活性酸素を介する造血器腫瘍の新規分子標的療法の 開発

活性酸素を介する造血器腫瘍の新規分子標的療法の 開発

著者 武藤 章弘

雑誌名 星薬科大学紀要

号 50

ページ 15‑20

発行年 2008

URL http://id.nii.ac.jp/1240/00000130/

総  説

活性酸素を介する造血器腫瘍の新規分子標的療法の開発

武 藤 章 弘

星薬科大学 病態生理学教室

Anovel therapy fbr Ilematological malignancies through the intracellu        lar accumulation of reactive oxygen species（ROS）．

Akihiro MUTO

DepαrZme励or pαZん0助ys元oZogy， FαC協y o∫Pんαrmαce磁cαZ 8cfeηces， Ho8砺仇juεr8卵

はじめに

 白血病、リンパ腫、骨髄腫などの造血器腫瘍の治療は、

抗腫瘍薬の開発および多剤併用療法、支持療法などの治 療法の発達により、飛躍的に改善してきている。とくに 白血病の治療においては、治癒を目指すためには白血病 細胞を体内から完全に根絶させることが必要であるとい う total cell kill の概念のもと、強力な多剤併用化学 療法、あるいは強力な化学療法と免疫抑制療法を組み合

わせた後に造血幹細胞を移植する移植療法が行われてい る。しかしながら、化学療法薬は腫瘍細胞への特異性が 低く、正常造血細胞をはじめとする種々の細胞、組織に も作用して障害を来たし、骨髄障害時の感染、出血や臓 器障害に伴い致命的になりうるため、高齢者、臓器障害 を有する症例では十分な量を使用できない。さらに、強 力な多剤併用化学療法後にもかかわらずなお体内から完 全には腫瘍細胞を排除することはできず、化学療法後に 残存した微小残存病変が再増殖することにより一部の症 例において再発しうるうえに1）、再発を繰り返す症例は 次第に化学療法薬に対して耐性を獲得し、治療難治症例

に進展しうるため、治癒が困難となる症例も多い。これ らの問題点は、これまでの化学療法薬のみに頼る治療法 の限界であった。1988年活性型ビタミンA誘導体である all一τrαη8 retinoic acid（ATRA）による急性前骨髄球 性白血病（APL）の分化誘導療法が報告された2）。さら

にATRAの作用機序が、分子生物学手法を用いた研究の 進歩により、ATRAは発病に中心的役割を果たすPML−

RARα遺伝子を標的とする分子標的治療薬であること が明らかとなった。その後、白血病細胞などで種々のキ ナーゼが恒常的に活性化し、その結果腫瘍性に増殖して いることが明らかとなり、キナーゼを特異的に阻害する 薬剤が開発されてきている⑭。

造血器腫瘍における活性酸素種（ROS）の役割  活性酸素種（ROS）は細胞内のミトコンドリアで、

酸素を利用してエネルギーを得る過程で、あるいは紫外

線、タバコ、ウィルス感染、金属イオンの過剰などによっ ても産生される。ROSにはスーパーオキサイド（02−）、

ヒドロキシカルラジカル（・OH）、過酸化水素（H、0、）、

一重項酸素（ 0，）が含まれる。ROSは、おもに蛋白質の システイン残基を酸化することにより、シグナル制御蛋 白質の活性に影響を及ぼし、細胞内シグナル伝達物質と して働いていることが報告されている5 7）。その一方で、

細胞内外で産生される過剰のROSを処理できずに蓄積 した場合、酸化ストレスとなりDNA損傷、アポトーシ ス誘導により細胞を傷害する8・9）。近年、種々の薬物より 腫瘍細胞内外でROSが蓄積することにより、腫瘍細胞 はアポトーシスを起こすことが報告されてきている9 1％

しかしながらROSによるアポトーシス誘導に関する細 胞内分子機構については細胞内ミトコンドリア障害に基 づくもの、デスレセプターの活性化によるものなど一定 の知見がない。これまでわれわれは、capsaicinが骨髄 腫細胞内でROSの蓄積を誘導し、さらにproapoptotic BH3 proteinであるBAX蛋白の発現を増加させること によりアポトーシスを誘導することを見出している（未

発表）。

多発性骨髄腫について

 多発性骨髄腫はおもに骨髄の中でBリンパ球由来の形 質細胞の腫瘍性増殖を来たす疾患である。異常な単クロー

ン性免疫グロブリン（M蛋白）の過剰産生が起こり、正 常免疫グロブリンの産生が低下することにより肺炎球菌

などの細菌感染性をはじめ、重篤な感染症に陥ることが 多く、骨破壊による激しい疾痛、高γグロブリン血症や 高カルシウム血症に伴う腎機能障害、貧血などの症状が 見られる疾患である。日本における罹患率は人口10万 人に対して男子2．9人、女子2．8人、欧米における罹患率 は人口10万人に対して3〜4人である。発病はほとんど が50歳以降であるが、55歳未満の症例が増加する傾向 にある。多発性骨髄腫は多剤併用化学療法により症状の 緩和は得られるが、生存期間延長の効果は概して乏しく、

さらに薬剤耐性を生じることが多く、平均生存期間は約 3年と現在でも難治性造1血器疾患のひとつである。比較 的若年症例では治癒を目指した造」01幹細胞移植を併用し た大量化学療法が行われている。完全寛解は24〜75％

に得られるが、その約90％が再発し、平均生存期間は4

〜5年と短く、満足のいく結果が得られていない，

 近年、骨髄腫細胞の分子細胞生物学の進歩により、多 発性骨髄腫に関する分子病態の理解が急速に深まってい る。それに伴って骨髄腫細胞の増殖、疾患の進展、抗が ん剤の感受性の減弱に重要な細胞内分子に対する分子標 的治療薬が数多く報告されてきている、現在の臨床の場 において、サリドマイドやプロテアソーム阻害剤

（bortezomib；Velcade㊧）が用いられているが、長期の 使用により腫瘍細胞が薬剤耐性を獲得しうること、平均 生存期間の改善が得られていないことが問題となってき ている11『 ㌔そこで、さらに副作用が少なく、かつ強力 な抗腫瘍効果が期待できる新規の薬物の開発が望まれて

いる。

Tetrandrineによる骨髄腫細胞のアポトーシス誘導機構  Tetrandrineは、ツヅラフジ科シマノハスノバカズ

ラ由来の生薬である漢防己に含まれるアルカロイドであ る。「漢防己」は抗炎症作用、抗アレルギー作用を有す ることが報告されている14・15 。Tetrandrineはマウス白 血病細胞などさまざまな癌細胞に対し増殖抑制効果があ

（A）

（B）

100

ハ75

）

≡50鷺

525

0

ぎ1：

…・・

ξ25

0

0 20 40  60

Time（hr｝

るとの報告がなされている隅2」が、その詳細な分子機 構は明らかではない。組織球性リンパ腫患者由来の腫瘍 細胞株U937細胞において、 tetrandrineは細胞内ROSを 蓄積させることによりアポトーシスを誘導することが報 告されている2 ことに着目し、本研究では多発性骨髄 腫に対する新規分r標的療法の開発を目的として

tetrandrineの有効性、作用機序を検討した、

 ヒト骨髄腫細胞株RPMI8226細胞に対する

tetrandrineの有効性を評価するため、 XTT法を用いて 細胞の生存率の検討を行った、Fig．1に示すように tetrandrineは時間・濃度依存的に骨髄腫細胞の生存率を 低下させた。一方で健常人末梢血単核球の生存率は低下

させなかった。Tetrandrineを添加した骨髄腫細胞の形 態を観察すると、細胞質内に空胞、核の断片化を認め、

さらにDNAがヌクレオソーム単位に断片化されており、

tetrandrineによりアポトーシスが誘導されることを示 唆していた（Fig．2）。アポトーシスはカスパーゼの活性 化を伴うカスパーゼ依存性アポトーシスとカスパーゼの 活性化を伴わないものに分けられ、前者はさらに細胞表 面の細胞死受容体（death receptor）およびその下流シ グナルを活性化するもの（extrinsic pathway）、細胞 内ミトコンドリアを傷害してミトコンドリアの膜電位を 低下させることにより細胞死を誘導するもの（intrinsic pathway）に分けられる。そこでtetrandrineによるア ポトーシス誘導機構を検討したところ、Fig．3に示すよ うにcaspase−3およびcaspase−8の切断による活性化が見 られ、caspase−9の活性化は見られなかったことよりカ スパーゼ依存性アポトーシス（extrinsic pathway）で あることが示された。Fasなどのデスレセプターはリガ ンド（FasLなど）が結合すると三量体を形成し、

FADD、 procaspase−8で構成されるDISC （death一

80    100    （A）

0 2   4   6   8  10  Concentration（μM）

Fig．1Growth inhibition of RPMI8226 myeloma cells．

  （A）RPMI 8226 cells were incubated with either 5pM   （▲）or 25pM（■｝of tetrandrine fbr indicated times．

  （B）RPMI 8226 cells（■）or peripheral blood mononu−

  clear cells仕om healthy volunteer（口）were treated   with the indicated concentrations of terrandrine fbr 72   hours．

  Cell viability was assessed by the colorimetric XTT   assay． Data represent mean plus or minus SD of trip・

  licate cultures．

Control

Tetrandrine 10μM

（B）

1 2 3

Fig．21nduction of apoptosis in myelomacells by tetrandrine，

  Ef丘ct of tetrandrine on apoptosis induction in   RPMI8226 cells．

  （A）Morphologic changes characteristic of apoptosis in   RPMI8226 cells． RPMI8226 cells were incubated with   or without 10μM tetrandrine fbr 24 hours， and then   stained with Giemsa． Original magni丘cation X1000．

  （B）Agarose gel electrophoresis demonstrating DNA   加gmentation in RPMI8226 cells treated with 10pM   tetrandrine fbr 24 hours．

inducing signaling complex）の形成を誘導し、活性 型caspase−8を遊離する。そこで、デスレセプターであ るDR5、 FADD （Fas−associating protein with death domain）、およびcaspase−8により分解されるcaspase−8 抑制因子であるc−FLIP（cellular FLICE like inhibi−

tory protein）の発現を見ると、 tetrandrineはDR5の 発現を誘導し、また初期にFADDの発現も誘導するが caspase−8の活性化とともにFADDも分解されていくこ

とが示された（Fig．4）。また、 Bcl−2、 Baxの発現変化

は見られなかった。

 骨髄腫細胞内においてもtetrandrineがROSを蓄積さ せることをフローサイトメトリー法で確認した（Fig．5）。

抗酸化剤であるN−acetylcystein（NAC）をll『投与する と、細胞内ROSの蓄積は減少をみとめた。そこで、

NACにより細胞内ROSの蓄積を阻害した場合に

tetrandrineによる骨髄腫細胞の生存率の変化を確かめ た。Fig．6に示すように、 tetrandrineによる細胞死誘導 効果はNACの濃度を増加させることにより減退してお

Caspase−8

Caspase・3

0 1 4 ⁸ 24（hr）

Tetrandrine 10μM

Fig．3Activation of caspases in the teranddne−treated ceIls．

    Cleavages of caspases were observed by westem blot−

    ting after treatment of tetrandhne 10 pM食）r 24 h． An−

    tibodies used were anti−Caspase−8（MBL）， Caspase−3     （Cell Signaling）．

100

80

60

ω

⑩一Cコ◎O

0

一

− ^Td

   NAC＋「「◎t

10 FL・1

Fig．5 1nvolvement of ROS in the tetrandrine−inducing     apoptosls．

    8226 cells were incubated without or with N−

    acetylcystein（NAC）fbr 2 hours， then treated with     tetrandrine 10 pM fbr 24 hours． Cells were washed     with PBS twice and treated with H2DCFDA 1μM in     PBS fbr an hour． Intracellular ROS was evaluated by     FACS analysis．

c・FLIP

FADD

＿一一●唱■D●

100

三ミ75芸

≡  50 Ω．里

＞    25

一（〉−NAC

−●−NAC＋Tet

DR5

Bcl・2

Bax

一4■■D一唱■■レー

       014824（hr）

       Tetrandrine 10μM

Fig．4Changes in the apoptosis−related protein expressions     by tertrandrine．

    RPMI8226 cells were treated with 10 μM of     tetrand亘ne fbr up to 24 hours． Cells were lysed and     westem blotting was perfbrmed． Antibodies used were     anti−c−FLIP， Bcl−2（Santa Cmz）， FADD， Bax（MBD，

    DR5（Prosci）．

0

0 5

10 15

      NAC（岬）

Fig．6 1nhibition of tetrandrine−inducing apoptosis by anti−

    oxidant， NAC．

    器2膓c撫1「㌫u蕊7 ㌫ぽtぞ酔瓢階l

    tetrandrine 10 pM五）r 24 hours． Cell viability was as−

    sessed by the colorimetric XTT assay． Data represent     mean plus or minus SD of triplicate cultures．

り、tetrandrineによるアポトーシス誘導はROSを介す ることが示された。ROSは細胞内で単にアポトーシス を誘導するだけではなく、細胞内シグナル伝達分子とし て働くことより、今回の知見に関してもtetrandrineに より蓄積したROSがセカンドメッセンジャーとして DR5などの細胞死受容体、あるいはそのリガンドの発 現を増強することにより働いた可能性もある。さらに、

がん細胞はこれまで腫瘍化した細胞が自己複製能、増殖 能を獲得した単一な細胞集団と考えられていたが、正常 細胞における幹細胞と同様にがん幹細胞の存在が注目さ れている23）。白血病幹細胞は正常造血幹細胞と類似の細 胞表面形質を有する上に、IL−3受容体を有することが特 徴である24）。さらに正常造血幹細胞、前駆細胞に白血病 関連遺伝子を導入した研究より、白血病幹細胞の起源は 前駆細胞の段階で腫瘍化したものであることがわかって きた25）。白血病幹細胞は正常造血幹細胞と同様に骨髄の 骨ニッチの中で細胞周期が細胞停止期（G。期）に入っ

ているため、通常化学療法で用いるDNA合成阻害薬、

代謝拮抗薬などに対する感受性が乏しく、化学療法後に 微小残存病変として残り、いわゆる再発の芽とも言うべ き存在となりうる。このような腫瘍幹細胞を体内から排 除することは治療の成否に係わると考えられる。

Jordanらは白血病幹細胞内ではNF一κBの活性化が見ら れ、ROSへの感受性が増大していることを報告してい る26）。これまで多発性骨髄腫症例において、その形態の 多様性が知られており、形質細胞の形態と予後に関する 研究がなされてきた。骨髄腫細胞においても白血病幹細 胞と同様に腫瘍幹細胞の存在が考えられる。通常の化学 療法では再発率が高く治癒困難であり、今後骨髄腫幹細 胞をターゲットとした治療法の確立は急務である。N早 κBの転写活性を抑制するプロテアソーム阻害薬である

Bortezomibが臨床で用いられるようになってきている が、このような生存シグナルを阻害する薬剤とともに ROS阻害薬を用いることは、腫瘍幹細胞をターゲット とした新規治療法となることが期待される。これまで当 教室では大黄由来のemodinあるいはaloe−emodinが骨髄 腫細胞の生存増殖に重要なJAK2キナーゼ、 NFκBを阻 害することにより骨髄腫細胞のアポトーシスを誘導する ことを見出している27）。このような増殖・生存シグナル の阻害薬とともに、将来tetrandrineを含め、生体侵襲 の少ないROS阻害薬の開発が期待される。

結 論

 本稿では、骨髄腫細胞においてtetrandrineが、細胞 内ROSを蓄積させ、 DR5の発現増加、 Caspase8の活性 化によりアポトーンスを誘導することを紹介した。

ROSの蓄積によるアポトーシス誘導機構はこれまで種々 の機序が報告されており、統一した見解は得られていな い。また、tetrandrineは正常末梢血単核細胞の期に影 響は少なく、比較的安全なことが予想される。腫瘍幹細 胞においては、ROSに対する感受性が高まっているこ

とから、今後腫瘍幹細胞をtargetとした造血器腫瘍に対 する新規治療薬が、このような物質から得られてくるこ

とが期待される。

謝 辞

 本研究に対し、平成19年度星薬科大学大谷記念研究 助成金を賜りましたことに深く御礼申し上げます。また 本研究をご指導いただきました吉田正教授、埼玉医科大 学総合医療センター第二内科木崎昌弘教授、ならびに淀 谷雄亮修士はじめ星薬科大学病態生理学教室の皆様に深

く感謝いたします。

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   tive hematopoietic cell．ハ厄Z 1脆∂，3，730−737（1997）

25）A．Cozzio， E． Passegue， P． M． Ayton， H． Karsunky， M． L Cleary and I． L Weissman：Similar MLL−associated leukemias    arising f士om selfrenewing s七em cells and short−1ived myeloid progenitors． G￠ηes Dεu，17，3029−3035（2003）

26）C．T． Jordan and M． L． Guzman：Mechanisms controlling pathogenesis and survival of leukemic stem cells．0πcqgeηe，

   23，7178−7187 （2004）

27）A．Muto， M． Hori， Y． Sasaki， A． Saitoh，1． Yasuda， T． Maekawa， T． Uchida， K Asakura， T． Nakazato， T． Kaneda， M．

   Kizaki， Y． Ikeda and T． Yoshida：Emodin has a cytotoxic activity against human multiple myeloma as a Janus−

   activated kinase 2 inhibitor．ル舌）Z Cαηcer Tんer，6，987−994（2007）

Anovel therapy fbr hematological malignancies through the intracellular       accumulation of reactive oxygen species（ROS）．

A工dhiro MUTO

Deραr me励げPα鋤ρ妙sjoZ㎎y，仇Cμ鋤（ゾPんαmα㏄μ彦 CαZ 8cjeηces， H・8ん」σπ uer8吻

   In the recent development of chemotherapy fbr hematological malignancies， patients could have a chance to cure，

however， the others relapse or possess a resistant disease． Among the hematological malignancy， patients with multiple myeloma suf艶r f士om a severe bony pain and median overall survival is only 3 years． Our previous study revealed that leukemia patients still have a minimal residual disease（MRD）and that relapse could occur a庇er the expansion of MRD．

Recently， the existence of malignant stem cells has been reported， which might be a part of MRD． To target the malig−

nant stem cells could lead a great benefit fbr treatillg hematological malignancies． It is reported that these cells are more sensitive to the reactive oxygen species（ROS）， therefbre， the ROS modulating agents can be a candidate fbr a novel therapeutic strategy． In this study， we attempted to evaluate tetrandrine， a component of natural herb， as a ROS modu・

lator， and we showed tetrandrine could induce apoptosis in myeloma cells via the activation of caspase 8． Through the more experiments of the malignant stem cells， a novel therapeutics with ROS modulator such as tetrandrine would be expected．