血 清 ト リ グ リ セ ラ イ ドの 定 量

血 清 ト リ グ リ セ ラ イ ドの 定 量

御

政 明

岡山大学温泉研究所 温泉医学部門 (指導 森 永 寛 教授)

1.緒 R

脂肪 は生体内で熱源 として,あるいは非熱源的代謝機 能 を営む点 において,栄養上大切な物質であるが,近年 中性脂肪の直接定量法が開発 されると共 に,種 々の疾患 ことに動脈硬化症 と関係 した心臓血管系症愚 と血清 トリ グ リセライ ドとの関係が非常な注 目を引いてい る.

血清 トリグ リセ ライ ド(以下TGと略記)の直 接 比 色 定家法については,VANHANr)ELetal.(1957,1961),

CARLSONetal.(】959),末広(1961),川 t‑ll(1962,1963, 1966),福井(1962)等 に よって報告 されてい るが, これ

らの方法に もとづいて血清TGの 定量 を行なって も精 密度,正確度 において満足すべ き結果が得がたい.そ こ で著者は用字法 として現在広 く使用 されているクロモ ト ロープ懐 を用い る比色法 (主 としてVANHANDEL一冊出 変法),およびALItOAnalyzerに多少手 を加 えるこ とに よ り定量が可能 となるLoFLAND(1964)の半 自動分析法 について検討 したので報告iす る.

Table1.SchcnleOFAnalysis*

Sfanda7･ds.

Trlpalmitinstandardsob.(4mg/dり

0‑

0‑

SamplesI

To0.5gofFlorisiladdthe

followlngSubstancesjnsuccession:

CHClli:2,5ml Serum :0.1mJ CHC13:2.5mg Agitatefわr10minutes.

Centrif‑ugeTorlOrTlin.at3000r.p.m.

Takeupthesuperllatant(lmlrorMM or2mlforSAA).

Evaporatefor15m]'n(forMM),orfor25min(forSAA)at850C Add 0.5mlC2H50H‑KOH solution,andmix.

HeatforlOmin.at60oC,andcool. Add1droporも罪 aceticacidsolution.

Evaporateuponanoilbathfわr10min.atlOloC.

ForSAA:

Add2mJorH20.

Bringthesolutionto theAutoAnalyzer.

*

SAA;semi‑automatedanalysts.

ForMM :

Add1mloflH20andmix.

Add1dropofO.56%NaIO4SOlution.

Standfわr10minutesjnthedark.

Add1dropor5%NaHSO3SOlution StandFor5minuteslnthedark.

Add4mJorthechromotropicacidreagent. HeatinboiliilgWaterbatllfわr40min.,andcool. Measuretheabsorbanceat570m/〜.

78 _{御 船}

2.用字法による分析法 2‑1.装 置

加熱水浴装置および油浴装置 として大和科学製 ウォー ターバス ･ミニ‑ BT‑11形 を使用 し,油浴 と して 使 用 す る場合には,加熱浴剤 としてAtltOAnalyzerのHea‑

tingbath用鉱物油を使用 した.振 とう器 と して大和科 学製 シェーカーSK‑13形 を使用 し,分光光度計 として 日立製101形分光光度計 を使用 した.AutoAnalyzerは, 標準AutoAnalyzerを基礎 と し, これ をLoFLANDに 準拠 して手を加 え,さらに多少改良 して使用 した.

2‑2.試 薬

i)クロロホルム (特級,石津製薬 あるいは和光純薬). ii)フロ1)ジル (和光純薬,6 0‑100メッシ ュ). iii)パ‑ムチット(ビタ ミンB1定量用 ,日本 ビタ ミン 学会,50‑80メッシュ).

iv)シリカゲル (クロマ トグラフィ‑捕,石 津 製 薬 , 80‑200メッシュ).

ヽ′)シリカゲル (青色中粒 ,石津製薬,6‑10メッシュ).

08

07

06

⊂

｣⊃

O

｣つ く 04

03

02

0 I

0

政 明

これ らの吸着剤は120eC,3時間加熱活性化 して 使用 し た.

vi)エタノール性 水 酸化カ リウム溶 液.使 用 直 前 に 2.5g/dJ水酸化カ リウム水 溶液1容 とエタノール (特級, 石津製薬 あるいは和光純薬)19容 とを混和 して作 る.

vii)6%酢酸水溶液.

v

iii)0.54%メタ過 ヨウ素酸ナ ト1)ウム(NaIO 4)水 溶 液 (特級,石津製薬 あるいは和光純薬).用手法の際には 2週間 ごとに作 りか える.半 白動分析法の際 に は,1% 溶液を3日ごとに作 る.

ix)5%亜硫酸水素ナ トリウム(NaHSO 3)潜披 (特級 , 石津製薬 あるいは和光純薬).用手法の 際には3日 ご と に作 りか える.半 自動分析の際には,6%溶液を3日ご とに作 る.

x)クロモ トロープ酸試薬 .100mでの三角 フラスコに蒸 留水250mgを入れ,水 冷 しつつ 硫酸 (特級 ,和光純薬) 300mJを少量づつ加 え,添加終了後水冷 し,さらにマグ ネチックスターラ‑を周いて援拝 しつつ クロモ トロ‑プ 酸 (同仁薬化学研究所)1gを加 え,完全 に溶解す るまで 遮光 して2‑ 3時間横枠 をつづける.潜解後褐色瓶に保

300 400 500 600 700

Woyelenglh,mJL

Fig｣ .Absorptionspectra

存する.

xi)標準液 (貯蔵液,100mg/dl).トリステア リン (特 級,半井化学)100.0mgを ク ロ ロホル ムに溶 か して 100mgとす る.

xii)標 準 液 (使用液,4mg/dり.貯蔵液をクロロホル ムで25倍に稀釈する.

213.分析方法

表1に分析の手順を示す.即 ち内容約 20mgの共栓

付

遠沈管に活性化 したフロリジル0.5gを入れ,次いでク ロロホル ム2.5m/,血 清 (あるいは関節液)0.1mJを加 え,さらにクロロホル ム2.5mgを加 えて 密栓 し,シェ ーカーで 10分間振 とう後毎分3000回転10分間遠沈する.

上 澄 液1.Oml(半 自動分析法の 際には2ml)を内 容 約 10mJの共栓付試験管にとり,85oCの 油浴中で15分 間

000

dtuo

Lg

0

Fig.2.Calibrationcurvefortrlglycerides Lと澄液2mg使用する際には約25分間)加熟 し,溶 媒 を 蒸発除去する.蒸発残透 にエタノール性水酸化カ リウム 溶液を0･5m川口え, ミキサ‑を用いて濃拝混和後 密 栓 して60oC湯浴中で10分間けん化を行 う.冷後6970酢酸 1滴を加 えて横枠混和 し, けん化液をpH〜 6の弱 酸 性 にする.次に101oCの油浴で10‑15分間 加 熱 し,常圧 でエタノールを蒸発除去する.冷却後蒸留水lmJ(半 自 動分析法では2ml)を加 え,試験管内の蒸発残液を溶解 す る.次に0.5%メタ過 ヨウ素観ナ トリウム液1滴 を加 えて密栓 し,充分撹拝混和後暗所 (実験台下の戸棚内で よい)に10分間放置 し,次 に5%亜硫酸水素ナ トリウム 溶披1滴を加 えて密栓 し充分横枠混和後暗所に 5分間放

置す る.次いで クロモ トロープ酸試薬4mJを添 加 し, 密栓 して上下に振 とう混和後,煮沸水浴中遮光 しつつ30 分間加熱 (ご飯蒸器を使用する)発色 させ る.水冷後光路 長10mrnで 波長570m/りこおける吸光度 を水を対照に して測定 し,空試験の吸光度をさし引 き検量線か らTG の含有率を算出する.

24 実験結果

2･4･1.吸収曲線 グ リセ 1)ン4.6γをとり,蒸留水を 加 えて全量を lmJとし,以後表 1の手 順 に従 って得た 呈色液および試薬空白検液の吸収線 を図 1に示す. この 場合570m〟に吸収極大がある.

2･4･2.検量線 内容約10mgの共栓付 試験 管 に そ れ ぞれクロロホル ム2.0m/, トリパル ミチン標準液0.25, 0.50,1.0,1.5,2.Omlをとり表 1の手順に従って 操 作 した結果,

図

0∩)

TJuJoLg‑D巴UE)qLOSqY

t ■

■ ■

■ ■

3 ' , !

e 8

0

FEorls■l PermH SH'⊂ロgel S‑1■亡C)ge一 (for亡hromologrophy)

FJg.3.Err‑ectof'absorbentsforthree humanserum samples

2‑4‑3.吸着剤 従来多 く使用 されている吸着剤 の フ ロリジル,パ←ムチット, シリカゲル (クロマ トグラフ ィー用),最近までわれわれが 使 用 して きたシリカゲル (青色中粒)を使用 し,3人の血清中のTGの分析を表t の手順に従 って行ない,得 られた結果を図3に示 した, 図 3によって,吸着剤 としてフロリジル,次いで シリカ

80 _{御 船} ゲル (クロマ トグ ラフ ィー用)の 優 れてい ることが 明 ら かで あるので,本 法では フロ リジルを使用す ることに し た.

2‑4･4.振 とう時間 同一血清 を使用 した 場 合 の, シ ェーカーによる振 とう時間 と吸光度 との関係 を図4に示 す.振 とう時間5‑30分では一定の吸光度 を示すので , 本法では10分間振 とうす ることに した.

?JLUOZg

‑O

十

Fig.4.Effectoftimeorshakhg

2･4･5.けん化時間 内容約10mgの 共栓 付 試 験 管 に 人血清のTG の クロロル ホ ム抽 出液lmJを と り,85oC の油浴中で溶媒 を蒸発除去 し,残透にエタ ノール性水酸 化 カ リウム溶液0.5mgを加 え振 とう後,60oCの恒 温槽 中でけん化 を行い,得 られた吸光度 とけん化時間 との関 係 は図5に示す とお りで, けん化時間は10分で充分な こ

とがわか る.

ALLLOLのーOCJUDqJ.SE7y 汁‑一一一一一>‑ ＼一一一一一一一一一‑ ヽ

0 5 10 15 20 25 30 35 JIU Tlme.mln

Fig.5.Re一ationbetweenthetimerequired forsaponificationandabsorbance

政 明

2‑4‑6.エタノールの除去方法 ク ロ モ トロ‑プ酸 試 験薬 を用 いて ホル ムアル デ ヒ ドを発色 させ る際, エタノ ールが残存す る と発色 を妨害す るので,除去す る必要 が ある.ユタノ‑ル を除 くためVAN H ANDELetal.(1957), 川 出(1966)等 は, けん化の終 った液 に そ れ ぞ れ0.2N

硫酸溶液0.5m/,0.1^N硫酸溶液lmJを加 え,硫酸酸 性 rp打‑ 1)に し,沸騰水浴 中に入 れ,常 圧で蒸発す る方法 を と り,福井(1962)は,けん化の終 った 液に 6%酢 酸

Tf∈OLのlOeUDqLOSqY

Fig.6.Re一ationbeweenthetimerequired f‑orevapolationandabsorbance

溶液 2潤 を加 えて酢酸静 性(pH〜 6)に し沸騰 浴中 に入 れ常圧で蒸発 させ る方法 を とってい る.pH‑ 1の 検 液 を沸騰水浴巾で加熱す る方法,pH‑ 1およびpH〜6の 検液 を101DCの油浴 (短時間 にエタノール を除 く目的 と, 浴の空焚 きを防 ぐ目的で使用す る)中で加熱 し,常 圧 で 蒸発 させ る方法 について検討 した 結 果 を 図6に 示 す.

pH〜6の酢酸酸性の検液 を101DCの油浴 中で加熱蒸発 さ せ ると,蒸発 は約5分で完了 し,5‑10分 にわた って 吸 光度 は一定 してい る.本法では10分間加熱す る ことに し た .

214‑7.硫酸 特級硫酸2種類 ,精密分析用硫酸1種類 を使用 して クロモ トロープ酸試薬 を作 り,表1の手順 に 従 って発色 させ ,加熱時間 と吸光度 との関係 を図7に示 した.30‑40分間加熱 した場合 には,3種類 の 硫儀 とも 吸光度 に大差が ない.従 って高価 な精密分析用硫酸 を使 用す る必要 はない.ただ し後述 の半 自動分析法 を使用 す る際 には,加熱時問は約5分 に過 ぎないので,硫酸の摂 択 には注意 を要 し, この場合和光純薬特級硫骸が適 して い る.

2‑4‑8.呈色液の経時変化 図8に示 したよ うに100oC で40分間加熱後直 ちに水冷 し,以後吸光度の変化を観察 す ると,水冷後10分 り40分にわたって吸光度に変化が認 め られなかった.

. ‑一 一 ･ 一 一 一 一 一 ∴

ヽ

5 10 20 30 4O

T)mt!′rnln

Fig.7.Relationbetweenthequalityof H2SO4usedforC.T.A.solutionEtnd

absorbance

‑ ̲ヽ一‑一一･･･‑I‑ ＼‑ 一一ヽ‑ Y‑ Y‑ ＼

､x / × ､ × ‑ × 一 一 ･ 一 ‑ メ

5 10 15 20 25 30

Fig.8.StabiHtyoFcoloredsolution

3.AUTO‑ANLYZERを利用する半 自動分析法

3‑1LoFLAND(1964)は,TGの 半 白動分析法を提案 し た が,そのnow diagramを図9に示す.更 にKES^･ SLERetal.(1965),茂手木等(1965)は,TGの自動蛍光分 析法を記載 したが,蛍光分析法による自動分析法を採用 すれば,血清よ りTGを抽出す る操作以外はすべて自動

*更に最近テクニコン社よ りトリグ リセライ ド(蛍光分 析法による)とコレステロール とを同時に自動分析す

化 されてお り,1時間に 20試料の分析が可能である.し か し標準AutoAua7yzeI･以外に50oCのHeatingbath, Fluorometerを必要 とす る*. その点LoFLANDの半 自 動分析法はその必要がな く,既 製 のmanifoldに手を加 えることによ り標準AutoAnalyzreを使用 して容易に分 析の 目的を達成 しうる. したがって著者はLoFLAND法 について検討を加 えた.その詳細は別に発表の予定であ る. ここには変更の結果のみを記較す る.

Table2.PrecISionoranalytlCalresults bythetwomethod

Number Manua一 method

Semi‑auto‑

mated method

1 54 ! 50

二 i.三 三三

5 53 声 53

1

': 三二 :.1.

8 . 57 1 54

9 57 54

Standardde＼心 tion (111g/dり Coef罰ClentOf‑variance(70)

3･2.装置および試薬

3‑2‑1.装置 標 準AutoAnalyzerを 使 用 し, そ の manlrOldは図10に示す.その他の装置は用手法 の もの を使用す る.

3‑2･2.吉弐薬

j)1%メタ過 ヨウ素酸ナ トリウム溶液 (特級,石 浮 製 薬 あるいは和光純薬).3日ごとに作 る.

1り6%亜硫酸水素 ナ トリウム溶液 (特級 ,石津製薬 あ るいは和光純薬).3口ごとに作 る.

iii)その他の試薬は用手法の ものを使用す る.

3‑3.分析方法

表 1の手順に従って前処理 を行い,図10に 示す月ow‑

diagramに従 って分析を行 う.即 ちけん化後酢酸で弱酸 る装置が発売 された.

82 _{御 船} 性(pH〜 6)にして蒸発乾固し,蒸発残法 に蒸留水2ml を加 えて潜解 し,検液をAutoAnalyzerの カップ に移 して分析を行 う.

Tube7よ り検液(0.60ml/mi n),Tube5よ り1% メ タ過 ヨウ素簡ナ トリウム溶液(0.10ml/mi n),Tube9よ り空気が吸引 され,Singlemi xingcoilを通過中混和顧 化 され,次いでTubellよ り6%亜硫酸水素ナ トリウム 溶液(0.10m//min)が 吸引 され,Singlemixingcoilを 通過中に過剰の メタ過 ヨウ素 酸 は 分 解 きれ,次 い で Tubelよ りクロモ トロープ酸試薬(2.9mg/min)が吸引 され,Doublemi xjngcoilを通過中に混合 され,次いで Doublecoilheatingbathを通過中に加熱発色 し,Jack‑

etedmixerを 通 っ て 水 冷 され た 後, Colorimeter, Recorderによ り比色定量記録 される.分析に要 す る時 間は検液を吸引 しはじめてよ り約18分で,1時間に25の 検液の分析が可能である.

W【】sle Jtコ亡keledslngle

･n‑xlrlgC○Il Cool'ng ‑う

wo†er A｡.d..eX∠

政 明

3‑4.実験結果

半 自動分析法にによる標準液な らびに同一血清を反復 分析 した際のパターンを図11に示す.

用字法による血清 (関節液 も

含

同一血清を使用 して用字法および半 自動分析法によ り 分析 した場合の平均値,標準偏差,変動係数を示す と表

2の如 くなる.即 ち用字法による測 定 値 は,平 均55.0 mg/dl,標準偏差は1.83mg/dl,変動係数は4.69%とな

り,一方半 自動分析法による測定値は,平均53.6mg/dJ, 標準偏差は1.78mg/dl,変動係数は4.68%となる.

4.結 語

血清

TG

I0.040 Tygon 10.045 Tygon 10.0】5 Tygon I0.015 Tygon 0.081 Acldnex ooSl Acidflex 0.081 Acidflex

0.2〜‑H2SO.

Å汀

005MSodlum metaPerJOdatc 0.5M Sodlum arSenite ChromotropJCaCldreagent ChTOmOtrOPlCacidreagent

Fig.9･Flow‑diagram fortriglyceridebyLoFLAND

ACIdfEex TubesIZe

Propく)rr'On･ngPUmP

⊂hrornoIropH:oくId

SomplerJJ Fb‑e･･50]/ごSOmPles

perhour

ReCoTdeT ColorJmeteT 570m〟fLlfer

Fig･10･Propossed月ow‑diagram fortrlglycerides

TTJPOlm■llrrSlonJt⊃rdsoEuIl0JIS ThesElrrlehurnqrISeTUr,I

Fig.1I.A patternoftrlglycerjdedetermi nationbyAutoAna7yzer

00

POLJIむLu]DnUtj∑

0 100 200 mg/dL

Semr‑QUtOmCLted method Fig.12.Correleationbetween the results obtainedbythemanualmethodandthose

bythesemi‑automatedmethod

としてVANHANDEL一川出変法による分析操作全般にわ た り検討 し,特に注意を要す るエタノール除去操作につ いて改良を加え満足すべ き結果を得た.

次にLoFLAND法に基 く半 自動分析法について検討 し, 原法に比 してクロモ トロープ酸試薬の使用量の半減,分 析時間の短縮,Mixingcoilの省略が 可能 とな り,日常 の臨床検査での使用が容易になった.

終 りに臨み,実験にご協力頂いた文部教官綱本宮久恵, 文部教官高橋和枝の両氏に感謝する.

本論文の要旨は,昭和43年10月26日

,

学会路床病理学会 シンポ ジウム "脂質代謝"で発表 した.

引 用 文 献

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THE DETERMINATION OF SERUM TRIGLY‑

CERIDES

byMasaakiMrFUNE(Director:Prof.H.MoRINAGA), DepartmentofMedicine,InstituteforThermalSlm'ng Research,OkavamaUnL‑ve7･Siry

Abstracl. Currentlyacceptedmethodsforserum triglycerides,namely, the manual modified VAN HANDEL‑KAWADEmethodandthesemi‑automated LoFLANDmethod,werecritical一yexamined.Sincethe absorbents,thequalityofsulfuricacid,theprocesses orshakhg,extraction.saponjfication,removalof

政 明

ethanola一tersaponlRcatlOn,andthestabilityofcoil oredsolutionappeartobeessentlalfactorsgoverning precision and accuracy ofthe determi nation,the effectsofthesefactorswerestudied.Itwasfound thattheprocessorremovalorethanolwasmostim‑

portar)t.Toobtainthereproducibleabsorption,itis mostadvantageoustoevaporateoffethanolfrom the solutionofpH=60nanoilbathatlOloC･

Asaresultorre‑examinationonLoFLAND'ssemi‑ automatedmethodusingastandardAutoAnalvzer, itisshownthatthemixingcoilscanbeomitted, therebymakingtheanalysュspossib一eln18･19min‑

utes(IntheoriginalLoFLAND'smethodittakesmore than22minutes).Inaddition,thismodi丘cationre‑ sultsinsmalleramountofchromotropocacidreagent necessary(2.9mJ/min.ascomparedto5mJ/min･in theoriginalmethod).ThedeterminationTa一einthis modi丘edmethodis25samplesperhour･

The average values, standard deviations, and coe庁icientsofvarianceforthesameserum samp一e fortenanalysesaccordingtothesuggestedmanual methodwere55.0mg/dJ,1.83mg/dJ,and4.69%, respectively,andthoseaccordingto the suggested semi ‑automatedmethodwere53.6mg/dl,1.78mg/dl and4.68

%