミ ド (和 光 純 薬 ) で 調 製 し た ゲ ル を 用 い てL
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i
の 方 法 に 準 じ た ド デ シ ル 硫 酸 ナ ト リ ウ ム ー ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド 電 気 泳 動 ( 以 下SDS-PAGE
と 略 ) を 行 っ た 。 標 品 は ポ リ ビ ニ リ デ ン ジ フ ル オ ラ イ ド 膜 ( 以 下PVDF
膜 と 略 ，B
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，CA
，USA)
に 1 0 0V
、 3時 間 、 氷 冷 下 に て 電 気 的 に 転 写 し た 。PVDF
膜 は5
%
(
W
/Y) ス キ ム ミ ル ク 含 有TB
S
で ブ ロ ッ キ ン グ し た 後 、 1次 抗 体 と し て200
倍 希 釈 の 発 症 マ ウ ス 血 清 を 含 む1
% ス キ ム ミ ル ク ーTBS
で 室 温 、8
時 間 反 応 さ せ た 。 洗 浄 後 、 ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 標 識 抗 マ ウ スI
g
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(
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)
と 室 温 で2
時 間 反 応 さ せ た 。TBS
で 洗 浄 し た 後 、ECL
試 薬(
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)を 用 い て 化 学 発 色 法 に て 自 己 抗 体 の 検 出 を 行
っ た 。 ま た 、 リ ン パ 球 の エ ス ト ロ ジ ェ ン レ セ4プ タ ー の 検 出 を 行 う た め に 、 リ ン パ 球 分 画 分 離 法 で 得 ら れ た 各 T 細 胞 サ ブ セ ッ ト を2μ
g
!
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ア プ ロ チ ニ ン お よ び 10
mMEDTA
含 有 の 細 胞 溶 解 液 に て 溶 解 ・ 遠 心 後 、 上 清 を l レ ー ン あ た り4 0
n
g
をSDS-PAGE
に 展 開 、P V
0F
膜 に 転 写 し 、l
次 抗 体 と し て 抗 エ ス ト ロ ジ ェ ン レ セ プ タ ー モ ノ ク ロ ナ ー ル 抗 体(
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，USA
)
を 用 い 上 述 の 方 法 を 行 つ』 圃 圃 圃 圃 圃 圃 園 田 園 圃 ・ ・ ・ ・ ・ 戸 画 面 扇 面 扇 面 司 -
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-
-
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----~~----~_
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.，~._~~~-た 。
9
. 酵 素 免 疫 測 定 法 (ELISA)発 症 マ ウ ス 血 清 中 の 抗 唾 液 腺 自 己 抗 体 の 検 出 に 、 酵 素
免 疫 測 定 法 (ELISA;Enzyme-linked Immunosorbent Assay)を 用 い た 。 唾 液 腺 自 己 抗 原 溶 液 5 0 11 1を 9 6 wellマ イ ク ロ タ イ タ ー プ レ ー ト (Nunc，Inc.， Poskilide， Denmark)に 加 え 4
o
c
で l 晩 固 相 化 し た 。 抗 原 液 除 去 後 、 1 0%
(
WN
)
ス キ ム ミ ル ク (0 . 0 5%
(VN) Tween 2 0含 有 ) を 2 0 0 μ l/well加 え 、 37o
c
で 1 時 間 静 置 し 非 特 異 的 反 応 を 除 去 し た 。o
.
0 5 % (V N) Tween2 0含 有 PBS で 洗 浄 後 、1
%
(W，ハ1)ス キ ム ミ ル ク (0 . 05
% (VN)
Tween 2 0含 有 ) で 希 釈 し た マ ウ ス 血 清 を5
0μVml加 え 、37
o
c
で 1時 間 静 置 し た 。 2次 抗 体 と し て 10 0 0倍 希 釈 し た ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 標 識 ウ マ 抗 マ ウ ス IgG(フ ナ コ シ 、 東 京 ) を 50μlfwell加 え 、 37o
c
で 60分 間 反 応 さ せ た 。 過 酸 化 水 素 水 を 含 む o - フ ェ ニ レ ン ジ ア ミ ン (SigmaChemical Co.， S.tLouis，MO
， USA)溶 液 を 基 質 液 と し て 発 色 反 応 さ せ 、 4 9 2 nmで、の 吸 光 度 と し て 吸 光 度 測 定 器 (TitertecMultiskanMC; Flow Laboratories， McLean， V.A.)に て 測 定 し た 。 #1 0 .
細 胞 移 入 法 イ ム ノ マ グ ネ テ ィ ッ ク ビ ー ズ お よ び 抗 CD 4 抗 体 - 抗 CD8 抗 体 を 用 い て 、 未 処 置 の NFS/sldの 牌 細 胞 か ら CD4陽 性 T 細 胞 を 除 い た 分 画 (CD4-depletedと 略 )、 CD8陽 性 T 細 胞 を 除 い た 分 画 (CD8-depletedと 略 ) お よ び 未 分 画 細 胞 (Wholeと 略 ) ) ( l--ー一一一-一一
三
一
一ー孟二ごで=二二
￨
を 調 整 し 、 そ れ ぞ れ 1X 1 0 n 個 を 、 Tx+Ovxマ ウ ス の 腹 腔 内 に Ovx直 後 に 投 与 し た 後 、
8
週 齢 に て 屠 殺 し 各 臓 器 の 病 理 組 織 学 的 評 価 を 行 っ た (各 群 n=5-7) 。 1 1 . RT-PCR~去 RT-PCR (Reverse transcriptase polymerasechainreaction)法 を 用 い T細 胞 サ ブ セ ッ ト に お け る エ ス ト ロ ジ ェ ン レ セ プ タ 一 messengerRN A (以 下mRNAと略)の 発 現 を 以 下 の 如 く 解 析 し た 。 1 ) RNA 抽 出 リ ン パ 球 分 画 分 離 法 に て 分 離 し た CD4陽 性 T 細 胞 お よび
CD8陽 性 T細 胞 か ら to凶 RNA(以 下 氏NAと 略 ) を 抽 出 し た 。 抽 出 は RNeasy kit(Quiagen， 1nc.， Chatsworth， CA， USA)を 用 い て 、 添 付 プ ロ ト コ ー ル に 従 っ て 実 施 し 、 使 用 時 ま で -8 0o
c
に て 保 存 し た 。2
)
complemen凶y
DNA (cDNA)合 成5 0 ngのtRNAを 用 い 、 65
o
c、
5分 間 加 熱 し た 後 、 氷 中 に 5分 間 静 置 し 、 cDNA反 応 液 と し て Ribonucleaseinhibitor(宝 酒造 、 京 都 1 0 X PCR緩 衝 液 (5 0 0血M塩 化 カ リ ウ ム
2 0 0 m M ト リ ス ー 塩 酸 緩 衝 液 、 pH8. 4; 2 5 m M 塩 化 マ グ ネ シ ウ ム ) 、 1. 2 5 m M dNTPs (dATP， dCTP， dGTP， dTTP; Pharmacia Inc.)
、1O
Xhexanucleotid mixture(Boehringer Mannheim， 1肌， Mannheim， Germmany)、
lOOmM dithiothreitol DEPC 処 理 滅 菌 水 、 逆 転 写 酵 素 (宝 酒 造 、
京 都 ) を 加 え 、 4 2
o
c
、 6 0分 間 反 応 さ せ た。 95 "c、 5分 間 加 熱 し 反 応 を 停 止 さ せ 、 cDNAを 得 た。3
) 遺 伝 子 増 幅cDNAに 10 X PCR緩 { 奇 液 、 エ ス ト ロ ジ ェ ン レ セ プ タ ー 遺 伝 子 5' お よ び 3' プ ラ イ マ ー (5' -TCGGTTCCGCATG
ATGAAC，
3
'
-AGCAGGTCATAGAGGGGC) 1 7 1 ~ ¥ 1 . 2 5 m M dNTPs ， 2 0 m M 塩 化 マ グ ネ シ ウ ム 、 DNA合 成 酵 素 と し て Taqポ リ メラ ー ゼ (PerkinEImer Centus， 1nc.， Norwaik， CT， USA)を 加 え 、 至 適 条 件 に て サ ー マ ル サ イ ク ラ ー (PerlくinElmer Centus， Inc.)で 反 応 、 増 幅 さ せ た 。 得 ら れ た P C R 産 物 に エ チ ジ ウ ム ブ ロ マ
イ ド を 添 加 し 、 1 . 7 % ア ガ ロ ー ス ゲ ル 電 気 泳 動 後 、 UVト ラ ン ス イ ル ミ ネ タ (UVP， Inc.， San Gabriel， CA， USA)を 用 い て 検 出 し 、 ポ ラ ロ イ ド カ メ ラ に て 撮 影 し た 。 1 2 .マ ウ ス 顎 下 腺 細 胞 初 代 培 養 マ ウ ス 顎 下 腺 細 胞 (Mouse salivary gland cell;以 下 MSG細 胞 と 略 ) の 初 代 培 養 を Hannら の 方 法 に 準 じ て 実 施 し た 1 9 . 2 0 ¥ 0 3 週 齢 の 無 処 置 雌 NFS/sldマ ウ ス の 顎 下 腺 を 摘 出 し Ca2+，Mg2+無 添 加 の HBSS溶 液 に て 被 膜 剥 離 後 1 m m2角 に 細 切 洗 浄 し
o
.
7 6m
g
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mlEDTA， 4. 9 ILg/ml L - ア ス コ ル 正 ン 酸 、 4. 9μg
!
m
l
グ ル タ チ オ ン 含 有 HBSS溶 液 (SigmaChemical Co.)中 に て 37o
c
で 1 5分 間 培 養 し た 。 組 織 細 片 を DMEM/STI溶 液 (SigmaChemical Co.) に て 洗 浄 後 、 75 0 U/mlタ イ プ I コ ラ ゲ ナ ー ゼ (和 光 純 薬 ) 5 0 0 U/mlタ イ プ I V ヒ ア ル ロ ニ ダ ー ゼ ( 和 光 純 薬 ) 、 10%
(V/
V
)
FCS含 有 D恥a
M
!
F
l2 (Sigma Chemical Co.)に て 37"cで
2時 間 処 理 し た 。 10 0 ILmナ イ ロ ン メ ッ シ ユ フ ィ ル タ ー に て 減過 し た 後 、 再 び 上 述 の 酵 素 処 理 を 3 7
o
c
で 3 0分 間 行 い 、 洗 浄 後 10%
(V/
V
)
FCS含 有 の MEM培 地 (日 本 水 産 、 東 京 ) に て 3 7o
c
で 2 4時 間 培 養 し 、 プ レ ー ト に 接 着 し た 細 胞 を 上 皮 細 胞 と し て 用 い た 。 な お 、 抗 ケ ラ チ ン 抗 体 (LSLCo. Ltd.，東京)を 用 い た 免 疫 組 織 化 学 法 に て 9 0 % 以 上 が 陽 性 細 胞 で あ る こ と を 確 認 し た 。 13
. ア ポ ト ー シ ス の 検 : 出 M S G細 胞 の ア ポ ト ー シ ス を 誘 導 す る た め に 、 M S G細 胞 を 10 0 0 U/UUIFN-γ (Pharmingen， Inc.)に て 37o
c
で 2 4時 間 培 養 後、 10 0 ng/uu 抗 Fasモ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 (Pharmingen，rnc.)と 1 0 -9 M の /3- エ ス ト ラ ジ オ ー ル (和 光 純 薬 ) の 存 在 ・ 非 存 在 下 で さ ら に 24時 間 培 養 し た 。 細 胞 回 収 ・ 洗 浄 後 、7 0
% エ タ ノ ー ル に て 固 定 し 、 ア ポ ト ー シ ス 細 胞 の 検 出 試 薬 で あ る 10 0 mg/mlプ ロ ピ ジ ウ ム ヨ ー ド (Propidium Iodide， Sigma Chemical Co.:以下 PIと 略 ) に て 37o
c
で 30分 間 反 応 さ せ た 。 PBSに て 洗 浄 後 、 細 胞 自 動 解 析 装 置 (EPICS，Coulter)に よ り ア ポ ト ー シ ス 細 胞 を 検 出 し た 。1
4
. 統 計 学 的 検 索 組 織 学 的 イ ン デ ッ ク ス 、FA C S
、EL 1
S A
、 細 胞 増 殖 反 応 に お け る デ ー タ は 平 均 士 SD で 表 し 、 Mann-Whi tneyU
-test を 用 い p<O.05に て 有 意 と す る 。 13結 果 1 . 病 理 組 織 学 的 変 化 生 後
3
日 目 に てTx
を 施 し た NFS/sldマ ウ ス に さ ら に4週
齢 に て 、 エ ス ト ロ ジ ェ ン を 欠 乏 さ せ る 目 的 で 卵 巣 摘 出 を 行 っ た 。Tx+Ovx
群8
週 齢 に お け る 唾 液 腺 ・ 涙 腺 に お け る 病 理 組 織 像 を 図1
に 示 す 。T
x
マ ウ ス に 比 較 し てTx+Ovx
マ ウ ス で は 顎 下 腺 、 舌 下 腺 、 耳 下 腺 、 涙 腺 の い ず れ の 臓 器 に お い て も 腺 組 織 破 壊 を 伴 う 著 し い 炎 症 性 病 変 が 認 め ら れ た 。 8 週 齢 よ り 2 0 週 齢 ま で の 各 臓 器 に お け る 病 変 の 経 時 的 変 化 を 図 2に 示 す 。 各 臓 器 と も に Tx
マ ウ ス に 比 較 し 、Tx+Ovx
マ ウ ス で は 自 己 免 疫 病 変 の 増 強 が 有 意 に 認 め ら れ た 。 な お 、 い ず れ の マ ウ ス に も 他 臓 器 の 炎 症 性 病 変 は 認 め ら れ な か っ た 。2
. 唾 液 腺 浸 潤 リ ン パ 球 サ ブ セ ッ ト の 同 定 免 疫 組 織 化 学 的 検 索 の 結 果 か ら 、Tx+Ovx
マ ウ ス の 唾 液 腺 浸 潤 リ ン パ 球 の 多 く は Thy1.2陽 性 T細 胞 (図 3 A ) で あ り B 2 2 0 陽 性 B 細 胞 は 少 数 で あ っ た 。 T 細 胞 サ ブ セ ッ ト の 表 現 形 質 は CD4陽 性 T 細 胞 が 優 位 で (図 3B ) CD8陽 性 T 細 胞 は 少 数 で あ る こ と (図 3C ) が 判 明 し た 。 唾 液 腺 組 織 か ら 分 離 し た 浸 潤 リ ン パ 球 の FACS解 析 で は 、 CD4陽 性 T 細 胞 は 3 0 . 2 %、 CD8陽 性 T 細 胞 は 4 . 8 % で あ っ た (図 30 )。3
. 卵 巣 摘 出 に よ る 牌 臓 T 細 胞 お よ び B 細 胞 へ の 影 響 14竺
一
一
一
一
一
一
一
一
一
一
一
一
竺
三
三三三
三二二二
生 体 内 で の エ ス ト ロ ジ ェ ン 欠 乏 状 態 が 全 身 の 免 疫 系 に ど の よ う な 影 響 を 与 え て い る の か を 知 る た め に 、 各 群 の 牌 臓 に お け る T 細 胞 サ ブ セ ッ ト を FACSに て 解 析 し た 。 CD4お よ び CD8の 二 重 染 色 に よ る プ ロ フ ァ イ ル を 図 4 に 不 す 。
Tx
を 施 さ な い 未 処 置 のN
F
S
/
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J
d
マ ウ ス に 比 べ 、T
x
マ ウ ス で は CD4・CD8陽 性 T 細 胞 と も に 減 少 し て い た 。 こ の こ と は 、 胸 腺 を 摘 出 す る こ と に よ る T 細 胞 の 分 化 ・ 成 熟 不 全 を 反 映 し て い る 。 Tx+Ovxマ ウ ス で は さ ら に T細 胞 は 減 少"し 、 特 に CD8陽 性 T 細 胞 の 有 意 な 減 少 が 認 め ら れ た 。 牌 臓 に お け る 8220陽 性 B 細 胞 は Txマ ウ ス に 比 較 し て Tx+Ovx マ ウ ス で は 軽 度 に 増 加 し て い た が 、 有 意 な 変 化 で は な か っ た (表 1) 0 B 細 胞 の マ イ ト ー ジ ェ ン で あ る LPSに 対 す る 反 応 で は 、 Txマ ウ ス よ り も Tx+Ovxマ ウ ス の 方 が 有 意 に 高 い 増 殖 反 応 を 示 し て い た (表 1) 4 . 自 己 抗 体 の 検 出 発 症 マ ウ ス 血 清 中 の 唾 液 腺 特 異 的 自 己 抗 原 (120kDα-fodrin) に 対 す る 自 己 抗 体 を 検 出 す る た め に 、 ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト 法 、 ELISAに よ る 解 析 を 行 っ た 。 1 ) ウ エ ス タ ン プ ロ ッ ト j去
SSモ デ ルN
F
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マ ウ ス 唾 液 腺 か ら 抽 出 し た 唾 液 腺 特 異 的 自 己 抗 原 120kDα-fodrin1 6 )に 対 し て 、 Txマ ウ ス お よ び Tx+Ovxマ ウ ス 血 清 を l 次 抗 体 と す る ウ エ ス タ ン プ ロ ッ ト 法 を 千 子 っ た と こ ろ 、 Txマ ウ ス に 比 車 交 し て Tx+Ovxマ ウ ス で 1 2 0 k 0 に 特 異 的 な バ ン ド が 強 く 検 出 さ れ た 。 な お 15‘ 園 圃 圃 圃 圃 圃 圃 圃 圃 圃 圃 圃 圃 圃 圃
E
遍
画
面
ー
ー
ー
ー
対 照 と し て 用 い た 正 常 BALB/cマ ウ ス 血 清 お よ び T x を 行 わ ず に Ovxの み を 施 し た NFS/sldマ ウ ス 血 清 と 反 応 す る バ ン ド は 認 め ら れ な か っ た (図 5 A ) 。
2
)
ELISA ELISAに よ り 唾 液 腺 特 異 的 自 己 抗 体 の 定 量 を 行 っ た 結 果 、 Txマ ウ ス に 比 較 し て Tx+Ovxマ ウ ス の 血 清 中 に 自 己 抗 体 量 の 有 意 な 増 加 が 認 め ら れ た (図 5B )。 5 . Tx+Ovxマ ウ ス へ の エ ス ト ロ ジ ェ ン 投 与 に よ る 病 態 回 復 効 果 Tx+Ovxに よ り 増 強 さ れ た 自 己 免 疫 病 変 が エ ス ト ロ ジ ェ ン 投 与 に よ っ て 回 復 す る か 否 か を 検 討 し た 。 Tx，Tx+Ovx、 Tx+Ovx+E2、Tx+Tam、 Tx+Ovx+Tesの 5 群 を 4 週 齢 か ら 8 週 齢 ま で 処 置 し 8 週 齢 に て 屠 殺 し 、 各 臓 器 の 組 織 学 的 検 索 を 行 っ た (表 2)。 エ ス ト ロ ジ ェ ン 投 与 に よ り 、 顎 下 腺 ・ 舌 下 腺 耳 下 腺 涙 腺 と も に 自 己 免 疫 病 変 の 発 症 は 有 意 に 回 復 す る こ と が 判 明 し た 。 ま た エ ス ト ロ ジ ェ ン の 措 抗 薬 で あ る タ モ キ シ フ ェ ン 投 与 群 で は 顎 下 腺 以 外 は Tx+Ovx群と ほ ぼ 同 程 度 の 病 変 で あ っ た 。 テ ス ト ス tテ ロ ン 投 与 群 で は 耳 下 腺 ・ 涙 腺 で Tx+Ovx群 よ り も 病 変 の 増 悪 が 認 め ら れ た 。6
. エ ス ト ロ ジ ェ ン 投 与 に よ る 牌 臓T
細 胞 へ の 影 響 無 処 置 ， Tx， Tx+Ovx， Tx+Ovx+E2， Tx+ Tam， Tx+Ovx+ Tesの 各 群 で の 牌 細 胞 に お け る CD 4 お よ び CD8陽 性 T 細 胞 の 割 合 を FACSに て 検 出し、 CD4/CD8比 を 図 6 に 示 し た 。 Tx+Ovx群 を 基 準 に す る と
エ ス 下 ロ ジ ェ ン 投 与 で CD4/CD8比 は 低 下 し 、 タ モ キ シ 7 ..L ン 投 与 で 同 程 度 と な り 、 テ ス ト ス テ ロ ン 投 与 で 上 昇 す る こ と が 判 明 し た 。 つ ま り 、 CD4/CD8比 は 病 変 の 程 度 に ほ ぼ 連 動 し て い る こ と が 判 っ た 。 ま た 、 各 実 験 群 の 牌 臓 に お け る CD4陽 性 T 細 胞 の 活 性 化 の 程 度 を 知 る た め に 、 T 細 胞 の 活 性 化 マ ー カ ー で あ る CD44，CD45RB， Mel-14発 現 を FACS に て 解 析 し た 。 こ の モ デ ル マ ウ ス は Txを 施 す こ と に よ り 、 CD44high ， CD45RB1ow ， Mel-14-の 活 性 化 パ タ ー ン を 示 し 、 Tx+Ovx処 理 に よ っ て そ の パ タ ー ン は 増 強 さ れ 、 エ ス ト ロ ジ ェ ン 投 与 に よ り Mel-14とCD44の 活 性 化 パ タ ー ン が 弱 ま り 、 活 性 化 の 抑 制 効 果 が 認 め ら れ た 。 (図 7) 7 . 卵 巣 摘 出 マ ウ ス へ の T細 胞 分 画 移 入 に よ る 自 己 免 疫 病 変 の 影 響 Tx+Ovxに て 増 強 さ れ た 自 己 免 疫 病 変 が 、 正 常 牌 細 胞 の T 細 胞 分 画 を 移 入 す る こ と に よ り 回 復 す る か 否 か を 検 討 す る た め に 、 細 胞 移 入 実 験 を 行 っ た 。 図
8
に8
週 齢 に お け る 各 臓 器 の 組 織 学 的 イ ン デ ッ ク ス を 示 す 。 wholeの 細 胞 を 移 入 し た 群 お よ び CD8-depleted細 胞 を 移 入 し た 群 に お い て 各 臓 器 と も に 自 己 免 疫 病 変 の 回 復 が 有 意 に 認 め ら れ CD4-depleted細 胞 を 移 入 し た 群 は 病 変 の 回 復 は 認 め ら れ な か っ た 。 即 ち 、 C D 4陽 性 T細 胞 を 含 む 分 画 の 移 入 に よ り 病 変 の 回 復 効 果 が 認 め ら れ た 。8
in vitroに お け る 牌 細 胞 の エ ス ト ロ ジ ェ ン に 対 す る 反 応 性 17NFS/sldマ ウ ス 牌 細 胞 の エ ス ト ロ ジ ェ ン に 対 す る 反 応 性 を 知 る た め に 、 T細 胞 お よ び B 細 胞 の マ イ ト ー ジ ￡ ン で あ る Con A お よ び LPSを 用 い、 invitroに お け る エ ス ト ロ ジ ェ ン に 対 す る 増 殖 反 応 を 検 討 し た 。 ConAで、 刺 激 を 受 け た 牌 細 胞 は エ ス ト ロ ジ ェ ン を 加 え る こ と に よ り さ ら に 反 応 性 が 上 昇 し 、 そ の 反 応 は エ ス ト ロ ジ ェ ン の 桔 抗 薬 で あ る タ モ キ シ フ ェ ン に よ り 抑 制 さ れ た (図 9 A ) 。 一 方 、 エ ス ト ロ ジ ェ ン の み で は 全 く 反 応 し な か っ た 。
LP S
で 刺 激 を 受 け た 牌 細 胞 は エ ス ト ロ ジ ェ ン を 加 え て も 反 応 性 に 変 イ ヒ は 認 め ら れ な か っ た 図 9B )。 即 ち 、 活 性 化 さ れ た T細 胞 に エ ス ト ロ ジ ェ ン が 作 用 し 、 そ の 増 殖 反 応 を 増 強 し て い る こ と カf 判 明 し た 。 そ こ で T 細 胞 の 各 サ ブ セ ッ ト を 分 離 し 同 様 の 反 応 性 を 検 討 し た 。 CD4陽 性 T細 胞 と CD8陽 性 T細 胞 を 分 離 し 、 エ ス ト ロ ジ ェ ン に 対 す る 反 応 性 を 比 較 す る と CD8陽 性 T細 胞 の 方 が エ ス ト ロ ジ ェ ン に よ っ て 有 意 に 増 殖 反 応 が 元 進 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。 ま た そ の 反 応 は タ モ キ シ フ ェ ン に よ り 抑 制 さ れ る こ と 治 宝 判 っ た (図 9C D ) 。9
.
T 細 胞 各 サ ブ セ ッ ト に お け る エ ス ト ロ ジ ェ ン レ セ プ タ ー の 発 現 CD8陽 性 T細 胞 の エ ス ト ロ ジ ェ ン に 対 す る 有 意 な 反 応 性 が 認 め ら れ た こ と か ら そ の 反 応 が エ ス ト ロ ジ ェ ン レ セ プ タ ー の 発 現 と 関 わ っ て い る 可 能 性 を 明 ら か に す る た め に 、 T 細 胞 各 サ ブ セ ッ ト に お け る エ ス ト ロ ジ ェ ン lX. 島 』
一 一 一 一 一 一 一 一 四 回 目 幽4
レ セ プ タ ー の 発 現 を ウ エ ス タ ン プ ロ ッ ト 法 と RT-PCRy去 に て 検 索 し た 。 ウ エ ス タ ン プ ロ ッ ト 法 で は 、 約 70 k 0 に エ ス ト ロ ジ ェ ン レ セ プ タ ー 特 異 的 な バ ン ド が 検 出 さ れ CD4陽 性 T 細 胞 に 比 較 し て CD8陽 性 T 細 胞 に 強 い 発 現 が 認 め ら れ た ( 図 10 A )。 な お 、 陽 性 対 照 と し て NFS/sJdマ ウ ス の 子 宮 組 織 ホ モ ジ ネ ー ト を 用 い た 。 RT-PCR法 に お い て も CD8陽 性 T 細 胞 に お い て 、 エ ス ト ロ ジ ェ ン レ セ プ タ -
mR
NA の 発 現 が CD4陽 性 T 細 胞 に 比 べ て 明 ら か に 増 強 さ れ て い る こ と が 判 明 し た (図 10 B ) 10
. 自 己 免 疫 病 変 に お け る Fasを 介 し た 組 織 破 壊 と エ ス ト ロ ジ ェ ン と の 関 係 胃 炎 ・ 甲 状 腺 炎 な ど に お け る 自 己 免 疫 性 の 組 織 破 壊 の メ カ ニ ズ ム の 一 つ に Fasを 介 し た ア ポ ト ー シ ス の 関 与 が 知 ら れ て い る 2 l -2 5) o そ こ で 、 Txマ ウ ス と Tx+Ovxマ ウ ス に お け る 唾 液 腺 浸 潤 リ ン パ 球 の Fasリ ガ ン ド の 発 現 と 、 そ れ ぞ れ の マ ウ ス よ り 分 離 し た MSG細 胞 の Fas発 現 を FACS に て 比 較 検 討 し た 。 唾 液 腺 浸 潤 リ ン パ 球 の Fasリ ガ ン ド 発 現 は 、 Txマ ウ ス ( 図 l l A : 7 2 %) に 比 較 し て 、 Tx+Ovxマ ウ ス の 方 が よ り 増 強 さ れ て い た ( 図 11 B : 8 8 % ) 0 MSG 細 胞 に お け る Fas発 現 に お い て も Tx+Ovxマ ウ ス の 方 が よ り 増 強 さ れ て い る こ と が 判 っ た (図 11 C ， D) 1 1 . in vitroで の Fasを 介 し た ア ポ ト ー シ ス に お け る エ ス ト ロ ジ ェ ン の 影 響 invivoに お い て エ ス ト ロ ジ ェ ン 欠 乏 状 態 で は 唾 液 腺 細 19i
一
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一
一
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胞 の Fas発 現 が 増 強 さ れ て い た こ と か ら 、 エ ス ト ロ ン エ ン が 直 接 唾 液 腺 細 胞 に お け る Fas発 現 を 調 節 す る の か 否 か を 明 ら か に す る た め に、 MSG細 胞 に invitroで Fasを 発 現 さ せ そ の 発 現 に エ ス ト ロ ジ ェ ン が ど の よ う に 影 響 す る の か を 検 討 し た 。 あ る 種 の 骨 髄 細 胞 や glioma細 胞 な ど で 、 IFN-γを 作 用 さ せ る こ と に よ り Fasの 発 現 が 増 強 す る こ と が 知 ら れ て い る 26 2 7 ) 。 本 実 験 系 で 確 立 し た MSG細 胞 に お い て も IFN-yに よ っ て Fasの 発 現 が 増 強 さ れ た こ と か ら 、 こ の 系 を 用 い て 、 invitroで、エ ス ト ロ ジ ェ ン の 作 用 を 加 え る と、 MSG細 胞 の Fas発 現 は 抑 制 さ れ 、 タ モ キ シ フ ェ ン に よ り そ の 抑 制 効 果 は 相 殺 さ れ る こ と が 判 明 し た ( 図 12 A ) ま た 、 抗 Fas抗 体 に よ る MSG細 胞 の ア ポ ト ー シ ス 誘 導 実 験 に お い て も 、 IFN-yで 、 誘 導 さ れ た Fasを 介 し た ア ポ ト ー シ ス は エ ス ト ロ ジ ェ ン に よ り 抑 制 さ れ て い る こ と が 明 ら か と な っ た (図 12 B ) 20
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考 察 自 己 免 疫 疾 患 の 成 立 機 構 は 不 明 で あ る が 、 染 色 体 上 の 複 数 の 遺 伝 子 座 の 働 き と 、 環 境 因 子 と が 相 侠 っ て お こ る 多 因 子 性 疾 患 と 考 え ら れ て い る 。 遺 伝 的 因 子 と し て 組 織 適 合 遺 伝 子 複 合 体 (MHC;major histocompatibility complex)を は じ め と す る 様 々 な 遺 伝 子 群 が 関 与 し て い る こ と が 知 ら れ て い る 18 -3 2 )。 環 境 因 子 と し て は ウ イ ル ス 感 染 、 ホ ル モ ン 、 ス ト レ ス 、 加 齢 な ど 多 く 要 因 が 知 ら れ て お り そ の 中 で も 性 ホ ル モ ン に 関 す る 報 告 は 多 い 。 自 己 免 疫 疾 患 の 発 症 に 女 性 優 位 の 性 差 が あ る こ と は 従 来 か ら 周 知 の 事 実 で あ る が 、 自 己 免 疫 疾 患 の 発 症 に お け る 性 ホ ル モ ン の 役 割 を 組 織 レ ベ ル ・細 胞 レ ベ ル ・ 遺 伝 子 レ ベ ル で 詳 細 に 解 析 し た 報 告 は な い 。 本 研 究 で は 、 臓 器 特 異 的 自 己 免 疫 疾 患 で あ る シ ェ ー グ レ ン 症 候 群 の 疾 患 モ デ ル NFS/sldマ ウ ス を 用 い 、 卵 巣 摘 出 を 施 す こ と に よ り エ ス ト ロ ジ ェ ン 欠 乏 状 態 を 誘 導 す る と 、 唾 液 腺 ・ 涙 腺 に お け る 自 己 免 疫 病 変 は 著 し く 増 悪 す る に と が 判 明 し た 。 ま た 、 生 理 的 濃 度 の エ ス ト ロ ジ ェ ン を 1flVIVOに 経 時 的 に 投 与 す る こ と に よ り そ れ ら の 病 変 は 回 復 す る こ と が 判 つ た 。 こ の こ と は 、 エ ス ト ロ ジ ェ ン が 生 体 内 で 自 己 免 疫 病 変 の 発 症 に 防 御 的 な 作 用 を し て い る こ と を 示 唆 し て い る 。 さ ら に 、 エ ス ト ロ ジ ェ ン の 措 抗 薬 で あ る タ モ キ シ フ ェ ン を 投 与 す る こ と に よ り 卵 巣 摘 出 群 と 同 程 度 の 21
病 変 が 誘 導 で き た こ と か ら も エ ス ト ロ ジ ェ ン の 作 用 が 病 態 抑 制j効 果 に 働 い て い る 可 能 性 が 強 く 示 唆 さ れ た 。 な お タ モ キ シ フ ェ ン 投 与 群 に お い て 唾 液 腺 炎 の う ち で 顎 下 腺 病 変 に 増 悪 が み ら れ な か っ た 原 因 と し て 、 タ モ キ シ フ ェ ン が 部 分 的 措 抗 薬 で あ る こ と や 臓 器 に よ っ て ホ ル モ ン 感 受 性 に 差 の あ る 可 能 性 が 考 え ら れ た 。
S
S
の モ デ ル と し て 肘fRIJl
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マ ウ ス や NZB州Z WFlマ ウ ス を 用 い た 実 験 で は 、 エ ス ト ロ ジ ェ ン で は な く ア ン ド ロ ジ ェ ン が 病 態 抑 制 に 効 果 的 で あ る と い う 報 告 が あ る が 8 . 3 :l) 、 そ れ ら の マ ウ ス は 全 身 的 な 自 己 免 疫 疾 患 を 背 景 と し た 一 次 性S
S
の モ デ ル で あ り 本 研 究 で 用 い たN
F
S
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s
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疾 患 モ デ ル マ ウ ス が 一 次 性S
S
の モ デ ル で あ る 点 と 異 な っ て い る 。 ま た 個 々 の 系 統 の マ ウ ス に よ る ホ ル モ ン 感 受 性 の 違 い や 病 態 発 症 の メ カ ニ ズ ム の 相 違 も 関 与 し て い る も の と 思 わ れ る 。 閉 経 期 以 降 の エ ス ト ロ ジ ェ ン の 欠 乏 状 態 に あ る 女 性 に 好 発 す るS
S
の 病 態 と 、 卵 巣 摘 出 に よ っ て 増 強 さ れ るNF
S
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疾 患 モ デ ル マ ウ ス の 病 態 に は 類 似 点 が 多 く 認 め ら れ 、 自 己 免 疫 疾 患 の 発 症 に 関4
与 す る エ ス ト ロ ジ ェ ン の 機 能 を 解 析 す る う え で 本 モ デ ル の 有 用 性 が 重 視 さ れ る 。 卵 巣 摘 出 を 施 し た マ ウ ス の 病 変 局 所 に 浸 潤 し て い る リ ン パ 球 は CD4陽 性 T 細 胞 が 主 体 で あ り 、 こ の 所 見 は 胸 腺 摘 出 の み のN
F
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疾 患 モ デ ル と 類 似 し 、 自 己 免 疫 病 変 の 形 成 に CD4陽 性 T細 胞 が エ フ ェ ク タ ー 細 胞 と し て 機 能 し 22て い る も の と 考 え ら れ る 。 ま た 、 正 常 CD4陽 性 T細 胞 を 含 む 分 画 の 移 入 に よ り 卵 巣 摘 出 マ ウ ス の 自 己 免 疫 病 変 が 回 復 し た こ と か ら CD4陽 性 T 細 胞 中 に 自 己 免 疫 反 応 に 対 し て 防 御 的 に 働 く 調 節 性 T細 胞 が 含 ま れ て い る 可 能 性 を 示 唆 し て お り 下 、 ・ の こ と は 従 来 の 報 告ー、 と 一 致 し て い る 3 4 )。 卵 巣 摘 出 に よ る 全 身 の 免 疫 系 へ の 影 響 と し て in vivoに お け る CD8陽 性 T 細 胞 の 減 少 が 著 明 で あ り 、 invitroに お い て CD8陽 性 T 細 胞 の エ ス ト ロ ジ ェ ン に 対 す る 有 意 な 反 応 性 が み ら れ た こ と か ら 生 体 内 で エ ス ト ロ ジ ェ ン が 欠 乏 す る こ と に よ り CD8陽 性 T 細 胞 の 増 殖 能 が 抑 制 さ れ 、 サ プ レ ッ サ 機 能 に 不 全 状 態 が も た ら さ れ た 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 ま た 、 従 来 か ら 免 疫 担 当 細 胞 に は 、 エ ス ト ロ ジ ェ ン レ セ プ タ ー が 存 在 す る こ と が 知 ら れ て お り 3 5 3 6 ) 本 モ デ ル マ ウ ス に お い て CD8陽 性 T 細 胞 に 優 位 に エ ス ト ロ ジ ェ ン レ セ プ タ ー の 発 現 が 認 め ら れ た こ と は ヒ ト に お け る 解 析 結 果 37 ) と 一 致 し て い る 。 ま た 、 卵 巣 摘 出 に よ る 自 己 抗 体 産 生 の 増 強 効 果 は NZB、庁iZWFlマ ウ ス な ど に お け る 従 来 の 報 戸 6. 7 ) と 一 致 し て お り エ ス ト ロ ジ ェ ン が 負 の 調 節 因 子 と し て 働 く IL-6 な ど の サ イ ト カ イ ン の 産 生 允 進 に よ る も の で あ る と 説 明 さ れ て い る 。 般 的 に エ ス ト ロ ジ ェ ン は 標 的 細 胞 の 細 胞 質 に 存 在 す る エ ス ト ロ ジ ェ ン レ セ プ タ に 結 合 し エ ス ト ロ ジ ェ ン エ ス ト ロ ジ ェ ン レ セ フ。タ コ ン プ レ ッ ク ス を 形 成 し 、 そ の コ ン プ レ ッ ク ス が 核 内 に 移 23
行 し 特 定 の 遺 伝 子 上 に 存 在 す る エ ス ト ロ ジ ェ ン レ ス ポ ン シ イ ブ エ レ メ ン ト (ERE;estrogen responsive element) と 相 互 作 用 し 、 標 的 遺 伝 子 の 転 写 を 調 節 し て い る こ と が 明 ら か に さ れ て い る : 18 - 4 0 ) そ の 標 的 遺 伝 子 の 中 に IL-6 ，IFN-y， IL-l/f， 。 TNF-σ な ど の 各 種 サ イ ト カ イ ン 遺 伝 子 が 存 在 し て い る と い つ 報 告 が あ る 4 1 - 4 7 )。 生 体 内 に お け る エ ス ト ロ ン エ ン の 作 用 と し て 直 接 細 胞 の 増 殖 な ど の 機 能 に 関 与 し て い る シ グ ナ ル と サ イ ト カ イ ン な ど を 介 し て 間 接 的 に 作 用 し て い る シ グ ナ ル と が 存 在 し て お り 自 己 免 疫 病 変 の 発 症 メ カ ニ ズ ム に こ れ ら エ ス ト ロ ジ ェ ン の 複 雑 な 直 接 的 ・ 間 接 的 作 用 が 関 与 し て い る 可 能 性 が 強 く 示 唆 さ れ る 。 多 く の 自 己 免 疫 疾 患 の 組 織 破 壊 の メ カ ニ ズ ム に Fasを 介 し た ア ポ ト ー シ ス の 関 与 が 知 ら れ て い る 2 1 - 2 5 . 4 8 4 9 )
。
本 モ デ ル に お い て も 、 MSG細 胞 に Fas抗 原 が 発 現 し 、 唾 液 腺 に 浸 潤 す る CD4陽 性 T 細 胞 に Fasリ ガ ン ド が 検 出 さ れ 、 さ ら に invitroに お い て MSG細 胞 の 抗 Fas抗 体 に よ る ア ポ ト シ ス が 誘 導 さ れ た こ と か ら Fasを 介 し ， た ア ポ ト ー シ ス が 唾 液 腺 の 組 織 破 壊 に 関 与 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 こ の 点 に 関 し て は エ ス ト ロ ジ ェ ン の 欠 乏 状 態 に よ っ て CD8陽 性 T 細 胞 の サ プ レ ッ サ ー 機 能 不 全 や サ イ ト カ イ ン の 産 生 允 進 に よ る エ フ ェ ク タ ー 細 胞 の 活 性 化 が も た ら さ れ Fasリ ガ ン ド を 強 く 発 現 し た 自 己 反 応 性 T 細 胞 の 局 所 浸 潤 を 促 す と 同 時 に 、 IFN-y によ っ てj:~5
虫 さ れ 24た 唾 液 腺 細 胞 側 の Fasを 介 し た ア ポ ト ー シ ス が 誘 導 さ れ 、 こ れ ら の 結 果 と し て 組 織 破 壊 が 進 行 す る と い う メ カ ー ズ ム が 考 え ら れ る 。 角 膜 、 精 巣 、 胎 盤 な ど の 組 織 側 に Fas抗 原 で は な く Fasリ ガ ン ド が 発 現 し 、 浸 潤 細 胞 の Fasと 相 互 作 用 し 浸 潤 細 胞 の ア ポ ト ー シ ス が 誘 導 さ れ 、 免 疫 防 御 的 な 役 割 を 果 た し て い る と い う 報 告 50 ・ 5:2)や 、 橋 本 甲 状 腺 炎 5 2 ) に お い て は Fasお よ び Fasリ ガ ン ド の 両 方 を 発 現 し 浸 潤 リ ン パ 球 と は 関 係 な く ア ポ ト ー シ ス が 起 こ る と い う 報 告 53 ) な さ れ て い る 。 本 疾 患 モ デ ル マ ウ ス に お い て 唾 液 腺 細 胞 に は Fas抗 原 が 発 現 し 、 Fasリ ガ ン ド の 発 現 は 認 め ら れ な か っ た こ と か ら 、 上 述 し た よ う な 現 象 と は 異 な る メ カ ニ ズ ム に よ る 組 織 破 壊 と 考 え ら れ る 。 NFS/sldマ ウ ス に お い て 、 胸 腺 摘 出 を 行 わ ず に 卵 巣 摘 出 を 施 し て も 自 己 免 疫 病 変 は 全 く 認 め ら れ ず 、 免 疫 担 当 細 胞 に も 影 響 が な か っ た こ と か ら 、 胸 腺 摘 出 に よ っ て 自 己 抗 原 に 反 応 す る 活 性 化 し た T 細 胞 の み に エ ス ト ロ ジ ェ ン が 作 用 し て い る 可 能 性 が あ る 。 ま た t，
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vitro~こおける 牌 細 胞 の 増 殖 反 応 に お い て も 、 マ イ ト ー ジ ェ ン 刺 激 が な け れ ば エ ス ト ロ ジ ェ ン の 作 用 は 認 め ら れ な か っ た こ と もi
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に お け る 所 見 を 反 映 し て い る も の と 考 え ら れ る 。 免 疫 系 細 胞 と 性 ホ ル モ ン と の 関 連 性 に つ い て は 多 く の 報 告 が あ り 5 4 -5. 7 )、 そ れ ら の 中 で 、 胸 腺 細 胞 に は 性 ホ ル モ ン に 対 す る 強 い 感 受 性 が 存 在 し 、 性 ホ ル モ ン が 胸 25腺 内
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細 胞 の 分 化 に 大 き く 影 響 す る こ と が 明 ら か に さ れ て い る 。 一 方 、 本 疾 患 モ デ ル で は 生 後3
日 目 に 胸 腺 を い も の と 考 え ら れ る 。ま た
古同 濃 度 の エ ス ト ロ ジ ェ ン 摘 出 し 、 4週 齢 に て 卵 巣 摘 出 を 施 す の で 、 こ の 実 験 系 に お い て は 胸 腺 細 胞 と エ ス ト ロ ジ ェ ン と の 関 連 性 は 少 な が T 細 胞 の 胸 腺 外 分 化 を 誘 導 す る こ と が 知 ら れ て い る が 胸 腺 摘 出 を 施 し た NFS/sldマ ウ ス の 肝 臓 に お け る 胸 腺 外 分 化 を 示 唆 す るTCR(T
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intの ポ ピ ュ レ ー シ ョ ン 5 8 ) は 認 め ら れ な か っ た こ と か ら 、 本 モ デ ル に お け る 自 己 免 疫 疾 患 の 発 症 に 胸 腺 外 分 化 T 細 胞 は 関 与 し て い な い も の と 考 え ら れ た 。 こ のSS
疾 患 モ デ ル マ ウ ス を 用 い 、 ヒ トS
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と 共 通 す る 臓 器 特 異 的 自 己 抗 原 がα
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で あ る こ と は す で に 当 教 室 か ら 報 告 さ れ て い る l 6 ) 。 自 己 抗 原 と エ ス ト ロ ジ ェ ン と の 関 係 に つ い て は 不 明 で あ る が 、 エ ス ト ロ ジ ェ ン に よ っ て 調 節 を 受 け る あ る 種 の カ テ プ シ ン や カ ル パ イ ン な ど の 70 ロ テ ア ー セ ゃ 群 59 ・ 63 )が 自 己 抗 原 の 分 断 化 お よ び フ 。 ロ セ ッ シ ン グ に 関 係 し て い る 可 能 性 が4考 え ら れ る 。 本 研 究 で は 、 卵 巣 摘 出 マ ウ ス に お い て12 0
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に 対 す る 自 己 抗 体 の 産 生 尤 進 が 認 め ら れ た こ と か ら 、 自 己 抗 う け て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。 原 の 発 現 増 強 が エ ス ト ロ ジ ェ ン の 動 態 に よ っ て 影 響 を 本 研 究 に お い て 、 エ ス ト ロ ジ ェ ン がS
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疾 患 モ デ ル で あ る NFS/sldマ ウ ス の 自 己 免 疫 病 変 に 対 し て 防 御 的 に 作 用 し 26て お り 、 そ の メ カ ニ ズ ム の 一 端 が 、 エ ス ト ロ ジ ェ ン 欠 乏 状 態 に よ る CD8陽 性 T 細 胞 の サ プ レ ッ サ 一 機 能 不 全 、 イ
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に 対 す る 自 己 抗 体 産 生 允 進 、 唾 液 腺 に お け るF
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リ ガ ン ド を 介 し た 組 織 破 壊 の 允 進 な と で あ る こ と が 明 ら か に な っ た が 、 こ れ ら の 分 子 生 物 学 的 な 制 御 機 構 に つ い て は 不 明 の ま ま で あ る 。 今 後 、 唾 液 腺 組 織 お い て エ ス ト ロ ジ ェ ン に よ っ て 調 節 制 御 さ れ て 自 己 抗 原 の 発 現 や 組 織 破 壊 に 関 与 す る 新 た な 分 子 群 の 同 定 や 、 自 α 己 反 応 性T
細 胞 の 活 性 化 を 調 節 す る シ グ ナ ル カ ス ケ ー ド に お け る エ ス ト ロ ジ ェ ン の 役 割 を 解 析 す る こ と な ど が 重 要 な 検 討 課 題 で あ る 、' o '-ー れ ら の ア プ ロ ー チ に よ り 自 己 免 疫 疾 患 発 症 に お け る 性 差 の メ カ ニ ズ ム の 分 子 論 的 解 明 が な さ れ る も の と 考 え ら れ る 。 4 27奇士 号心、 不口 百周
1
. シ ェ ー グ レ ン 症 候 群 モ デ ル マ ウ ス NFS/sldに お い て 、 卵 巣 摘 出 を 施 す こ と に よ り 、 自 己 免 疫 病 変 は さ ら に 増 悪 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。2
. 卵 巣 摘 出 に よ り 牌 細 胞 中 の CD8陽 性 T 細 胞 が 減 少 し 、 in vitroに お い て CD8陽 性 T 細 胞 が 優 位 に エ ス ト ロ ジ ェ ン に 反 応 し さ ら に CD8陽 性 T 細 胞 に エ ス ト ロ ジ ェ ン レ セ プ タ ー の 強 い 発 現 が み ら れ た こ と か ら 、 エ ス ト ロ ン エ ン レ セ フ タ ー を 介 し た CD8陽 性 T 細 胞 の サ プ レ ッ サ 一 機 能 に エ ス ト ロ ジ ェ ン が 密 接 に 関 与 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 3 . 唾 液 腺 特 異 的 な 自 己 抗 原 12 0 k 0α-fodrinに 対 す る 自 己 抗 体 の 産 生 が 卵 巣 摘 出 に よ り 允 進 し て い る こ と が 判 明 し た 。4
. 標 的 組 織 破 壊 の メ カ ニ ズ ム に Fas/Fasリ ガ ン ド を 介 し た ア ポ ト ー シ ス が 関 与 し 、 エ ス ト ロ ジ ェ ン が 唾 液 腺 細 胞 の Fas抗 原 の 発 現 お よ び 浸 潤 T 細 胞 の Fasリ ガ ン ド 発 現 の 両 者 に 影 響 を 与 え て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 5 .本 研 究 は ヒ ト 自 己 免 疫 疾 患 発 症 に お け る 性 差 の メ カ ニ ズ ム の 一 端 を 解 明 す る 上 で 有 用 で あ り 、 シ ェ ー グ レ ン 症 候 群 の 病 因 に 基 づ い た 治 療 法 の 開 発 に 重 要 な 知 見 を も た ら す も の と 考 え る 。 2メ謝辞
稿を終えるにあたり、本研究課題を与えられ、終始ご指導を賜った林良夫教授に心よ り感謝の意を捧げます。また、御校閲を戴いた口腔外科第二講座佐藤光信教授、口腔細 菌学講座三宅洋一郎教授、ならびに研究の円滑な遂行のために御指導・御協力戴いた口 腔病理学講座斎藤一郎助教授をはじめとする教室員の方々に深謝致します。 29参考文献
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