甘藷フオスファターゼに関する研究（第一報）

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(1)Title. 甘藷フオスフアターゼに関する研究（第一報）. Author(s). 東, 尚巳. Citation. 北海道學藝大學紀要. 第二部, 5(2): 78-82. Issue Date. 1954-12. URL. http://s-ir.sap.hokkyodai.ac.jp/dspace/handle/123456789/5445. Rights. Hokkaido University of Education.

(2) . 第５穆第２号. 北海道学塾大学紀要（第二部）. 昭和２９年１２月. 甘藷フオスファターゼに関する研究（第一報）東. 筒. 巳. 北海道学塾大学旭川分校化学教室２９年７月２５日受付）（. ＮａｏｍｉＡＺＵＤｉＩ＾：ＳｔｕｄｔＰｏｔａｔｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（１ｅｓｏｎｔｈｅＳｗｅｅ）. フオスファターゼが生理的に重要な意義を有して居ることは古くから知られて居り多くの特異的なフオスフ、ァターゼも発見されているが、一般に植物フオスファターゼの場合はその分離に未だ成功していない。高等植物中に見出されているフオスフオモノエステラーゼは所謂フオスフオモノエステラ← ゼ１１で、燐酸のモノエステルを加水分解し、そのｏｐｔ．ｐＨは４～６にあり、Ｍｇイオンにより賦活されず、弗化物により強く阻害されることが知られている動物や酵母、及び植物に於ても馬鈴薯の場合２）はメタフオスファターゼピロフオス、フアターゼからの分離に成功している。これは、植物フオスファターゼ中ピロ燐酸、メタ燐酸燐酸モノエステルに特異的なフオスファターゼが含ま、れているとしても、これらが多くの共通性を有して居ることを示し事実ピロ燐酸メタ燐酸燐酸モノェ、、、、ステル等を基質として作用させた場合、各種影響物質に対する態度その他特性は非常に近い類似性を持ってい. るので、これらフオスファターゼは単一の酵素であるか叉は極めて類似した蛋白質或はａｐｏ酵素が同一の、，、蛋白より成るものであろうと考えられている。併し未だ純粋な状態で取り出されたことはなくその活性点、、構造に関する知識も多くはない。甘藷フオスファターゼに就いては既に報告されているが３）、著者はアセトン、硫安、アルコール等による分別沈澱をくり返えし、メタフオスフターゼ叉はピロフオスファタ← ゼからモノエステラーゼの分離に努め、フオスフオヂェステラーゼを含まぬ酵素は得たが、これらの分離には成功しなかった。併し此の操作中、アセトン分別の段階で、メタ燐酸と β‐グリセロ燐酸に対する活性の比が原液のそれに比、し急に増大すること、及びアルミナＣγ 吸着後ｌｏ％ｐＨ６６のクェン竣緩衝液で溶出する際の此の比が溶．，、、出後期に増大する事等を認めた。叉此の酵素を更にエタノールで分別沈澱して６０～６５％の沈澱部分が他の部、分に比し活性の強いことを認めたが、精製には余り効果はなかった。酵素精製の際アセトン分別を行はずに硫、．返えし、吸着熔出して得た酵素のＱｐはアセトン分別を行った場合よりも大きく安０．４～０．６５飽和を三度くり、４であった２ｘｌ０。更に此の酵素を用いて、弗化ソーダ、モリブデン酸ソーダ塩化第二水銀酸化セレン硝酸銀ヨードチ、、、、、オ硫酸ソーダ、アスコルビン酸、グリセリン等による影響につき実験を行った。実. 験. 酵素の精製千葉懸崖農林一号及沖縄百号甘藷塊茎を磨篠（此の際チロシナーゼを阻止する篤に青化加里を添加してもそ、の効果は認められなかったので大半は青化加里無添加で処理した）搾汁後逸沈で澱粉を除去する褐色の上液、。にｏｏＣ以下に冷却したアセトンをＣ～５ｏＣで加え、４０％から６０％迄の黒褐色沈澱を遠沈でなるべく速に集め、塞気との接触を避けて直ちにクエン酸緩衝液（Ｎ／ｌｏＨ６６），Ｐ．及蒸溜水に溶かし、流水で１８～２４時間透析. した後、不溶解物を遠沈除去する。上澄液を硫安０．４飽和として滴過櫨液を更に０６５飽和として漉過、沈澱．、を蒸溜水で溶解後蒸溜水に対して２４時間３ｏＣで透析、透析液を遠洗沈澱物を除去上燈液にＩＮ‐酷酸を加、、０とし、沈澱した不活性蛋白を瀦去（此の操作で液はかなり淡色となえてｐＨ４．る）、漉液をアルミナＣγ で処－７８－.

(3) . 甘藷フオスファターゼに関する研究（第一報）・６クエン酸緩衝液で溶出する。溶出液を蒸溜水（３ｏＣ）理、酵素を吸着させ蒸溜水で一度洗線後きｌｏ％、ＰＨ６．で透析してこれを酵素液として用いた。ｏｏＣで長期間保存したが、全く活性を失はなかった。搾汁液のメタ燐酸に対する活性と β‐グリセロ燐酸に対する活性の比（これをＭ／Ｇとする）は、春季より多季に互つて時期による差及び品種に依る差も認められず. Ｇの変化第一表精製過程に於けるＭ／. ７３の範囲にあった。併し此の比率がアセトン分０４１～０．．５～２０倍に増加し、ア別を一回行うこ日こより急激に１．．. セトン分別を二回行っても、叉その後の透析その他の処理に於ても著しい変化は認められなかった。併しアルミ. ナＣγ に吸着溶出の際、溶出の前期と後期でＭ／Ｇに極めて著しい相異を生ずることが認められた（第一表）。. ６５飽和の分別沈４～０アセトン分別を行はずに硫安０．．Ｈ０４とし沈澱を澱去返えし澱を三度繰り、、その後ｐ．. Ｉ原. 液．. アセソトソ分別後透析液，′. 静かに置拝しつつ一滴一滴滴下して細かい部分に分け、活性の強い部分を見ようとして、６０％迄に沈澱した部. ，. 硫安分別後透析液０とした際の櫨液硝酸でｐＨ４．第一回吸着後の溶出液. 濃液をアルミナ吸着させて溶出した場合は、Ｍ／Ｇは原液のそれより漸次増大するが、アセトン分別の際に認め. られた様な増加はなく、２０～３０％の増加が認められたにすぎないｏ叉以上得られた酵素液にｏｏ～３ｏＣで無水アルコールを. －. 第. 第第第. 二回三回四回. 二. 表. Ｍ／Ｇ００５５．１１１１１１３. β一グ活る活性垂窒. 素. 含. 量. ５％迄の部分をＢ，６５％迄をＣ分をＡ，６２，７０％迄を．Ｄ，８０％迄をＥとすると、酵素は殆んどＡ，Ｂ，Ｃ中に含まれることがが判った。各部分のメタ燐酸に対する活性の順及び β‐グリセロ燐酸に対する順を示すと第二表の如し。. ！１．各種影響物質の効果１トリメタ燐酸（Ｍ－Ｐとする）、 β－－グリゼロ燐基質として適宜次の燐酸エステルのナトリウム塩を用いた。トＰｌ「）ｒｏ－Ｐ）、フェノール燐酸（Ｐｈｅｎｏ酸（Ｇ－Ｐ）。、ピロ燐酸（ＰｙＨ５）５ｌｏＰ酵素反騰は次の係件で行った。クエン酸緩緩液（Ｎ／．，ｌ入ｃｃを試験管に２ｃｃｃ及各種濃度の影響物質，Ｍｎｏｏ基質ｌｃｔｅしておき、適当に稀釈しｎｃｕｂａれて３ｏ０Ｃ恒温槽中に１０分間ｉ５０倍）ｌｃ１００倍乃至１ｃを加え、反悪液を５ｃｃとしてた酵素液（. 質の代りに蒸溜水ｌｃｃを加えたもの反隠、開始とする。別に影響物を対照とし影響物質及び酵素液の代りに蒸溜水２ｃｃを加えたも. 、. ｏ酷酸緩衝液を用ｌのをブランクとした。沃度の影響を見る時はＮ／ｉｌ絶ｌっ探りＦｓ々隔で各管からｃｃづいた。反願開始後適当な時間. ５０. Ｓｕｂｂｕｒｏｗ法により光電比色計を用い、遊離した燐の量を定量しこｏ. （１）弗化ソーダによる匪害. ｌ ‐Ｐｏ－Ｐこの阻害曲線を第１図に示す。Ｍ－Ｐ，Ｐｈｅｎｏ，Ｐｙｒ，Ｇ－Ｐ２であった。１～３のｐＫｉは殆ど同じで、３．．Ｓ（但／／ｖ～１的であることが１質に対して非桔抗叉此の阻害が基。し、ｖ：反態速度、Ｓ：基質濃度）の関係から到る（第２図）（２）Ｍｏに依る「害第３図の阻害曲線で示される様にＭーＰとＧ‐Ｐ及びＰｙｒｏ－Ｐ一７９一. 第１回. ＮａＦの阻害曲線Ｍ‐Ｐ：平－●－－Ｇ－Ｐ：－－○－－Ｐｙｒｏ－Ｐ：－…‐ こ ……－ ‐ ‐ Ｐｈｅｎｏｌ－Ｐ：－－－ ▲ －・一. 反態時間. ５分１.

(4) . 東. 筒. 巳. ｌとＰｈｅｎｏ「Ｐの阻害に明かな相異が８認められた。ｐＫｉはＭ‐Ｐ：３．，. Ｇ‐Ｐ：３９，Ｐｙｌｂ‐Ｐ．，. 及び. Ｐｈｅｎｏｌ ‐Ｐ：. ０５であった。此の阻害が捨抗的で３．ぁることは・第４図及びｓ－１台の）（Ｓは基質濃度１は阻害物関係；. Ｆ：ＭＮ“. ／. 、濃度１αは阻害物のある場合の反礁速度ｖｉと阻害物のない場合の反感ｉ速度ｖとの比ｖ／）即ち第５図よりｖ明らかである。. （８）水銀の阻害. 第６図に示す様にｐＫｉは各基質に対して４９～５０で殆ど一致する。．．. 此の阻害は非捨抗的であった。（４）Ｓｅ０２の阻害第７図に阻害曲線を示す。Ｍ‐Ｐ. ｌｏ. ●３４Ｐ－ＰとＧーＰのｐＫｉもまと．、ｙｒｏ. 第２. Ｐｈｅｎｏｌ‐Ｐの値は略々２９で且一次．. の阻害で、基質に対して桔抗的であったｏ. 反礁時間. 圃. ２０分. Ｙｏｕｎｇｂｕｒｇ‐Ｙｏｕｎｇｂｕｒｇ. 法で定量. ４Ｏ. 的阻害. ２０分. 法で定量. ５ＭＮ１［［－Ｐｏ２×ヱ０－ｏｌ，：Ｍ［．とＭ４Ｍ－［【Ｎ１［－Ｐｏｌｏｏｌ２：Ｍ．とＭｉＮＧ，：Ｍ【【ｏ２×１Ｏｆｏ１とＧーＰＩＭ ‘ －Ｇ２：１１０１０［ｏｌ．とＧーＰＴＬ. １・鳥. ５Ｍ－１；ＭＩ［－Ｐ０２×１０ｏｌ．とＭ［６Ｎ－ＩＩ：Ｍ［Ｏ２×１０１ｌｏ．とＧ一Ｐ４Ｍ－ＩＩＩ；Ｍ［［ｏ１とＭ［一Ｐｏｌｏ４Ｍ［ ‐ １［「Ｖ：Ｍｏｌｏｏ１とＧーＰ. 反感時間. 考ｘｌｏ. 苓ｘｌが第４圏Ｍｏの桔抗的阻害. ｌ－ｏ，Ｍｏ. ５. ＮａＦの桔抗圃Ｍ［ーＰ：．．ー－－－－－－－－－－－－－－．－－ーＧ－Ｐ：. Ｙｏｕｎｇｂｕｒｇ‐Ｙｏｕｎｇｂｕｒｇ. 第３圏Ｍｏの阻害曲線５分反感時間１. 第. ３Ｏ. ２Ｏ. . ′ . ′′ｆ一′－－′′ －．・一 ′ ・ ′ ′ －ー‐－〆 ′ ． ′ ′ －′－－Ｊ′－ ′－ ‐ －－ ′；－－．. 一８０一. 三も. . 一一－▼ －－′ . . Ｓｘｌｏｇ.

(5) . 甘諸フオスファターゼに関する研究（第一報）. ６. Ｓｅ. ５. ４. ３－『Ｈせ. 第６回Ｈｇの阻害曲線 … ，第１図に於ける記号参照ｏｌ間分反隠時. 第７圏Ｓｅｏｇの阻害曲線ｏ分ｌ反騰時間（５）その他の影響. Ｍ／５０００で殆ど影響を輿えなかった。ヒスチヂソも同様であったｏヨーｌｏｏ～Ｍ／，０００にが、反膜液中Ｍ／２００～Ｍ／２５，止後チオ硫酸ソ←ダを当量加えてから発色させたドの影響を見る際は反瞳停ｉｂｉｔｏｎの効果はｒｅｎｃｕａ亙って阻害が認められた。併し一定の値は得られなかった。叉此の際ヨードと酸素のＰｉｄＡｓｃＡｃｃｏ・ｂｉ. は反旗液中. ｌでは若干阻害を輿え、ｌでは影響を興えないが、２×１０５Ｍｏ認められなかった。硝酸銀は反瞳液中１０５Ｍｏであった。Ｎ‐ ＭＰが他の基質に対するものよりも大ーに対する阻害も増加した濃度の大になるに伴い阻害。２ ‐ ５３ ‐ ‐ ｏＭｌ４×ｌ５ｘｌｏＭ５０２以下で阻害せずｌで、グリセリンはｉｍｉｄｅは１２ｘー～ｉｏｌｏｅｅｔｈｙｌｌｎａ．．、黄血塩及びチオ硫酸ソーダも影響を典えなかった。. 察. 考. 本実験に於て、甘藷塊茎より所謂メタフオスフアターゼ、ピロフオスファタ← ゼ、フオスフオモノエステラーゼの各々を分離することは出来なかったが、原液中の各酵素の活性の比が精製中に変化する事は、これらの. 酵素を精製方法の改良により夫々分離し得る可能性を示すが、各種影響物質の各基質に対する態度を見ると非常に類似した構造を持つ酵素であると推察される。此のフオスファターゼに対するＦの阻害が低濃度で生じ、且非捨抗的に阻害することは第１図及第２図で示Ｊｏ此の阻害機構にされる。又他のｓｏｕｒｃｅからの酸性フオスファターゼについても同様な事が観察されている６叉オンを沈澱させるとかは妨害するによる等ゼ可歓の金属陽イ、ついては、ＮａＦがフオスファターの活性に不ｔｏｉｓの説即ＮａＦがフオスファターゼと解離し得る様な結合の形成説に妥当性の説がある。併し此の際Ｊ．Ｃｏｕｒが認められた。興味あることはＰ０三Ａｓ０３… が捨抗的阻害をするのと同様にＳｅ０２も桔抗的阻害をすることで、これがパ、. ４，. ミインやウレアーゼの場合に酵素分子中の硫黄と酸化的に結合して破壊するのとは異り、陰イオンとして酵素の活性中心或はその近傍に作用するもの．と思われる。ＩＥＲｉｓに依って影響されないと説明し、叉ＰＯＴＴｏｌｒｅａｇｅｎｔＢＡＲＲＯＮＳＩＮＧＥＲは酸性フオスファターゼがｔｈ，. ，ｔｏｌｒｌｒｅａｇｅｎｅａｇｅｎｓに属するもので本酵素ｔＤｕＢｏｌｓであるとしている。所謂ｔｈｉｓはＳｅ０３：，Ａｓ０３三がｔｈｉｏｈｉに瞬く影響を及ぼすもののあることは到ったがそのことから直ちに本酵素がｔｏｌ酵素であるとは云えない。. 、. ｄｅ等の影響も認められず、叉酸化剤としてｆｉｉｄＡｓｌｏｃｙａｎｉｅｏｓｕｌａｔｃＡｃｃｏ・ｂ．Ｔｈｉ，Ｆｅｒｉｉｄ他方Ｓｅ０３：はｔｈｉｏｌｒｅａｇｅｎｔｓｈｌｎｌも同様阻害を奥えないさなかったＮ‐ｔｅｅｍ. 即還流済Ｕとして用いたヨードも余り効果を示. 。. ｅｙｌａ. 。. ｉ［ｖｅｃとしてよりはＡｓ～Ｂ０４等と同様、可逆的に酵素と結合すると考えられる。従って本酵素のａ２０３，Ｈ３ＰＯねＨ：ｅｒとしてｔｈｉｏｌｇｒｏｕｐの役割を期待することの出来ないことは明らかである。ｃｅｎｔ－８１－.

(6) . 東. 一尚. 巳. 要. 約. ０としてアルミナに吸着させ甘藷塊茎よりアセトン、硫安分別後、醐酸によりｐＨ４ｌｏ．、クエン酸緩衝液（ｑ４ ‐ ＫＭ‐ Ｐ６Ｐで溶出してｏ５ｘｌ０４Ｇ％，ＰＨ６が夫々－９ｘｌｏＰＰ：－Ｐ：：．）、Ｑｐ：２ｘｌ，且ｍ，ｙｒｏ－及びＰｈｅｎｏｌ４の精製酵素を得たが精製中のアセトン分別の際にＭーＰとＧーＰに対する活性の比が急激に変化す３３ｘｌｏ ‐ ．、. ることを認めた。叉此の酵素に対してＭｏ，Ｓｅｏ２２，ＨｇＣ１，ＮａＦが低濃度で阻害を奥え、前二者は基質に対して捨抗的に、後二者は非捨抗的に阻害する。，・. 終りに御懇切な御指導を敵いた北大理学部教授高杉直幹博士並びに伊藤英治講師、更に種々便宜を奥えられた．. 生物化学教室の各位に衷心より感謝の意を表します。. 献. 文. ６７１）Ｅ・Ｂ′いいＮＮａｎｄＫ．Ｄ１ＥＤＥＲ１Ｃｒｒｓ，Ｂｅｒ・，，２０１９，（１９３４）. ＰｌｉＴｒｏｌｓ１９３８）ｏｇａ．ＦＭ寛ＲＹａｎｄＪ，ＣＯＵＲ．，Ｅｎｚｙｍｏ，５，２５４，（Ｊｏ１ｌｓｏｃｃｈｉｉｏｌｓａｎｄＭ．Ｂ佃紬Ｒｌ１，ーｎｂ．ＣＯＵ耀ｒ，Ｂｕ．，，２７，４６４（１９４４）くて２ｔｔｓＨＮＡＮ）Ｐ．ｓ．１ｃｈｏｃｈｅｍ．２０．Ｂｉ，Ａｒ，２６１．，２７２（１９４９）ＮＧじｙＥＮ－ＶＡＮ一ＴーめＡ１ーｏｌ．ｃｏｍｐｔ，ｒｅｎｄ，ｅｔａ，ｓｏｃ．ｂｉリー４４，１５８８（１９５０），. 渡辺，今宮，南波，日化誌，７３５２）１９，３１（．３）渡辺，伊藤，竹内，近藤，日化誌，７４３）１（１９５，３６． ●（１９伊藤，近藤，酵素化学シンポジウム，９，１１３．，５４）. ４）Ｄ．ＤＡＳｉｔｕｒｅｅｎｃｅａｎｄＣｕｌ，Ｋ．Ｖ．ＧＩＲＴ，Ｓｃ，１１，１４９，（ー９４５）．. ５）Ａ．ＨＵＮＴ跡Ｒａｎｄｃ．Ｂ．ＤＯＷＮ８．Ｂん１．Ｃｈｅｍ．１５７，Ｊ，４２７．，（１９４５）. ６）Ｇ．Ｅ・ＰＥｒ丁こ一ｔＡＮＮａｎｄＲ．４。ＩＣｈｅｍ．１４２．ＦＢＲＲＹ・Ｂｉ，Ｊ・，５ｒ３，（１９４２）Ｂ．Ｎ」ｉｌ＼ＧＡＮＮＡｅｎｔｓｃｎｄｉａ），Ｃｕｒｒ・（・２０，１０１，（１９５１）・Ｖ．ｓＡＤＡＳＩＶＡＮ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０，１５９，（１９５１）．. ＳＵＭＭ【ＡＲＹｉｄｐｈｏｓｐｌＴｈｅａｃｉｉｉｎａＣγ ｇｅｌａｆｔａｓｅｗａｓｏｂｔ・ａａｎｅｄｆｒｏｍｓｗｅｅｔｐｏｔａｔｏｔ ‐ ｅｒｆｒｏｎｏｎＡ１ｕ１・・ａ，ｂｙａｄｓｏｒｐｔｉｔｆｔｈａｃｅｔｏｎｅａｎｄａＴｈｌｆｆｃｏｎａｔｈｄｉｏｎｗｉｌｎｍｏｎｉｕｍｓｕｌｈｄａｔｅｅｅｎｍｅｒｔｚｌＱｅｒｎｗａｓｅｅｒｏ・１ｏｓｏｅｓａｓｅａｐｙｐｐ．. ４ａｎｄＫｍＶａｌｕｅｓｗｅｒｅａｓｂｅｌｗａｓ２×１０ｏｗ：ｍｅｔａｐｈｏｓｐｈａｔｅ５ｘｉ０一ｔｅ９×１０４，ｐｙｒｏ－ｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａ， β－ｇｌ１ ‐ ｈｈｄｈｈｈｌ３ｉ３ｘｌｏ工ｉｔｅａｎｐｅｎｙｐｏｓｐａｔｅ．ｌｉｉｂｉｉｔＶｅ〔ｅｒｖｅｄｔｈａｔｃｏｎ・ｐｅｔｔｖｅｉｎｌｐｏｓｐａ・ｏｎｗａｓｙ．ｔｗａｓｏｂｓ，ｒｅｓｐｅｃｉｕｍｍｏｌｉｏｘｉｉｌｄｅｉｌｏｒｄｅａｎｄｓｉｄｅｗｅｒｅｎｏｌｕｏｒｃａｕｓｅｄｂｙｓｏｄｅｎｉｕｌｌ・ｄｅａｎｄｓｅｃｃｈｏｄｉｕｍｆｙｂｄａｔ，ｂｕｔｍｅｒｃｕ・ＶａｌｕｅｓｏｆｐＫｉａｒｅｓｈｏｗｎｉｎＦｉｇ．１，３．，６ａｎｄ７ｉｉ１ｌｂｉｔｔｅｉｔｒｎｉｒａｎｈｉｅｄｅｎｚｙｎｅａｎｄｓｔｌｏｗｃｏｎｃｅｎｔｒｉｎｅａｃｔｏｄｉｌｏｎｖｅｏｎａａｔ．. 亡ｔｎｐｅｃｏ１１１ｖｅ．. ′ ‘ ● －・ ′. －８２－.

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