Studies on metabolism of fatty acid in fish-I :β-oxidation of fatty acid by carphepatopancreas mitochondria

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(1)九州大学学術情報リポジトリ Kyushu University Institutional Repository. Studies on metabolism of fatty acid in fish-I : β-oxidation of fatty acid by carp hepatopancreas mitochondria 村田, 寿 九州大学農学部. 豊水, 正道 九州大学農学部. https://doi.org/10.15017/23082 出版情報:九州大學農學部學藝雜誌. 26 (1/4), pp.227-231, 1972-03. Faculty of Agriculture, Kyushu University バージョン: 権利関係:.

(2) 大 農 学 芸 誌(Sci.Bull.Fac.Agr.,KyushuUniv.) 第26巻 第1‑4号227‑231(1972). 魚. 類. の. 脂. 肪. 酸. 代. 謝. に. 関. す. る 研. 究 −I. コ イ肝 膵 臓 ミ トコ ン ド リア に よ る脂 肪 酸 の β−酸 化 村. Studies. 田. on metabolism. 8-oxidation Hisashi. 緒. 寿 ・豊. 正. of fatty. 道. acid. in fish-I. of fatty acid by carp hepatopancreas mitochondria Murata. and. Masamichi. Toyomizu. 実. 言. 1指肪 は魚 類 に お い て も有効 な カ ロ リー源 で あ る.東 ら(1964)は,ニ. 水. ジ マ スに 多量 の グ リセ ライ ドを投 与. した際,そ の 毒性 を認 め ず,カ ロ リー 源 と して効 果 的. 供 試 魚:福. 法. 学 内 の 池 に 蓄 養 し,随. ミ ト コ ン ド リ ア 調 製:Schneider法(1948)に 拠 し てFig.1の を 調 製 後,適. コ イ肝臓,Bilinski,Bilinskiら(1963,. mgofprotein‑N/0.5m1の. 1964)が. マ ス肝臓 お よ び血 合 肉 な どを用 い て,ミ. トコ. 量 の0,25M蔗糖. 液 で 懸 濁 し,0.5〜1.O 酵 素 液 と し て 用 い た.. 脂 肪 酸 酸 化 測 定 の 実 験 条 件:脂 は,容. 準. よ うに分 別遠 心法 で ミ トコ ン ド リア. (1960)が. 積 約20mlの. 肪 酸 酸 化 酵 素反 応. 容 器 でTable1に. 示 す 反応 系. 上 動 物 の肝 臓 ミ トコ ン ド リアに よ る脂 肪 酸 の β‑酸 化. を 用 い て ワ ー ル ブ ル グ検 圧 計 で 行 な い,β‑酸. 酵 素 系 が数 多 く研 究 され てい るの とは対 照 的 に,深. づ く02吸. く. 研 究 され てい な い.著 者 らは,脂 質 を魚 の飼 料 に カ ロ. 収 量 を 測 定 し た.生. す る た め に,容. 加 し た.反. の に鑑 み,魚 類 ミ トコ ン ド リアに お け るβ‑酸 化 酵素. 間 は10分. 間 の 温 度 平 衡 期 間 を 経 過 し た 後 の60分. 系 を脂質 の利 用 とい う観 点 か ら検 討 す る 日的 で,本 研. し た.β‑酸. の佐 質 を調 べ た ので 報 告 す る.. 1. Assay. for. Incubation medium Phosphate buffer (pH 7. 40) MgC12 ATP Cytochromec a-Ketoglutarate in NaC1 Substrate (Octanoate) Mitochondria suspension. incubation. conditions. temp.. 25•Ž. time. 60. min. 応 条 件 と し て,温. after. 10 min. for. equilibration. fatty. μt/mgofprotein‑N/60minと. acid. 度 は25℃,時. 化 に よ る 脂 肪 酸 の 酸 化 速 度 は,02吸. ミ ト コ ン ド リ ア 懸 濁 液 のprotein‑Nは. Table. 除去. 器 のcenterwellに20%KOHを. 0.2m1添. 量. 化 に基. 成 さ れ たCO2を. リー 源 と して添 加 す る こ とが 最 近 広 く行 なわ れ て い る. 究 を始 め,コ イ肝 膵臓 に よ る脂 肪 酸 のβ‑酸 化 酵 素系. 時用. い た.. 化 学 的 に論 議 した報 告 は少 な く,BrownandTapPe1. ン ド リアで の脂 肪 酸酸 化 を研 究 して い る に留 ま り,陸. 方. 岡 市 近 郊 養 魚 場 産 の コ イCyprinuscar‑. pio(体重400〜500g)を. に作 用 してい る こ とを認 め て い る.魚 類 に お け る脂 肪 の有 効 性 につ い て飼 料 学 的 研 究 は数 多 くあ るが,酵 素. 験. oxidation.. 間 と 収. し て 表 示 し た. ミク ロ ケ ー ル.

(3) Fig. 1. Preparation of mitochondria by a differential centrifugation from carp hepatopancreas. ダ ール 法 で 測定 した. 基 質 の 調 製:再 蒸 溜 したoctanoicacidをLehn‑ inger法(1955)でK塩. に調 製 し,基 質 と して 用 い. た.す な わ ち,INKOH10mlをoctanoicacid 1,5mlに. 加 え,octanoicacidを. の ち,pHを7.40に. 完 全 に溶 解 させ た. 調 整 し,水 で100m1に. 稀釈 し. Fig. 2. Enzymatic fatty acid oxidation carp hepatopancreas mitochondria and quirement of cofactor.. て濾 過 を 行 な い,さ らに,こ の濾 液 を必 要 な 基質 濃 度. とTCAサ. に稀 釈 し,こ れ を基 質 と した.. 和 で あ る.し. た が つ て,β‑酸. は,completeの. 系 で のO2吸. 脂 肪酸 の定 量:酵 素反 応 液 に30%TCA溶 mlを. 加 え た の ち,ク. (2:1)で. ロ ロホル ム:メ. 液1.O タ ノー ル 混 液. 脂 質 を抽 出 し,Duncombe(1963)の. 法 を 用 い て銅 塩 と し,420mμ. 方. に お け る吸 光 値 を測 定. して脂 肪 酸 量 を求 め た.. イ ク ル に よ る 内 部 呼 吸 の02吸. 量 で 求 め られ る.こ で,β‑酸. イ肝膵 臓 ミ トコ ン ドリア にお け るβ‑酸 化 酵. 要 求:コ. イ肝膵 臓. ミ トコ ン ド リア にβ‑酸 化 酵 素系 が 存 在 す る こ とを明 らか にす るた め に,基 質 と して用 いた 脂肪 酸 の分 解 に 依 存 す る02吸 の 系で の02吸. 収 量 を 測定 した.基 質 を含 むcomplete 収 鷺 は,β‑酸 Table. Substrate free after reaction Complete after reaction Complete befor reaction. 化 に よ る02吸. 2. Increase oxidation. 収量. 収. 示 す とお り. 収 量 は 約30μ'/mgof. あ っ た, 収β‑を 示 し た こ の ミ トコ ン ド. 間 加 熱 す る と,completeお. 基 質 無 添 加 の い ず れ の 系 に お い て も02吸 ど認 め られ ず,前. 酵 素 的 脂 肪 酸 酸 化 とcofactorの. 収量. 収 量 か ら基 質 無 添 加 の. 化 系 に よ る02吸. リア を,60℃,10分. 素系の存在. 化 系 に よ る02吸. の 結 果 はFig.2に. 酸 化 系 に よ る02吸. 1.コ. 収 量 との. 系 で の 内 部 呼 吸 に よ る そ の 量 を 差 し 引 い たO2吸. protein‑N/60minで. 結 果 お よ び 考 察. by re-. 述 の 約30μZの02吸. よび. 収 は ほ とん 収 量 は明 らか. に 酵 素 作 用 に 依 存 した. completeの. 系 よ りcytc,Mg++お. そ れ ぞ れ 除 去 す る と,02吸 比 較 し て,20,30お お よ びATPがβ‑酸. of 02 uptake and decrease of fatty acid in carp hepatopancreas mitochondria.. よ びATPを. 収 量 はcompleteの. よ び70%低. 化 系 のcofactorと. by fatty. 系 と. 下 し,cytc,Mg'i.+. acid. して 関与.

(4) す る こ とが わか つ た, 酸 化 系 に よる02吸 β‑ 述 の02吸. 収 がβ‑酸. 収 の 増 加 と基 質 の減 少:前 化系による基質脂肪酸 の 消費. を伴 う ことを 明 らか にす るた め に,脂 肪酸 量 を測 定 し た.こ の結 果 はTable2に. 示 す よ うに,基 質 として. 加 え たoctanoate量2.0μmoleの. 他 に,ミ. ド リア に遊 離 脂肪 酸が1.6μmole含. 有 され て いた の. で,反 応 系 の総 脂 肪 酸 量 は3.6μmoleと. トコ ン. な り,他 方,. 60分 間酵 素 反 応 した この系 で の量 が2.0μmoleに. 減. 少 したの で,β‑酸. 化 に よ る26μ1の02吸. 収 量 に対. して1.6μmoleの. 脂 肪 酸 が 消費 され た こ とを示 して. い る. 以 上 の 結果,す な わ ち,酵 素 作 用 に よ る02吸 増加,cytc,Mg++,ATPのcofactorと. 収の. して の関. 与 お よび基 質 で あ る脂 肪 酸 の 減少 か ら,コ イ肝 膵 臓 ミ トコ ン ドリア にβ‑酸 化酵 素 系 が 存 在 す る ことを 認 めた. 2.β‑酸 pHの. 化酵 素 系 の 性 質. 影響:β‑酸. に,酢 酸塩,リ. 化 系 の至 適pHを. 検 討 す るた め. ン酸塩 お よび 炭 酸 塩 の20mM緩. 衝液. を用 い,酵 素 活 性 を測定 した.そ の 結果 をFig.3に 示 す.至 適pHは7.8付. Fig. 3. Relationship between pH and fatty acid oxidation by carp hepatopancreas mitochondria.. 近 で あ つ たが,7.0〜11.5. の広 範 囲 にお よぶ ア ル カ リ 側pH域. でか な り高 い酵. 素 活 性 が認 め られ,こ の範 囲 に 安定 域 が 存 在 した. Lehninger(1955)は. 反 応pHを7.4と. し,ま た,. Bilinskiら(1964)は,ニ. ジ マ ス の 側線下筋肉 の. particulatefractionで. 本 実 験 と同 様 に,微 アル カ リ. 側(pH8.0)に. 至 適pHが. 存 在 し,pH7.0〜11.0. に安 定域 が あつ た と報 告 して い るが,反 応pHを7.4 に定 め て い る.よ つ て本 実 験 のpHも わ ず か に酸 性 側 で あ る7.4と. 至 適pHよ. り. した.. 温 度 の影 響:反 応温 度 を15℃ 〜45℃. とし,酵 素 作. 用 の 温 度依 存 性 に つ い て 検 討 した.そ. の結 果 はFig.. 4に 示 した とお りで,至 適 温 度 は25℃. で あ った.ま. た,本 酵素 系 の温度 依 存 性 に つい て特 異 的 傾 向 が認 め られ,35℃,45℃. で の相 対 活性 は25℃. 比 べ て顕 著 に低 下 し,特 に45℃. で の それ と. で は まつ た く認 め ら. れ ず,本 酵 素 系 が 明 らか に熱 に不 安 定 で あ る こ とが わ か つ た. 3.β‑酸. 化 系 に お よぼ すα‑ケ. sparkerと TCAサ. ト グ ル タル 酸 の. して の役 割. イ クル 中 間物 質 とβ‑酸 化 系 との 関連 を 明. らか にす るた め に,前 者 の中間 物 質 で あ るα‑ケ. トグ. ル タル 酸 がβ‑酸 化 系 お よび 内部 呼吸 に及 ぼ す影 響 に つ い て検 討 した.そ の結 果 をFig.5に. 示 す.α‑ケ. Fig. 4. Relationship between incubation temperature and fatty acid oxidation by carp hepatopancreas mitochondria..

(5) 響 につ い て検 討 し,そ の結 果 をTable3に Pン 酸 は,】O‑2Mで. 内部 呼吸 を100%阻. 化 系 に 対 して も87%の そ の構 造 がTCAサ. 示 す.マ 害 し,β‑酸. 阻害 率 を示 した.マ ロ ン酸 は, イ クル中間 物質 の コハ ク酸 と類. 似 して い る た め に,内 部 呼 吸 に拮 抗 的 に 阻寄 作 用 を示 し,そ の 結 果,β‑酸. 化系 もほ とん ど阻雷 され た もの. と考 え られ る.α‑ジ. ニ トロフ ェ ノー ル は,内 部 呼 吸. もβ‑酸 化系 も と もに 阻害 したが,マ. ロン酸 の場 合 と. は異 な り,内 部 呼 吸 を 僅か に阻 害 す る濃度 で,β‑酸 化系 を明 瞭 に 阻害 した.す な わ ち,マ ロン酸 とα‑ジ ニ トロ フ ェノ ール とは そ の隈 害 作 用 機序 が異 な る と考 え られ る.こ れ らの実 験 結果 はBrownandTapPel (1960)の. 得 た 結果 と同 一 で あ つ た. 要. Fig. 5. Effect of a-ketoglutarate sparker on fatty acid oxidation hepatopancreas mitochondria.. as a by carp. 約. コ イ肝 膵 臓 ミ トコ ン ド リア に よ るβ‑酸 化 酵 素 系 の 存 在 とそ の酵 素 化学 的 性 質について 検 討 し,次 の結果 を 得 た.. トグル タル 酸が 存在 しな い と,02吸. 収 は基 質添 加,. 基 質 無 添加 の いず れ の系 で も抑 制 され,β‑酸 よ る02吸. 収 量 は 約5μ1で. 僅少 で あつ た.他 方,α‑. ケ トグル タル酸 が 存 在 す る と,02吸. 収 は基 質添 加,. 基 質 無 添加 の いず れ の 系 も促 進 され,β‑酸 る02吸. 収 量 は38μlで. は,α‑ケ. 化系 に. 化系 に よ. 著 し く増 大 した.こ. の 結果. トグル タル 酸 が 内部 呼 吸 を強 く促 進 した こ. とに基 因 してお り,β‑酸 化 系 がTCAサ. イ クル と密. 接 な関 連 を保 ち なが らエ ネル ギー生 成 に関 与 して い る. 1。β‑酸 化 系 に よ る02吸. 収 お よび 基 質 で あ る脂. 肪 酸 の減 少,ATP,Mg++,cytcのcofactorと. し. て の 関与 お よ び ミ トコ ン ド リア を60℃,10分 す る と02吸. 間加 熱. 収 が 認 め られ なか つ た ことよ り,コ イ肝. 膵 臓 ミトコ ン ドリア にβ‑酸 化酵 素 系 が 存在 す る こと を確 認 した. 2.octanoateを 適pHは7.8,至 3。TCAサ. 基 質 とした 場 合,本 適 温度 は25℃. 酵素 系 の至. で あ つ た.. イ クル中間 物質 で あ るα‑ケ. トグル タ. こ とを 示 唆す る.ま た,Fig.2でATP,Mg++,cytc. ル酸 のβ‑酸 化 系 に対 す る促 進 機 構 は,ATP,Mg++t. の影 響 を検 討 した 結果 と 比 較 し,α‑ケ. cytcと. の作 用 は 明 らか に異 な り,sparkerの. トグル タル酸 役 割 を果 して い. 4.マ. る こ とが 認 め られ た. 4.β‑酸. 化 系 に お よぼ す 阻 害 剤 の 影響. 役割 を果 し て. ロ ン酸,α‑ジ. ニ トロ フ ェノ ール はβ‑酸. 化. 系 お よ び内 部 呼 吸 を確 か に 阻 害 したが,阻 害 率,阻 害. ニ トロ フ ェノ ー ル を. 剤 濃度 に大 きな差 異 が 認 め られ る こ とよ り,マ ロ ン酸. 化 系 お よ び 内 部 呼 吸 に及 ぼ す これ らの影. とα‑ジ ニ トロ フ ェノ ール で は 阻害 作 用 機 序 力唄 な る. 阻 害 剤 と して マ ロ ン酸,α‑ジ 用 い,β‑酸. は 明 らか に 異 な り,sparkerの. い る こ とを認 め た,. Table. 3. Effect of inhibitor on fatty hepatopancreas mitochondria.. acid. oxidation. by. carp.

(6) こ とが 推 察 され た.. Dumcombe. 文. 献. Bilinski E. 1963 I. Fatty acid. Utilization oxidation. 孝 夫1964養 る研 究.I.ニ. of lipids by fish. by tissue slices from. by fish.. by a particulate muscle. Canad. Brown W. D. and. colorimetric. micro-. II. Fatty. acid. 魚 飼 料 にお け る脂 質 の役 割 に関 す ジ マ スへ の 脂 質 の 多量 投 与 の効 果 と. mitochondria. 1 : 545-548.. oxidation. fraction from lateral line J. Biochem. 42: 345-352. A. L. Tappel 1960 Fatty. acid oxidation Arch. Biochem.. The. 健 康 へ の影 響 日水 誌30:778‑785. Lehninger A. L. 1955 Fatty acid oxidation. dark muscle of rainbow trout. Canad. J. Biochem. Physiol, 41 : 107-112. Bilinski E. and R. E. E. Jonas 1964 Utilization of lipids. W. G. 1963. determination of long chain fatty acids. Biochem. J. 88: 7-10. 東秀雄 ・金 子 徳 五 郎 ・石 井 清 之 助 ・増 田 積 ・杉 橋. "Method. Schneider W. C. of enzymes.. in. Enzymology". 1948 Intracellular III. The oxidation. acid by rat liver 176 : 259-266.. by carp liver mitochondria. Biophys. 85 : 149-168.. in. fractions.. distribution of octanoic J Biol.. Chem.. Summary It fact,. has. been. there. experiments. efficiency. system of. in. by. The. by. a. of. recognized. from. a. the. a. almost of. some. In. feeding. dietary. reports. was. discussing. chemistry.. properties. mitochondria,. in. to. no. enzyme. of. etc.. source. supplement. are. viewpoint and. insulation,. energy. lipid. there. hepatopancreas. as. 0-oxidation,. no. in. system. in. 02 effects. O2uptake. from a. the. was. presumed. a. those. sparker. in. respiration and. different. system. evidences:. a -ketoglutarate,. Endogenous. the. and. However,. occurrence. cushion, as. of. aiming. at. The. 0-oxidation. the. utilization. carp. uptake of. hepatopancreas and. ATP,. Mg++. mitochondria 7.8. and. and. after. the. mitochondria. subsequent. decrease cytochrome. heat. optimum. c. treatment.. was. of. substrate,. as. cofactors. The. temperature. was. optimum 25•Ž,. with. system. was. substrate.. a-dinitrophenol,. to. source,. effective. animals,. with. 0-oxidation. enzymatic as. be. land. dietary. of following on. different. could. in. energy are. fish.. carpio). and. this. Effect. on. (Cyprinus. based. clearly. as. cultivating. lipids. the. O2uptake,. octanoate. well. as. lipids. fish.. octanoate,. of. play. that. concerned. occurrence. confirmed. pH. in. is. carp. lipids. on. as. out of. paper. lipids. reports. fish. carried. present. that. many. on. recently the. known. are. there that. mechanisms.. of. TCA. ATP,. cycle Mg". intermediate, and. on. cytochrome. c,. 0-oxidation and. a--ketoglutarate. was. 0-oxidation. and were. malonate. 0-oxidation some and. systems differences. a-dinitrophenol. were in. their. inhibited inhibition. inhibited. by rates. 0-oxidation. malonate Therefore according. and it.

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