Title
凍結融解処理肝組織感作血清の肝細胞増殖に及ぼす影響に
ついて 1) 凍結融解処理肝組織前感作による切除後肝の再生
作用と四塩化炭素障害肝に対する保護作用の検討 2) 凍結融
解処理肝組織前感作による脾内移植肝細胞のアポトーシス
抑制効果について( 内容の要旨(Summary) )
Author(s)
竹内, 賢
Report No.(Doctoral
Degree)
博士（医学）乙 第1183号
Issue Date
1999-01-20
Type
博士論文
Version
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/15088
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氏名 (本籍) 学位の種類 学位授与番号 学位授与日付 学位授与の要件 学位論文題目 審 査 委 員 竹 内 賢(三重県) 博 士(医学) 乙第 1183 号
平成11年1
月 20 日学位規則第4条第2項該当
凍結融解処理肝組織感作血清の肝細胞増殖に及ぼす影響について1)凍結融解処理肝組織前感作による切除後肝の再生作用と
四塩化炭素障害肝に対する保護作用の検討
2)凍結融解処理肝組織前感作による牌内移埴肝細胞のアポトーシス
抑制効果について (主査)教授 (副査)教授 豊隆 重久 治脇 佐森 教授 廣 瀬 論 文 内 容 の 要 旨 臓器サポートテラビィーとしての肝細胞移植は,脾臓内移植による第2の肝臓として注目されてきた｡しかし, 脾内移植肝細胞のその後の増殖は肝細胞増殖因子(以下 HGF)等を併用しても不良で,何らかの改善策が望 まれてきた｡そこで,申請者らは凍結手術後の良好な上皮再生能と悪性腫瘍凍結時のhighzone toleranCeによ る腫瘍増殖促進現象に着目し,凍結融解処理肝組織(fr脚e-thawedhepatictissue,以下 FTHT)を皮下移植･ 感作することによりある種のナチュラル型HGF様因子が誘導可能で,これが脾内移植肝細胞の増殖を促進させ ることを報告してきた｡今回,FTIITで直接感作或いはFTHT感作後川ヨ日に採取したラット血清(FTHSS)を 用い,30%部分肝切除後の肝再生能をBrdUとPCNAの免疫組織染色所見及び血清HGF値の誘導能から検討し, 四塩化炭素肝障害に対する保護作用の有無を,肝逸脱酵素と血清HGF値の推移から予測し論文1にまとめた｡ また,脾内移植肝細胞の生者･増殖程度を形態学的に観測したうえで,ApopTagとBcl-2,および変異型p53の 免疫組織染色を行い,脾内移植肝細胞の生者･増殖に及ぼすアポトーシスの影響を推察し論文2にまとめた｡ 研究対象と研究方法 実験には7掴齢の雄性Fisher系344ラット(130∼150g)を用い,凍結融解肝組織はエーテル吸入麻酔下に開腹 して摘出した肝臓を1∼2mm角に細切し,液体窒素浸溝法で急速凍結･自然融解(室温)を2回繰り返して作製 した｡FTHSSは2gのFTHTを同系ラット大腿部皮下に移植した14日目の血清を用いて作製し,実験にはこの2皿1 を腹腔内投与して感作した｡30%部分肝切除はHigginsらの手技に準じて行った｡急性肝障害はオリーブ油で希 釈した50%四塩化炭素(CCl.)溶液を腹腔内に注入して作製した｡肝細胞の牌内移植は酵素環流法で分離･採 取した遊離肝細胞をHanks液で5×106個/0.2mlに調整し.FTHT感作後14日目に脾内へ注入移植して行った｡ 肝再生能は部分肝切除後24,弧48時間目に犠牲死させたラットの残肝湿重量とその体重比を測定後,摘出肝 を2分割しBrdUとPCNA(PC10)を免疫組織学的に染色しIabelIngIndex(以下 LI)値から推察した｡CCl一を 用いた肝障害ラットの肝再生能と保護作用は,24,48時間後に犠牲死させた場合の肝湿重量とその体重比を測定 乱 各種肝逸脱酵素(GOT,GPT,LDH,ALP,T-Bil,NH3)の血中変動と摘出肝のPCNA染色所見から推察 した｡脾内移植肝細胞の着床･増殖に及ぼす影響は,移植後1,6,12,24時間目に犠牲死させ,細胞増殖能をPCNAと変異型p53(Pab240)の免疫染色所見から,アポトーシスの関与をApop Tag(Apop Tag)とBcl-2 (抗Bcl-2抗体)の染色程度から推察した｡
研究結果
1)肝再生能は30%肝切除にFTHT感作を併用すると,DNA合成能,細胞増殖能,肝湿重量はいずれも高値で
良好な肝再生能が示唆された｡即ち,BrduLI値は24時間目にFTHT群が32.74±20.16(%),FTHSS群が22.0±6.25
群の66.4±7.9に比べ有意(p<0.01)の高値であった｡ 2)CCl.による肝障害時にFTHT感作を併用すると･対照群ではGOT･GPT,LDH,T-bIl値が著明に増加した が,FTHT群では有意(p<0.05)に抑制され,FTHSS群でも抑制傾向が観察され･FTHTによる直接的な肝保護 作用の存在が示唆された｡ 3)血清HGF値は,30%肝切除後でも3ng/ml前後血清中に誘導されたが,FTHT群では14日目で20ng/ml前 後と有意(p<0.05)の高値を示した0なお,正常肝組織を同様皮下移植した場合には･何れの移植後期間とも5 ng/ml以下の低値のままであった0 4)脾内移植肝細胞PCNALI値は,移植後14日目でFTHT群が約5%と対照群に比べ有意(p<0･05)の高値を示 した｡ 5)牌内移植肝細胞のApogTag陽性細胞数は,移植後1時間日に最も多かったが,その程度はFTHT群が3･9 ±2.6%と対照群の7.5±1.6%に比べ有意(p<0･05)の低値であった0一方,Bcl-2陽性細胞は移植直後には殆ど みられなかったが,FTHT群では移植後7日日頃より観察され始め,その後増加する傾向が示唆された｡ 考察と結語 1978年に水戸らが肝細胞の牌内移植法を発表して以来,世界的な注目を集めたが,移植肝細胞のその後の増殖 が不良で臨床応用の目途が立っていない｡申請者らのFTIiT感作法は肝部分切除群でのHGFの産生と肝再生能を 有意に促進可能で,薬物学的肝障害に対しても保護作用を示すことが判明した0また･本法は臨床応用として肝 拡大切除時にFTHTで感作あるいは残肝の一部を凍結融解することによりナチュラル型の肝細胞増殖様因子が誘 導可能であるのでt術後の肝再生の促進あるいは肝障害(薬物性を含む)に対する保護作用の面で有用となる可 能性があり,応用範囲は極めて広いと推察している○また･牌内移植肝細胞は移植直後から壊死あるいは枯死に ょる細胞死が生じ48時間目までに約90%以上が死滅･消失するが･その後細胞死を免れた肝細胞が生着･増殖す る｡この場合,FTHT感作で誘導された=GF様因子はt移植肝細胞のアポトシスを抑制することにより肝細胞 の生者と増殖を有利な方向に導き,結果的に肝細胞の増殖促進作用と保護作用を誘起する可能性が示唆された0 論文審査結果の要旨 申請者,竹内 賢は肝組織を凍結融解処理して皮下移植することによりある種のナチュラル型肝細胞増殖促進 様因子を誘導し,これが30%部分肝切除あるいは四塩化炭素肝障害ラットに対し肝再生能と保護作用を示す可能 性を明らかにした｡また,増殖機序としてFT日Tは移植肝細胞のアポトーシス誘導を抑制することにより増殖促 進する可能性を明らかにした｡この結果は臓器サポート療法の分野で極めて示唆に富む所見で,本療法の発展に 少なからず寄与するものと認めます｡ [主論文公表誌] 凍結融解処刑干組織感作血清の肝細胞増殖に及ぼす影響について 1)凍結融解処理肝組織前感作による切除後肝の再生作用と四塩化炭素障害肝に対する保護作用の検討 平成10年発行 日本消化器外科学会誌 31(5):1065∼1072 2)凍結融解処理肝組織前感作による牌内移植肝細胞のアポトーシス抑制効果について 平成10年発行 日本外科系連合学会誌 23(5):803∼809
