気 管 支 喘 息 にお け るカ リク レイ ンー キニ ン系 に関 す る研 究
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(2) 940. 高. ア イ ソ トー プ 協 会TRA‑469, を 加 え,室 volの. 温 で30分. ン タ ー)に. ウ ン トを. 粘 液 を除 い た 後,シ リコン処 理 試 験 管 を用 い4℃,. 行 っ た.標. い,検. 体 中 の 蛋 白 含 有 量 はBio‑RAD. assay. kit(BiO‑RadLab.,. し た.こ. 250×g,. g, 10分 間 遠 心 し,沈 渣 を採 取 し た.採 取 した 沈 渣 で 塗 抹 標 本 を作 成 後, May‑Giernsa染. 用 いて測 定. 微 鏡 下(拡. 4). 2). BALF中. に 存 在 す るarginine. esterase活. 性. inhibitorを. 用 い て.そ. 効 果 を 検 討 し た.方. 性)を. 患 者 のBALF(非 例24,. 34,. 含 有 す る気 管 支 喘 息. 発 作 時 症 例3例. 37そ れ ぞ れ4.7,. μg Protein;抗 47そ. れ らの 活 性 阻 害. 法 は カ リ クレ イ ン様 活 性. (TAMeesterase活. 38.7,. 一表1に. 示す症. 21.3×10‑3U/kg. 1.0,. inhibitor(SBTI, 10,. 102,. 例40,. 1μM,. mMのdiisopropyl. ase活 percent. 10μM,. 性 を3H‑TAMe測. 存 す るTAMe. な お,. BALF中. て4,. 16,. E:残. 存 活 性 量)と. USA),お. 漿 カ リ ク レ イ ン(HPK,. Sigma),ヒ. ク レ イ ン(尿)(HUK,ミ. て4〜10%. ト組 織 カ リ. ドリ十 字)を. た. 30mAの 動 後,直. Kabi)ま. 各10μl. 定 電 流 で 約2時. 間泳. ち に 各 ス ラ ブ ゲ ル を3mm間. た は 組 織 カ リ ク レ イ ン 用 合 成 基 質(S‑ Kabi)各150μlを. せ た.各. ester. 検検. ODを. 添 加 し, 24時 間 反 応 さ. カ リク レ イ ン 様 活 性 はBIO‑RADEIA. リー ダー(Model. し て 算 出 し た.. 2550)を 使 用 し, 405nmに. 求 め た.な お,分 子 量1万. て. 以上 の物質 は通. さ な い セ ン ト リ コ ン10に よ る5倍 濃 縮 の ヒ ト血 漿 カ リ ク レ イ ン と ヒ ト組 織 カ リ ク レ イ ン(尿) の 回 収 率 は,そ %で. れ ぞ れ95.1±7.3%,. 98.7±6.?. あ っ た. 結. 果. 精 製 ヒ ト血 漿 カ リ ク よ び4,. mlの 精 製 ブ タ 膵 力 り ク レ イ ン(Sigma, を 用 い た.. 一 化 学)に. ミ ドグ ラ ジ エ ン トゲ ル(PAGプ レー ト4/15,第 一 化 学)に 各 試 料 お よ び標 準 酵 素 と して ヒ ト血. カ リ ク レ イ ン様 活 性 の 対 照 と し. 32×10)3U/mlの. レ イ ン(Sigma,. 1. 定 系 を 用 い て 測 定 し た.. inhibitionはC‑E/C×100(C:被. 体 の 活 性 量,. 気 泳動 は ス ラブ型電気 泳動. シ ス テ ム(DPE‑110,第. 2266,. 0.1mM,. 加 え て 混 和 し た 後,. 間 反 応 させ,残. 気泳. 移 し,血 漿 カ リ ク レ イ ン 用 合 成 基 質(S‑2302,. 0.1,. fluorophosphate(DFP,キ. Osaka)各10μlを. 室 温 に て2時. USA),. セ ン ト リ コ ン. 使 用 し, 5倍 に 濃 縮 後,電. 隔 で切 断 し,各 切 断 ゲ ル をマ イ ク ロプ レー トに. bean. 103KIU/mlのTrasylol(R(Bayer,. WestGermany),. シ ダ 化 学,. Sigma,. 例 のBALFを. 10(Amicon)を. 動 した.泳. Protein)10ul. に 対 し, 0.5, 2.5, 5.0, 25×10‑3mg/mlのsoy trypsin. よ る検 討. に 比 較 的 高 い カ リ ク レ イ ン様 活 性 を. ず つapplyし. 40.0×10‑3U/. 原 吸 入 誘 発 時 症 例2例‑症. れ ぞ れ3.0,. (PAGE)に. (pH 8.9)の ゲ ル 濃 度 勾 配 を もつ ポ リア ク リル ア. (カ リ ク レ イ ン 様 活 性)に 対 し て, 3種 のarginine esterase. 上 皮細 胞 を除 いた出. の ポ リア ク リル ア ミ ドゲ ル 電 気 泳 動 法. 動 の 試 料 と した.電. 種 イ ン ヒ ビ ター に よ る 阻 害 活 性 の 測 定 法. 色 し顕. に み ら れ た カ リク レ イ ン様 活 性. 示 し た2症. あ っ た.. カ リク レ イ ン様 活性 に 対 す る各. BALF中. BALF中. BALF中. り定 間 変 動(inter. ±10.5%で. 大 率1000倍)で. 250×. 現 細 胞 の1000個 分 類 を行 っ た.. 一 測 定 内変 動. ±10.7%,潰. variance)は. 生理 食. 塩 水 で 洗 浄 し,前 述 の 沈 渣 に加 え再 度4℃,. 用. 因 性 ヒ ト血 漿 カ リ ク レ イ ン を 添. (intra‑assay)は assay. 10分 間 遠 心 し,沈 渣 と上 清 に 分 離 した.. USA)を. 定 系 に お け る精 製 ヒ ト. 加 し た 場 合 の 回 収 率 は100.5%,同. 濾 過 し,. さ らに 使 用 した 試 験 管 の 内壁 を約3mlの. 血 漿 カ リ ク レ イ ンの 測 定 範 囲 は0.4×10‑2〜1.6× 10‑1U/mlで,外. steel meshで. 準 曲線 には. protein. USA)を. の3H‑TAMe測. 究 セ. のstainless. 500,. 250μ の3層. 山 大 学RI研. てduplicateで. に み ら れ る細 胞 の 同 定 法. 混 液)50. ウ ン トは 液 体 シ ン チ レー シ ョ ン測 定. 精 製 ヒ ト血 漿 カ リ ク レ イ ン(Sigma,. BALF中. 回 収 した 気 管 支 肺 胞 洗 浄 液 を 間 隙710,. 応 停 止 液(1. μlと 混 合 し 反 応 を 停 止 さ せ た 後 に,カ. 装 置(ALOKA LSc‑701:岡. 豊 3). 10.0X104dpm). 間 反 応 さ せ,反. 酢 酸 と9volの0.02MTAMeの. 行 っ た.カ. 井. 10×10‑3U/ USA). 1.. 気 管 支 喘 息 に お け るBALF中. 様 活 性(TAMeesterase活. 性)に. カ リク レ イン つ い て(表. 1,図1) BALを. 施 行 した健 康 人10例 と気 管 支 喘 息 患 者.
(3) 気 管 支 喘 息 に お け る カ リ ク レ イ ンーキ ニ ン 系 の 役 割 表1. ND:. Not. 注: 22と41,. 正 常 人 と気 管 支 喘息 患 者 のBALF所. Detected 36と44,. 19と45,. 25と47,. 38と48は. 同一症例. 見 とKallikrein様 活性. 941.
(4) 942. 高. 図1. 井. 正 常 人 と気 管 支 喘 息 患 者 に お け るBALF中 カ リク レイ ン様 活 性 の比 較. 33例 の 成 績 を 表1に は3H‑TAMe測. 示 す.カ. 図2. 正 常 人 と気 管支 喘 息 患 者 のBALF中 数(%)の 比較. 好 中球. リク レ イ ン様 活 性. 定 系 で の測 定 限 界 下 限 で あ る. 0.4×10‑2U/ml以. 上 の 検 体 に つ い て,そ の 活 性 値. をBALF中. の 蛋 自含 有 量 で除 した値 と して表 記. した.図1に. は健 康 人 と気 管 支 喘 息 患 者 のBALF. 中 カ リ ク レ イ ン様 活 性 を示 した.正 康 人)で. 豊. 常 対 照(健. は10例 全 例 で カ り ク レ イ ン様 活 性 は 検. 出 不 能 で あ っ た が,気. 管支 喘息 非誘発 時症例 で. は28例 中7例(25.0%),抗. 原吸 入誘発 時症例 で. は10例 中6例(60.0%)に. 検 出 され た.こ. 3群 で 活 性 検 出 率 を 比 較 した 場 合,正 気 管 支 喘 息 非 誘 発 時 症 例,抗 の 順 にBALF中. れら. 常 対 照,. 原 吸入誘 発 時症例. カ リク レ イ ン様 活 性 の検 出 率 は. 有 意 に 上 昇 した(p＜0.05).. 2群 抽 出 で 比 較 し. た と こ ろ,正 常 対 照 と気 管 支 喘 息 非 誘 発 時 症 例 間 で は 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た が,非 で も30.0×10‑3U/μg を示 す 症 例 が3例. Protein以. 認 め られ た.ま. 誘発 時. 上 と極 め て高 値 た,気. 管支 喘. 息 非 誘 発 時 症 例 と抗 原 吸 入 誘 発 時 症 例 間 で は, 後 者 で検 出率 の 上 昇 す る傾 向 が 認 め られ た.正 常 対 照 と抗 原 吸 入 誘 発 時 症 例 間 で 比 較 す る と, 後 者 で有 意 の 上 昇 が み られ た(p＜0.05). 2.. BALF中. へ の 出 現 細 胞 と カ リ ク レイ ン様 活. 性 との 関 係 に つ い て(表1,図2,図3) BALF中. の総 細 胞数や 各細 胞成分 とカ リクレ. イ ン様 活 性 との 関 係 を表1に. 示 す.両. 者 の間 に. 図3. 正 常 人 と気 管 支 喘 息 患 者 のBALF中 数 とKallikrein様. 活 性 の関 係. 婦 中球.
(5) 気 管 支 喘 息 に お け る カ リ ク レ イ ン ーキニ ン 系 の 役 割. 図4. 抗 原 吸 入 に よ る喘 息発作 誘 発 時 のBALF中 (A): IAR陽 性 症 例 で のBALF中. 943. カ リク レイ ン様 活 性 の変 動. カ リクレ イ ン様 活 性 の変 動. (症例22:○ ○,症 例36:● ●) (B): LAR陽 性症 例 でのBALF中 の カ リクレ イ ン様 活 性 の変 動 (症例19:□ □,症 例25:□ □,症 例38:■ ■). は 一 定 の 傾 向 は み ら れ な か っ た.図2にBALF. 支 喘 息 患 者5例. に つ い て, BALF中. カ リクレ イ. 中 へ の 総 細 胞 数 に 対 す る好 中 球 の 出 現 率 を 気 管. ン様 活 性 の 変 動 に つ い て 検 討 し た.症 例 はIAR. 支 喘 息 非 誘 発 時 と抗 原 吸 入 誘 発 時 で 比 較 した 結. 陽 性2例(症. 果 を示 す.正. 19, 25, 38)で. 常 対 照 に 比 し,明. らか に 高 値 を示. 例22,. 36)とLAR陽. 性3例(症. 例. あ る.吸 入 抗 原 は 症 例36が シ ル. し た症 例 が 気 管 支 喘 息 非 発 作 時 症 例 で 症 例23,. ク で あ っ た 以 外 は 全 て バ ク ス ダ ス トで あ っ た.. 35の2例,抗. な お,発. 原 吸 入 誘 発 時 症 例 で 症 例45の1例. に 認 め られ た.そ れ らのBALF中. カ リク レ イ ン. 様 活 性 は,そ れ ぞ れ7.3×10‑3U/μg D, 5.7×10‑3U/μg. Proteinで. Protein, N.. あ っ た.好 中 球 の. 作 後 の 検 体 は 抗 原 吸 入 よ り約10時 間 後. に 採 取 し た. BALF中. の カ リ ク レ イ ン様 活 性 とasthmatic. responseと. の 関 係 に つ い て は, LARを. 示 した3. 出 現 率 と が りク レ イ ン様 活 性 の 間 に は 相 関 は み. 例 で は 非 誘 発 時 に は 活 性 が 低 値 で あ っ たが 誘 発. られ な か っ た.. 後 に は 全 例 高 値 を示 し た.こ れ に 対 してIARを. 図3にBALF中. の好 中球 数(総 細胞 数 にNt. 示 す2例. で は 誘 発 後 で も活 性 の上 昇 はみ られ ず,. %を 乗 じた もの)と カ リクレイン様活 性 の関係. む しろ 低 値 で あ っ た.. を示 す.図 に示す ご とく,正 常対照 にお いて も,. 4.. 気管 支 喘息症例 にお いて も,両 者の 間に は一定 の傾 向は認め られなか っ た. 3. 抗原 吸入 に よる気 管支 喘息誘 発時 のBALF 中 カ リクレ イン様 活性 の 変動 につ いて(図4) 喘 息非 発作 時 と抗 原吸入 発作 誘発 時のBALF 中 カ リクレイ ン様 活性 の両者 を測定 しえ た気管. BALF中. カ リ ク レ イ ン様 活 性 物 質 の 同 定 に. つ いて 1). SBTIの. 気 管 支 喘 息 患 者BALF中. カ リク. レ イ ン様 活 性 に村 す る阻 害 効 果 に つ い て(図 5) 対 照 と し て馬 い た ヒ ト血 漿 カ リ ク レ イ ン に 対 す るSBTIの. 阻 害 効 果 は 図5(A)に 示 す ご と く,.
(6) 944. 高. 図5. SBTIの. 気 管 支 喘 息 患 者BALF中. 井. 豊. カ リ ク レ イ ン 様 活 性,お. よ び 精 製 ヒ ト血 漿 カ リ ク レ イ ン と精 製 ブ タ 膵. カ リ クレ イ ンに対 す る阻 害効 果 (A):精 製 ヒ ト血 漿 カ リ ク レ イ ン(32×10‑3U/me:□. □,. 16×10‑3U/ml:■. □ □ )と 精 製 ブ タ膵 が リ ク レ イ ン(10×10‑3U/ml:○ る阻害 効果 (B):. BALF中. カ リ ク レ イ ン 様 活 性(非. 例(●. ●,●. ○. 〇,症. ●))に. 例40:●. 0.5〜25×10‑3㎎/mlで,ヒ 32×10‑3U/mlに. 誘 発 時 症 例(○. ●,症. 例47:●. ト血 漿 カ リ ク レ イ ン 阻. ブ タ膵 カ リ クレ イ ン. に 対 す る 阻 害 活 性 は 極 め て 弱 く,. ○,○. 対 す る 活 性 阻 害 効 果(症. 対 して さ えdose‑dependentの. 害 効 果 が 得 ら れ た. SBTIの. ○,. さ え12.5%の. ほ ぼ 全 て の 症 例 に 対. dependestの. 阻 害 効 果 が み ら れ た.. 2). Trasylolの. 〇)と 抗 原 吸 入 誘 発 時 症. 〇,症. ○,症. 例37:. に 示 す ご と く,全 症 例 に 対 し て0.1〜103KIU/ml でdose‑dependentの 3). DFPの. 阻 害 効 果 が得 ら れ た.. 気 管 支 喘 息 患 者BALF中. DFPの. カ リク. ヒ ト血 漿 カ リ ク レ イ ンに 対 す る阻 害 効. 果 は 図7(A)に. 示 す ご と く,. dose‑dependentの. 1μM〜1mMで. 阻 害 効 果 が 得 られ た,DFPの. ブ タ膵 カ リ ク レ イ ンに 対 し て も1μM〜1mM. し てdose. でdose‑dependentに. 気 管 支 喘 息 患 者BALF中. 例34:○. 7). 示 す ご と く, 0.5〜25×. 20‑3mg/mlで. 対す. レ イ ン様 活 性 に 対 す る阻 害 効 果 に つ い て(図. カ リ ク レ イン様 活 性 に対. す る 阻 害 効 果 は 図5(B)に. ○)に. ●). 4×10‑3U/ml. 阻 害 箪 で あ っ た.同 一 実 験. 系 でSBTIのBALF中. 4×10‑3U/ml:. 〇,○. 例24:○. の ブ タ 膵 カ リ ク レ イ ン に 対 し てSBTI25×10‑3 mg/mlで. ■,. 4×10‑3U/ml:○. カ. 阻 害 効 果 を示 した.同 一 実. 験 系 で のDFPのBALF中. 力 リ ク レ イ ン様 活 性. リ ク レ イ ン 様 活 性 に 対 す る阻 害 効 果 に つ い. に対 す る阻 害 効 果 も図7(B)に 示 す ご と く, 1μM. て(図6). 〜1mMでdose‑dependentの. Trasylolの. ヒ ト血 漿 カ リ ク レイ ンに 対 す る阻. 害 効 果 は 図6(A)に 示 す ご と く, 0.1〜103KIU/ml でdose‑dependentの Trasylolの 果 も,ヒ. 阻 害 効 果 が 得 ら れ た.. れ た. 4). 気 管 支 喘 息 患 者 のBALF中. 様 活 性 のPAGE後. ブ タ膵 カ リ ク レ イ ンに 対 す る阻 害 効. 図9). ト血 漿 力 リ ク レ イ ン に 対 す る と同 様 に. BALF中. 0.1〜103KIU/mlでdose‑dependentの. 阻 害効 果. 阻 害効 果が 得 ら. 示 し た2症. カ リ クレ イ ン. の 局 在 に つ い て(図8,. に 比 較 的 高 い カ リ クレ イ ン 様 活 性 を 例 に つ い て,そ. が得 られ た.同 一 実 験 系 でTrasylolのBALF中. 性 物 質 のPAGE後. カ リ ク レ イ ン用 活 性 に 対 す る 阻 害 効 果 は 図6(B). イン(HPK)と. の カ リ ク レ イ ン様 活. の 移 動 度 を ヒ ト血 漿 カ リク レ ヒ ト組 織 カ リク レイ ン(尿)(HUK).
(7) 気 管 支 喘 息 に お け る カ リ ク レ イ ンーキ ニ ン 系 の役 割. 図6. Trasylolの. 気 管 支 喘 息 患 者BALF中. 945. カ リ ク レ イ ン様 活 性,お よ び 精 製 ヒ ト血 漿 力 リ ク レ イ ン と精 製 ブ タ. 膵 カ リ ク レ イ ン に 対 す る阻 害 効 果 (A):精. 製 ヒ ト蜘1ク. レ イ ン(32×10‑3U/ml:□. □,. 16×10‑3U/ml:■. □)と□ 精 製 ブ タ 膵 カ リ ク レ イ ン(10×10‑3U/ml:○. 〇,. ■,. 4×10‑3U/ml:. 4×10‑3U/ml:○. ○)に. 対す. る阻害 効 果 (B):. BALF中. カ リ ク レ イ ン様 活 性(非. 例(● ○. 図7. DFPの. ●,● ○,症. ●))に. 例40:●. ●,症. 気 管 支 喘 息 患 者BALF中. 誘 発 時 症 例(○. 対 す る 活 性 阻 害 効 果(症 例47:●. ○,○. 〇,○. 例24:○. 〇,症. 〇)と 例34:○. 抗 原 吸 入誘 発 時症 〇,症. 例37:. ●). が リ ク レ イ ン様 活 性,お よ び 精 製 ヒ ト血 漿 カ リ ク レ イ ン と精 製 ブ タ 膵 が. リ クレ イ ンに対 す る阻害 効 果 (A):精 製 ヒ ト血 漿 カ リ ク レ イ ン(32×10‑3U/ml:□ □. □)と. □,. 16×10‑3U/ml:■. 精 製 ブ タ 膵 カ リ ク レ イ ン(10×10‑3U/ml:○. 〇,. ■,. 4×10‑3U/ml:. 4×10‑3U/ml:○. 〇)に. 対す. る阻害 効 果 (B):. BALF中 例(●. 力 リ ク レ イ ン 様 活 性(非 ●,● ○,症○ 例40:●. ●))に ●,症. 誘 発 時 症 例(○. 対 す る 活 性 阻 害 効 果(症 例47:●. ●). 〇,○ 例24:○. ○,○ ○,症. 〇)と 例34:○. 抗 原 吸入 誘発 時症 〇,症. 例37:.
(8) 946. 高. 井. と対 比 させ な が ら検 討 した 成 績 を 図8,図9に 示 し た.両 2302)に. れ らのmain. と こ ろ に あ り, 15〜27mmの. peakは20mmの. こ ら れ のpeakはHPKの. 示 すmain. peak(48〜63mm)と. 示 すmain. peakに. は 明 らか に 移 動 度 が 異 な っ て い た.ま カ リ ク レ イ ン用 基 質(S‑2266)に を示 し た が,こ. れ らのmain. 巾15〜27mm)とHPKの. 一. お け る 細 胞 成 分 の 検 討 は,す でに 木 村 ら18)によ り 性 成 分 に つ い て も諸 物 質 の 検 出,. 測 定 が 行 わ れ て い るが5)14),カ リ ク レ イ ン様 活 性 物 質 に つ い て の 報 告 は 未 だ み ら れ な い.今 定 に 用 い た, 3H‑TAMeを. た,組 織. 対 して も 活 性. peakは20mm(活. 性. 示 す 移 動 度 と一 致 し,. 示 す 移 動 度 と は 異 な って い た. 考. よる気 管 支 喘 息 患 者 の 末 梢 気 道 領 域 に. 報 告 さ れ,液. 間 に 活 性 を示 し た.. 致 し, HUKが. HUKが. BALに. 者 と も血 漿 カ リ クレ イ ン 用 基 質(S‑. 対 して,そ. 豊. chemical 特 にK‑K系. assayは. 簡 便 さ と感 度 の 良 さの た め,. の 活 性 化 をみ る た め に,生 物 活 性 と. の関連 にお いて繁 用 され る高感度 微 量定 量法 で あ る.こ の 測 定 法 を用 い て も,正 常 人 のBALF 中 に は カ リ ク レイ ン様 活 性 は 認 め られ な か っ た. しか し,気 管 支 喘 息 の 一 部 の 症 例 のBALF中. 察. そ の 活 性 が 認 め られ た こ とは,気. ア ナ フ ィ ラ キ シ ー 反 応 に 際 し て種 々 の メ デ ィ エー ター が 標 的 臓 器 で 放 出 され る8).K‑K系 ス タ ミ ンや ロ イ コ トリエ ン(SRS‑A)な. もヒ ど他 の. ケ ミカ ル メデ ィ エ ー ター と同 様 に,ア. 回測. 使 用 す るradio. ナ フ ィラ. け るK‑K系. に. 管支 喘 息に お. を評 価 す る上 で興 味 あ る所 見 と思 わ. れ る,こ のBALF中. で測定 された カ リクレイン. 様 活 性 物 質 が 肺 組 織 中 に存 在 して い た 組 織 カ リ ク レ イ ン に起 因 す る もの な の か,そ. れ と も血 中. キ シー 反 応 に 関 与 して い る 可 能 性 を示 唆 す る報. か ら の カ リ ク レ イ ン様 活 性 で あ る の か,そ. 告9)10)11)12)があ る.し か し,明 確 に 実 証 し た 報 告. 来 を 同 定 す る こ と は気 管 支 喘 息 の 病 態 生 理 と の. は ま だ 少 い よ うで あ る.著 者 は ヒ トの ア ナ フ ィ. 関 連 を論 ず る上 で 極 め て重 要 で あ る.. ラ キ シー 反 応 時 の 肺 に お け るK‑K系. の動 態 を知. る た め の 一 助 と して,気 管 支 喘 息 患 者 のBALF 中 の カ リ ク レイ ン様 活 性(TAMeesterase活. 今 回 検 出 され たBALF中. の由. カ リ ク レ イ ン様 活 性. は 従 来 報 告 さ れ て い る成 績 よ り,血 漿 カ リク レ 性). を測 定 し,そ の 由 来 等 に つ い て解 析 を 試 み た.. 図8. 気 管 支 喘 息 患 者のBAL‑Fluid中 イン様 活 性 のPAGE後 の局 在. の が リ クレ. 図9. 気 管 支 喘 息 患 者 のBAL‑Fluid中 イン様 活 性 のPAGE後. の 局在. のカ リクレ.
(9) 気 管 支 喘 息 に お け る カ リク レ イ ン ーキ ニ ン系 の 役 割 イ ンや 腺 性(組. 織)カ. Newballら16)に. リ ク レ イ ン15),あ る い は. よ り 報 告 さ れ たbasophil. で,. 3種 のserine. Trasylot,. よ. cellか らのkininogenaseな. どに 由 来 す る可 能 性 が あ る.こ protease. DFP)を. inhibitor(SBTI,. イ ン様 活 性 物 質 の 阻 害 様 式 を,ヒ. あ っ て,好. 中球 の 遊 走 を惹 起,集. ず し もBALF中. の 点 を 知 る 目的. 用 い て, BALF中. は 認 め ら れ なか っ た,こ の 結 果 か ら, BALF中 力 リ ク レ イ ン様 活 性 が 血 漿 カ リ ク レイ ン 由 来 で. kallikrein‑like activity,そ れ にProudら17)に り報 告 さ れ たmast. 947. な い こ と が あ る もの と考 え る. 最 後 に,気. カ リクレ ト血 漿 カ リ ク. BALF中. 管 支 喘 息 患 者 の発 作 誘 発 に よ る. カ リ ク レ イ ン様 活 性 の 変 動 に つ い て 検. 討 し た.気. 管 支 肺 局 所 のmediatorの. レ イ ン お よ び ブ タ膵 カ リ ク レ イ ン とで 比 較 検 討. BALに. し た.そ の 結 果, BALF中. るの で, 1症 例 につ い てBALF中. はSBTI,. Trasylol,. カ リ ク レ イ ン様 活 性. DFPの. い ず れ のinhibitor. に よ っ て もdose‑dependentに. 活 性 阻 害 を受 け,. 積 させ て も 必. へ の 浸 出好 中球 数 として 反 映 し. 反応 を. よ り経 時 的 に 検 索 す る こ とは不 可 能 で あ カ リクレイ ン. 様 活 性 を非 誘 発 時 と発 作 誘 発 後 で 検 討 し た.発 作 誘 発 に よ りIAR陽. 性 症 例 では 発 作 後 のBALF. こ の 点 をみ る 限 りに お い て 対 照 と して 用 い た血. 中に は カ リ クレ イ ン 様 活 性 が 検 出 され な くな り,. 漿 カ リク レ イ ン に 対 す る活 性 阻 害様 式 に 類 似 し,. 逆 にLAR陽. SBTIに. らの こ とか ら, IARで. よ り活 性 阻 害 を受 け ない ブ タ膵 カ リクレ. イ ン の そ れ と は 対 照 的 で あ っ た.ま た, Newball ら に よ り報 告 さ れ たbasophil activityはTrasylolとDFPに たSBTIで. kallikrein‑like よ り阻 害 され,ま. は 強 くは 阻 害 さ れ な か っ た16)と記 載. され て お り, SBTIで. 強 く阻 害 さ れ たBALF中. 牲 症 例 で は 検 出 可 能 とな っ た.こ れ は 非 発 作 時 で既 に 末 梢 気. 道 領 域 に カ リ ク レ イ ン 様 活 性 物 質 が 遊 離 して お り,発 作 後 に は失 活 して い る と考 え ら れ, LAR で は 発 作 後 で も カ リ ク レ イ ン様 活 性 物 質 の遊 離 が 持 続 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た.こ. こに遊. 離 して き た カ リ ク レ イ ン様 活 性 物 質 の 由 来 が 重. カ リ ク レ イ ン様 活 性 は む し ろ組 織 に遊 出 して き. 要 で あ る が,前 述 の ご と く3種 のinhibitorに. た 血 漿 カ リ ク レ イ ン で あ る可 能 性 が 強 く類 推 さ. る活 性 阻 害 様 式 とPAGE後. れ る.し か し,mastce11か kininagenaseのreleaseが. ら もIgEを. 介 して. お こ る こ とが 報 告 さ. ク レ イ ン と考 え られ,冒 賦 活 に はF XII, PKK,. 頭 で 述 べ た よ うに そ の HMW‑KG,お. よ びF XII. れ て お り17),その 酵 素 化 学 的 性 格 が 明 らか で は な. が 複 雑 に 関 与 し,ま た 失 活 に はC1‑inhibitorが. い た め,こ. 関 与 してい る22)23)ことか ら,そ れ ら諸 因 子 のIAR,. の 異 同 に つ い て は 今 後 さ ら に検 討 が. 必 要 で あ ろ う.た だ, BALF中 活 性 のPAGE後. カ リ ク レ イ ン様. LARに. お け る評 価 が 今 後 の 課 題 と な ろ う.. の 活 性 の 局 在 は,ヒ ト血 漿 カ リ. 結. ク レ イ ン と全 く同 一 の 移 動 位 置 に あ り,mastcell をIgEで. 刺 激 した 時 に 放 出 さ れ る カ リ クレ イ ン. 論. 気 管 支 喘 息 の 末 梢 気 道 領 域 に お け る炎 症 反 応. 様 活 性 は 別 の ピ ー ク を示 す24)こ とよ り,こ の 点 か. を含 む 病 態 生 理 の 解 析 の一 助 と し て,気. ら もBALF中. 息 患 者33例 のBALF中. 力 リ ク レ イ ン様 活 性 が 血 漿 カ リ ク. レ イ ン由 来 で あ る可 能 性 が 強 く示 唆 さ れ た. 次 にBALF中. カ リク レ イ ン様 活 性 と末 梢 気 道. カ リク レ イン様 活 性 を測. 1.. 3H‑TAMeを. 用 い たradio. chemical. に よ り測 定 したBALF中. た.炎 症 時 に は 炎 症 組 織 部 位 へ の 白 血 球 の 集 積. 健 康 人 で は 検 出 さ れ な か っ た が,気. が お こ る こ と は 周 知 の こ とで あ る.そ. 誘 発 時 症 例 で は25.0%,抗. して,そ. つ い て は 多 くの 報 告 が あ り,血 漿 カ. 発 時 症 例 で は60.0%に. の議 論 が な され て き た18)〜21).著 者 はBALF中. 支 喘 息 非 誘 発 時 症 例,抗. の. 中球 総 数 と の 関 係 に つ い て検 討 し た が,図2と. が み ら れ た.. 図3に. 2.. 示 す ご と く,そ れ らの 間 に は 有 意 の 相 関. BALF中. 原 吸 入 に よ る発 作 誘. を比 較 し た と こ ろ,正. にBALF中. 管支 喘 息非. 検 出 さ れ た.統. こ れ ら3群. よび好. assay. カ リ クレ イ ン様 活 性 は. リ ク レ イ ン に よ る 白血 球 遊 走 性 に つ い て も 多 く. カ リ ク レ イ ン様 活 性 と好 中球 百 分 率,お. 管支 喘. 定 し,次 の 結 果 を得 た.. 領 域 に お け る浸 出 細 胞 と の 関 係 に つ い て検 討 し. のtriggerに. よ. の 局 在 よ り血 漿 カ リ. 計学 的 に. 常 対 照,気. 管. 原 吸入誘 発 時症例 の順. カ リク レ イ ン様 活 性 の 検 出 率 の 上 昇. カ リク レイ ン様 活 性 とBALF中. へ.
(10) 948. 高. の 浸 出細 胞 との 間 に は,特. 井. 豊. に有意 の関 係は 認め. 5.. BALF中. に 比較 的 高 い カ り クレ イ ン様 活 性. ら れ なか っ た.. を示 した2症. 3.. 活 性 の 解 析 をPAGEを. 抗 原 吸 入 に よ る気 管 支 喘 息 発 作 誘 発 を行 い,. BALF中. カ リ ク レ イ ン 様 活 性 とasthmatic. responseと. の 関 係 をみ た と こ ろ, LARを. 例 に つ い て,そ の カ リ ク レ イ ン様. か ら も, BALF中. 示 す3. 性 は,そ. 用 い て 行 っ た.こ の 結 果. に 存 在 す る カ りク レ イ ン 様 活. の 移 動 度 の 検 討 よ り組 織 カ リ ク レ イ ン. 例 で は非 誘 発 時 に は 活 性 が 低 値 で あ っ た が,誘. 様 酵 素 よ りは む し ろ,血 漿 力 り ク レ イ ン様 酵 素. 発 後 に は 全 例 高 値 を示 し た.な お, IARを. に 起 因 す る もの と思 わ れ た.. 2例 では 誘 発 後 で もBALF中 性 の 上 昇 は み ら れ ず,む 4.. BALF中. 示す. 力 リ クレ イ ン様 活. しろ低 値 で あ っ た.. 稿 を終 わ るに あ た り,御 指 導 な らび に御校 閲 を賜. カ リ ク レ イ ン様 活 性 の 由 来 を検 討. す る 目 的 で行 っ た3種. のserine. hibitor,す な わ ちSBTI,. protease. Trasylol,お. っ た木 村郁 郎 教 授 に深 謝 致 します と ともに,終 始,. in. 懇切 な る御 指 導 と助 言 をい ただ い た林 久智 講 師 に感. よびDFP. 謝 の 意 を表 します.. に よ る 活 性 阻 害 様 式 よ り推 察 す る と, BALF中. 本 論 文 の要 旨は 第36回 ア レル ギー学 会 総会(1986,. カ リ ク レ イ ン様 活 性 は 腺 性 カ リ ク レ イ ン よ りは. 岐阜)に お いて 発表 した.. む し ろ,血 漿 カ リ ク レ イ ン に 類 似 し て い た.. 文. 1) Colman RW: Surface-mediated. 献. defense reactions.. The plasma contact activation. system.. J Clin. Invest (1984) 73, 1249-1253. 2) 牧 野荘 平,小 林 節 雄,宮 本 昭正,信 太 隆 夫,高 橋 昭 三,可 部順 三 郎,中 島重徳:気 管支 喘 息お よ び過 敏 性 肺 臓 炎 に おけ る吸 入 試験 の 標準 法.吸 入試 験標 準 化 研 究会 お よび 「 吸 入 試験 標 準化 に関 す る研 究 」斑.ア レル ギー(1982) 3). 31, 74‑76.. 木 村 郁郎:喘 息の 病 型 と機序,難 治性 喘息 とLAR:シ 来 の展 望 一 医薬 ジ ャー ナ ル社,東 京(1986). ンポジ ウム. 気管 支 喘 息の 治療 一 国 内外 の現 状 と将. pp 31‑45.. 4) Reynolds HY and Newball HH: Analysis of proteins and respiratory lungs by bronchial lavage. 5) Reynolds HY,. Fulmer JD and Kazmierowski. bronchoalveolar. JA: Analysis of cellular. and protein. content of. lavage fluid from patients with idiopathic pulmonary fibrosis and chronic hypersen. sitivity pneumonitis. 6). cells obtained from human. J Lab Clin Med (1974) 84, 559-573.. J Clin Invest (1977) 59, 165-175.. 竹 山博 泰,谷 崎 勝 郎,細 川 正雄,多 田慎 也,中 村 之 信,原 田 み た気 管 支 喘息 の 病態 に 関 す る研 究.‑気. 7) Imanari T, Kaizu T, human urinary,. 寛,佐 藤 利 雄,木 村 郁 郎:気 道 細 胞反 応 か ら. 管支 肺 胞 洗浄 法 に よ る検 討.‑ア. レル ギー(1980). 29, 875‑851.. Yoshida H, Yates K, Pierce JV and Pisano JJ: Radiochemical. salivary and plasma kallikreins;. system in health and disease, Fogarty International. assays for. in Chemistry and Biology of the kallkrein-kinin Center Proceedings No 27, Bethesda, Maryland. (1974) pp205-213. 8) Piper PJ: Anaphylaxis Pharmacology, -98 .. and the release of active substances in the lung; in General and Systemic. Bowman WC eds, Pharmac Ther Part B, Pergamon Press Inc, Oxford (1977) pp75. 9) Newball HH and Keiser HR: Relative effects of bradykinin and histamine on the respiratory. system. of man. J Appl Physiol (1973) 35, 552-556. 10) Newball HH, Keiser HR and Pisano JJ: Bradykinin and human airways. 139-146.. Respir Physiol (1975) 24,.
(11) 気 管 支 喘 息 に お け る カ リ ク レ イ ンーキ ニ ン 系 の 役 割. 11) Piper PJ: Effects of the released mediators. of anaphylaxis. 949. on the target organs.. Scand J Res Dis. Suppl (1977) 98, 40-46. 12) Chyrek-Borowska. S, Hofman J, Tyminska-Brzosko. R, Bortkiewiez J and Szymanski W: Ana. phylactic histamine release during inhibition of the proteolytic and kinin-forming mental animals.. 13) 木 村 郁 郎,谷 崎 勝 郎,竹 山博 泰:気 管 支 喘 息の 末梢 気 道:領域 にお け る細 胞 学 的検 討‑気 よ る検 討‑.医. system in experi. Arch Immunol Ther Exp (1982) 30, 349-352. 管 支肺 胞 洗 浄法 に. の あ ゆみ(1981) 118, 801‑803.. 14) 周 藤 真彦,谷 崎勝 郎,中 田安 成,多 田慎也,竹 山博 泰,佐 藤 利雄,北 出公 洋,木 村 郁郎:気 管 支 肺 胞 洗浄 法 (BAL)に. よ る気 管支 喘 息 をは じめ とす る各種 呼 吸器 疾 患 の検 討(第3報)ー. 15) 木 村 和幸,守 屋. 寛:キ ニ ン系 の生 化 学‑現. 状 と進 歩‑炎. 症(1986). 6,. ア レル ギー(1981)30,. 16) Newball HH, Berninger RW, Talamo RC and Lichtenstein LM: Anaphylactic kallikrein-like. activity.. 17) Proud D, Macglashan. I. Purification. and cheracterization.. DW, Newball HH,. Schulman. 804.. 221‑232.. release of a basophil. J Clin Invest (1979) 64, 457-465.. ES and Lichtenstein. LM: Immunoglobulin. E-mediated release of a kininogenase from purified human lung mast cells. Am Rev Respir Dis (1985) 132, 405-408. 18) Kaplan AP, Kay AB and Austen KF: The prealbumin activator. of prekallikrein.. III. Appearance. of chemotactic activity for human neutrophils by the conversion of human prekallikrein. to kallikrein.. J Exp Med (1972) 135, 81-97. 19) Weiss AS, Gallin JI and Kaplan AP: Fletcher factor deficiency. J Clin Invest (1974) 53, 622-633. 20) Schapira M, Despland E, Scott CF, Boxer LA and Colman RW: Purufied human plasma kallikrein aggregates human blood neutrophils.. J Clin Invest (1982) 69, 1199-1202.. 21) Rebuck JW: The skin window as a monitor of leukocytic functions in contact activation deficiencies in man.. Am Soc Clin Pathol (1983) 79, 405-413.. 22) Schapira M, Scoff CF and Colman RW: Contribution tion of kallikrein. factor. in plasma.. of plasma protease inhibitor to the inactiva. J Clin Invest (1982) 69, 462-468.. 23) Graff VD, Koedam FJA and Bouma BN: Inactivation. of kallikrein. in human plasma. J Clin Invest. (1983) 71, 149-159. 24) 石 丸 文 彦,林. 久 智,藤 田敏 明,鶴 見 尚和,木 村 郁郎:好 塩 基 球 お よ び肺 肥満 細 胞 の カ リ クレ イン様 活 性 に. つ い て.日 血 会 誌(1987). 51, 343..
(12) 950. Studies. 高. on the Part. role. of the. 井. 豊. kallikrein-kinin. 2. Determination. system. of kallikrein-like. in bronchoalveolar. lavage. Yutaka. University Okayama. (Director: Kallikrein-like. activity. fluid. of Medicine, Medical school,. 700, Japan Prof. I.. Kimura). activity was evaluated in the bronchoalveolar. lavage fluid (BALF) of 43. patients (33 bronchial asthma patients and 10 controls) to study the inflammatory the lower respiratory tract of asthma patients. The appearance rate of BALF kallikrein-like 60.0% in asthmatics. after provocation. asthma. TAKAI. Second Department Okayama. in bronchial. response in. activity (BKLA) was 25.0% in asthmatics, and. by a specific antigen,. healthy subjects. The increase in BKLA in asthmatic. whereas it was negative. subjects was significant.. in. BKLA in. patients with an immediate asthmatic response after provocation turned negative, whereas it was positive in their ordinary BALF. On the contrary, BKLA after provocation in those with a late asthmatic response turned positive, whereas it was negative in their ordinary BALF. Characterization character. using three protease. similar to plasma kallikrein.. kallikrein-kinin. inhibitors indicated that BKLA had an enzymatic These results suggest that. the activation. system may have a possible role during anaphylaxis in asthmatics.. of the.
(13)
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