ミズナの貯蔵中における生菌数の変化および細菌叢の変遷

＝調 査＝

ミズナの貯蔵中における生菌数の変化および細菌叢の変遷

清 水 真 紀

_{・石田万里子}

_{・京 井 大 輔}

_†

河原井武人

_{・荻 原 博 和}

Changes of Viable Counts and Microflora in

(

subsp.

） during Storage

Maki S

, Mariko I

, Daisuke K

,

Taketo K

and Hirokazu O

（1 _{College of Bioresource Sciences, Nihon University,}

1866 Kameino, Fujisawa, Kanagawa 252‒0880; † _{Corresponding author）}

緒 言 ミズナ （水菜； subsp. ） は， アブラナ科アブラナ属に属する野菜である．本種は， 9世紀より主に京都を中心として栽培が行われてきた京 野菜であるが1, 7）_{，昭和後期での品種改良やサラダ等の} 洋菜への利用の拡大から全国的に栽培が増加し，作付面 積は2000年代に1,658 ha （平成18年） から2,530 ha （平 成24年） へと急激に拡大した11, 12）_{．また，生産量の増} 加より平成22年からは「指定野菜に準ずる野菜」に選 定されている．伝統的にミズナの利用は鍋物や漬物が主 であったが6）_{，近年ではサラダ・惣菜や袋詰めカット野} 菜など，最小限の加工で利用されるケースが多い8, 17）_． このような利用では，食品衛生学的な安全性を確保する ことは当然であるが，品質を保持し，鮮度保持期間を延 長することも極めて重要である4）_． 地方野菜であったミズナは，急速に普及したため，他 の主要作物と比較して微生物学的な知見は少ない．食品 衛生学的な観点からのミズナの微生物調査はすでに行わ れており，腸管出血性大腸菌やサルモネラ属菌など食中 毒菌の汚染実態調査が行われているほか8）_{，一般生菌数} や大腸菌群数といった一般的な衛生指標については報告 がある8, 13, 18）_{．しかしながら，鮮度保持につながる腐敗} 原因菌に関する具体的な情報は，現時点でわれわれが知 る限りでは見られない．同じ葉物野菜であるレタスやホ ウレンソウでは細菌叢中の腐敗原因菌が特定されること によって，腐敗メカニズムや汚染経路の解明が進んでお り4）_{，ミズナにおいても同様のアプローチが行われるこ} とで，効果的な微生物制御法につながる知見が得られる と期待される． 近年，次世代シーケンサーの普及とともにサンプル中 の細菌叢の菌種構成を明らかとする16S rRNAメタゲノ ム解析が確立された．本手法は，これまでの腐敗原因菌 の特定で多く用いられてきた菌株の分離および性状試験 による同定というアプローチと比較して，難培養性細菌 も含めて評価できることや，多くの時間と手間を省略で きるという点で利点がある14）_{．以上より，本調査では，} ミズナの貯蔵期間中での細菌叢の挙動を16S rRNAメタ ゲノム解析によって調べることにより，その主となる腐 敗原因菌を特定し，鮮度保持期間の延長ならびに微生物 制御法の開発に資する知見を得ることを目的として行っ た． 材料および方法 1. 検 体 2019年4月から7月にかけて神奈川県内のスーパー マーケット2店舗にて購入したミズナを使用した．ミズ ナは1∼2袋を1ロットとして3ロット（茨城県産2生産 者2ロット； 千葉県産1生産者1ロット）を使用した． 切断面からの腐敗を観察するため，根本から1 cmを切除 した後，各ロットを3束に分け，チャック付きのポリプロ ピレン製の袋に入れて密封し，20℃下で0, 72, 168 hrの 貯蔵を行った．貯蔵後，切断面から9 cmまでを3 cmご † _{連絡先 TEL: 0466‒84‒3972} E-mail: [email protected] 1 _{〠252‒0880 神奈川県藤沢市亀井野1866}

とに切断および採取した．採取したサンプルを計量し， 9倍量 (v/w) の0.85％ NaCl 生理食塩水を加えてスト マッキング処理を行った．その後，得られた懸濁液を生 菌数測定と16S rRNAメタゲノム解析に供した． 2. 生菌数測定 各検体のけん濁液を0.85％ NaCl 生理食塩水を用いて 段 階 希 釈 を 行 っ た 後，Trypticase Soy Agar （BD社； New Jersey, USA） に塗抹した．30℃下で48 hrの培養 を行い，コロニー数を測定した．

3. 16S rRNAメタゲノム解析

各検体の懸濁液1 mlよりDNeasy Blood & Tissue Kit （Qiagen社； Venlo, the Netherlands） を用いてDNA抽

出を行った．抽出されたDNAを鋳型として16S rRNA V1‒V2領 域 をPCR増 幅 し5）_{，MiSeq Reagent Kit v2} (500 cycles) （Illumina社； California, USA） を利用して MiSeq （Illumina社） によるDNAシーケンシングを行っ た．得られたリード配列について，Qiime2 pipelineに よる各リードの同定を行った2, 15）_{．同pipelineにてサン}

プル毎に全リード数に対する各operational taxonomic units (OTUs)のリード数から各OTUsのサンプル中の 細菌叢における構成比率を明らかとした．その後，サン プル間で各OTUsの菌種構成比率について主成分分析を 行った． 4. 統 計 解 析 生菌数および16S rRNAメタゲノム解析によって明ら かとされたサンプル内の菌種構成比率に対しては，統計 解析処理ソフトウェアRを用いて統計解析を行った16）_． 生菌数については，その挙動に影響を及ぼす要因を明ら かとするため，「貯蔵時間」と「切断面からの距離」に 対して二元配置分散分析を行った．その後，二元配置分 散分析によって有意差の示された要因（有意水準5％） についてBonferroni法による検定を行った． 菌種構成比率に関しては，主成分分析の結果において 第1主成分 (PC1) への因子負荷量が上位/下位5種の OTUsの構成比率について，その挙動を明らかとするた めに貯蔵時間の異なるサンプル間で一元配置分散分析を 行い，有意差が示されたOTUs （有意水準5％） につい てBonferroni法による検定を行った． 結 果 1. 生菌数の推移 168 hrの貯蔵後において，切断を行った断面は褐変し ていたが，それに続く茎部に関しては褐変および組織の 軟化等は見られなかった．また，葉においては一部で黒 ずんだ変色と組織の軟化が見られた(data not shown)． 切断面からの距離が遠い部位程，この変色した葉の割合 は大きかったが，切断面からの距離の異なるサンプルの 間で有意差は見られなかったことから( =0.22)，茎葉の 変化は，細菌よりも植物組織による自己消化作用や酵素 的反応であることが示唆された(Fig. 1)． 生菌数について，貯蔵時間と切断面からの距離に対し て二元配置分散分析を行った所，貯蔵時間に関してのみ 有意差が見られた（有意水準1％）．また，貯蔵時間と 切断面からの距離の間で交互作用は認められなかった ( =0.99)． そ こ で， 貯 蔵 時 間 の 異 な る サ ン プ ル 間 で Bonferroni法による検定を行った所，貯蔵時間の増加に 伴って有意に生菌数が増加することが確認された．貯蔵 前では6.7±0.8 Log10 cfu/g (mean±SD) であった生菌

数は，72 hrの貯蔵後には7.8±0.4 Log10 cfu/g, 168 hrの

貯蔵後では8.6±0.5 Log10 cfu/gに増加した (Fig. 1)．

2. 菌種構成の変化

16S rRNAメタゲノム解析では最低2,061, 最大30,902,

Fig. 1. Behavior of viable counts in during stor-age under 20℃.

Each bar at the storage time point indicate the viable counts of the part of from the cut section; black bar: 0‒3 cm, left hatched bar: 3‒6 cm, white bar: 6‒9 cm. Error bars indicate standard deviation. -value were calculated by Bonferroni-correction between the storage time points using R16）_．

Fig. 2. PCoA plot of composition of microflora.

Plot shapes showed the part of from the cut section; circle: 0‒3 cm, square: 3‒6 cm, trian-gle: 6‒9 cm. Plots belonged in same lot and same part were connected by arrow according to time series (0→72 hr, 72→168 hr).

平均8,727のリードが得られた．また，72 hr貯蔵後の切 断面から0∼3 cmの1サンプルのみシーケンスデータを 得ることができなかった．そのため，そのサンプルを除 いた26サンプルの菌種構成比率について主成分分析を 行った (Fig. 2)．同ロットおよび同切断面からの距離の サンプルの菌種構成比率の変化を貯蔵時間の経過に準じ て追った場合，各プロットは貯蔵前の時点では大きく分 散している一方で，貯蔵時間の経過に伴ってPC1軸で 正の方向へ収束した．このことから，貯蔵前ではサンプ ル毎に菌種構成にばらつきがあり，貯蔵によって菌種構 成が特定の構成比に収束することが示された．また，こ れらの菌種構成比率の変化も生菌数と同じく切断面から の距離は影響していないことが示された． 3. 菌種構成比率を変化させる主要菌種 前項の菌種構成比率の変化の解析において貯蔵時間の 増加に伴ってPC1軸に対して正の方向へ菌種構成が変 化したことから，PC1に対する因子負荷量の上位および 下位の各5種のOTUsについて，貯蔵時間の間で一元配 置分散分析を行った (Table 1)．その結果，PC1に対す る 因 子 負 荷量 が 正 のOTUsに お い て は，OTU0207と OTU0352にて貯蔵時間によって構成比率が変化してい る可能性が示された ( < 0.05)． OTU0207とOTU0352について貯蔵時間の間での構成 比率の変化を調べた結果，両OTUsは，貯蔵時間の増加 によって構成比率が増加することが確認された (Fig. 3)． これらのOTUsの挙動について見た場合，OTU0207は 貯蔵時間0 hrから168 hrにかけて直線的に構成比率が増 加しているのに対して，OTU0352は貯蔵72から168 hrに かけて構成比率が増加することが示された．なお，SIL-VA databaseよりOTU0207は sp., OTU0352は sp.と同定された15）_． 考 察 市販の生食用葉菜類における一般生菌数は，その種に もよるが，5.5 Log10 cfu/g程度であるとされている21）． 対して，本調査でのミズナの一般生菌数は市販されてい る時点で6.7±0.8 Log10 cfu/g (mean±SD)であり，他の

葉菜類と比較してやや高い結果となった (Fig. 1)．これ は，ミズナが細い葉茎が密集した形態を有しており1）_， 他の葉菜類と比較して重量あたりの表面積が多いことに 起因すると推察される．ただし，本調査に用いたミズナ は，市販されているものであり，一般生菌数は，室温を 想定した20℃下で1週間の貯蔵で約2 Logの増加が見ら れたことから，収穫から販売までの流通過程において増 加した可能性があることは考慮する必要がある．また， 本調査では通常の加工過程で行われる洗浄処理を加味 していないが，弁当および惣菜の衛生規範にて，生野 菜等の未加熱処理のもので望ましいとされる生菌数 6.0 Log10 cfu/g以下を満たすためには，他の野菜と同等 もしくはそれ以上の十分な洗浄と良好な保管条件が必要 であると考えられる9）_． ミズナは草丈が50cm以上になる野菜であり，ほとん どの場合でカットして利用される．植物組織の切断は，

Table 1. OTUs which showed higher or lower roading factor for PC1.

OTUs Roading factor

(PC1)

Number of detected

samples* Composition rate One-way ANOVA _{Identification}†

0 hr 72 hr 168 hr 0 hr 72 hr 168 hr -Value OTU0076 −0.25 4/9 4/8 6/9 7.9±15.8％ 2.1±2.4％ 1.7±1.4％ 0.36 sp. OTU0571 −0.18 1/9 1/8 0/9 3.3±9.3％ 0.2±0.6％ 0.0±0.0％ 0.43 spp. OTU0010 −0.15 2/9 1/8 0/9 2.9±7.7％ 0.3±0.7％ 0.0±0.0％ 0.41 sp. OTU0246 −0.13 2/9 1/8 1/8 2.8±7.6％ 0.0±0.1％ 0.0±0.0％ 0.38 sp. OTU0138 −0.10 1/9 0/8 1/8 1.8±5.0％ 0.0±0.0％ 0.0±0.1％ 0.41 sp. OTU0207 0.13 6/9 8/8 9/9 4.3±4.2％ 6.0±3.4％ 9.5±4.1％ 0.04 sp. OTU0249 0.08 4/9 6/8 5/9 0.6±0.8％ 2.2±2.9％ 4.9±5.6％ 0.09 sp. OTU0352 0.08 7/9 8/8 9/9 3.9±4.1％ 2.3±1.8％ 6.6±3.1％ 0.04 sp. OTU0717 0.07 6/9 6/8 9/9 1.9±2.3％ 3.5±2.6％ 2.9±3.2％ 0.52 sp. OTU0713 0.06 6/9 8/8 8/9 8.2±9.6％ 3.2±1.3％ 2.9±2.1％ 0.15 sp.

*; Number of detected samples per number of total samples.

†_{; Identification was based on 16S rRNA V1‒V2 region.}

Fig. 3.  Boxplot of composition rate of OTU0207 and OTU0352 in the microflora.

A） OTU0207, B） OTU0352. -value were calculat-ed by Bonferroni-correction between the storage time points using R16）_．

細胞内容物の流出や微生物の侵入などを引き起こし，腐 敗を促進することはよく知られており4）_{，本調査では切} 断面からの腐敗を調査するため，切断面からの距離ごと に分けて細菌の挙動を調べた．結果として，生菌数およ び菌種構成の両方において切断面からの距離による影響 は見られなかった．植物は切断面にカルスと呼ばれる癒 傷組織を形成することが知られており，カルス形成が切 断面からの腐敗を抑制した可能性が考えられる23） _．ま た，ミズナを含むアブラナ科の植物は組織の破壊によっ てグルコース配糖体であるグルコシノレートからイソチ オシアネートを生成する10）_{．特にミズナに多く含まれ} るグルコシノレートであるグルコナピンのイソチオシア ネートは，黒腐病の原因となる に対する抗菌活性が報告されている22）_{．以上より，} ミズナの切断面のカルスによる癒傷および生成されたイ ソチアシアネートによる抗菌効果によって切断面からの 腐敗が抑制されたと推察される． 切断面からの距離にかかわらず，貯蔵時間の増加に 伴って生菌数が増加したことから，ミズナの葉茎表面で 全体的に細菌の増殖が起こったと考えられる (Fig. 1)． また，貯蔵時間の増加に伴ってミズナ中の細菌叢の菌種 構成は収束し (Fig. 2)，それを推進した菌種はOTU0207 ( sp.) とOTU0352 ( sp.) であっ た (Table 1, Fig. 3)． 属は，根粒菌として知 られているが，一方で，植物に腫瘍を引き起こす種も内 包した属である3）_{．このことから，OTU0207がミズナ} に対して高い腐敗活性を有している可能性が考えられる が，現時点では 属の野菜に対する腐敗活性 は明らかとされておらず，さらなる調査が必要である． 一方，OTU0352が同定された 属は，野菜 の腐敗に関与する細菌としてよく知られている20）_．興 味深いことに，OTU0352の顕著な構成比率の増加は貯 蔵72 hr以降に発生した．自身以外の微生物が産生する ペクチナーゼやセルラーゼなどによる植物組織バリアの 破壊によって，植物組織への侵入が可能となる例が報告 されており19, 20）_{，OTU0352も植物組織の分解が進行す} ることによって急激な増殖が可能となる菌種であると推 察される． 本調査で使用したミズナは，3ロットと少数であり， 得られた知見を一般化するためにはより多くの調査が必 要である．だが，われわれの知る限り，本調査はミズナ の貯蔵中における腐敗細菌の挙動を解析した初の事例で あり，また，本調査結果において顕著な増殖を示した菌 種はミズナの品質劣化において少なくない影響を有して いると推察される．以上より，本調査結果にて明らかと された細菌叢の挙動および示唆された腐敗細菌の特性の 解明により，ミズナの貯蔵および品質保全の最適化が図 られることが期待される． 文   献 1） 青葉高： ツケナ類の品種生態と作型．野菜園芸大百科  第2版 17 ハクサイ・ツケナ類・チンゲンサイ・タア サイ．農文協編，p. 225‒226. 農村漁村文化協会，東京 (2004).

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