コイ骨格筋クレアチンキナーゼの単離・精製とその諸性質

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(1)Title. コイ骨格筋クレアチンキナーゼの単離・精製とその諸性質. Author(s). 矢沢, 洋一; 東出, 由香. Citation. 北海道教育大学紀要. 第二部. C, 家庭・養護・体育編, 41(2): 41-51. Issue Date. 1991-03. URL. http://s-ir.sap.hokkyodai.ac.jp/dspace/handle/123456789/6680. Rights. Hokkaido University of Education.

(2) . 北海道教育大学紀要（第２部Ｃ）第４１巻第２号ｉＪｏｕｍａｌｏｆＨｏｋｋａｉｄｏＵｎｉｖｅｒｓｉｉｔｙｏｆＥｄｕｃａｔｌｔｏｎ（Ｓｅｃｏｎ口Ｃ）Ｖｏ ‐４１．２，Ｎｏ. 平成３年３月Ｍａｒｃｈ，１９９１. コイ骨格筋クレアチンキナーゼの単離・. 精製とその諸性質. 矢. 沢. 洋. 一・東. 出. 由. 香. 北海道教育大学旭川分校栄養生理学教室. Ａｂｓｔｒａｃｔ. Ｃｒｅａｔｉｎｅｋｉｎａｓｅｗａｓｐｕｒｆｉｉｌｌｍｕｓｃｌｅｏｆｃａｒｐｓ（ＣコカコｒｉｎｕｓｃａＩＰｉｏＬｉｎ１ｅｄｆｒｏｍｔｈｅｓｋｅｅｔａ・ａｅｕｓ）ｉｈｍｌｆｉｔｆｉｏｎｗａｍｍｏ則［ｎｓｕａｔｅｒａｃｔｏｎａｔｌｃｏｌｕｍｎｌｆｌｉｉｏｎｔｒａｔ，ＤＥＡＥ－ＴｏｙｏＰｅａｒ，ＳｅＰｈａｄｅｘＧ‐２００ｇｅ，ｈｙｄｒｏｘｙｌａｐａｔｉｔｅｃｏｌｕぽｎｎ，ａｌ－ＴｏｙｏｐｅａｒｌｗｎｌｃｏＳｆｌｄＢｕｔｙｌｒｌｆｉｔｌｄｆｎｍ‐ ｏｍｅｏｅｒａｃｔｏｎｓｅｕｔｅｒｏｍｔｈｅＢｕｔｙｌ－ＴｏｙｏｐｅａｒｌｃｏｌｍｎｎＬｎｗｅｒｅｓｈｏｗｎｔｏｂｅｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓＷｉｔｈＳＤＳ‐ＰＡＧＥ，ａｎｄｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｇｈｔｗａｓｅｓｔｉｍａｔｅｄｔｏｂｅ４３Ｋ・ＰｏｌｙａｃｒｙｌａｎＱｗｅｉｄｅｓｌａｂｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｓｉｓｏｆｃａｌｐｃｒｅａｔｉｎｅｋｉｎａｓｅｕｌｉｏｌｏｇｉｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｓｈｏｗｅｄａｓｌｄｅｒｐｈｙｉｎｌｓｃａｅｂａｈｄ. ｇ ‐ ＴｈｅｐＨ－ａｃｔｉｖｉｔｙｃｕｒｖｅｓｈｏｗｅｄａｂｒｏａｄｏｐｔｉｍｕ］ｃｎｂｅｔｗｅｅｎｐＨ８－５ａｎｄ９－ｏｉｎｔｈｅｒｅｖｅｒｓｅ. ｉｏｎｗｈｅｒｅａｓｉｒｅａｃｔｔｓｈｏｗｅｄａｎｏｐｔｉｎ［ｌｕｎｎａｔｐ日７ｉ＼だｉｔｙｏｆ， ‐ｏｉｎｔｈｅｆｏｒｗａｒｄｒｅａｃｔｉｏｎ‐ ＴｈｅａｃｔｉｎｅｋｉｎａｓｅｉｆｃａＩＰｃｒｅａｔｈｄｉｔｏｎｔｅｒｗａｒｒｅａｃｏｎｗａｓａｃｔｉｖａｔｅｄｂｙｄｉｖａｌｌｉｏｎｓｉｎｔｔｉｅｎｔｍｅｔａｅｏｒｄｅｒ. Ｍ［ｎ＞Ｍ【ｇ＞ＣｏキＣａ ‐ Ｃａｒｐｓｋｅｌｌｃｒｅａｔｉｎｅｋｉｎａｓｅｗａｓｃｏｍｐｏｓｅｄｏｆ３８０ａｍｉｎｏａｃｅｔａｉｄｓｒｅｓｅｍｂｌｉｎｇｔｈａｔｏｆｒａｂｂｉｔ. ，. ｉｎｅｋｉｎａｓｅｌ１〔］Ｌｕｓｃｌｅｔｙｐｅｃｒｅａｔ ‐. はじめにクレアチンキナーゼ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ５’‐ｔｒｉｐｈｏｓｈａｔｅ－ｃｒｅａｔｉｎｅｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅＥＣ２７３２）， ‐‐‐. は，以下の可逆反応を触媒する．ＭｇＡＤＰ十クレアチンリン酸（ＣＰ）十Ｈ＋ごＡＴＰ十クレアチン（Ｃｒ）. ２十存在下に生理的条件下（すなわち，クレアチンキナーゼ（ＣＫ）は，Ｍｇ）あるいは酸性ＰＨ７ ‐０側ｐＨで，上記反応がＡＴＰ合成方向へと進む正反応（ｆｉｏｎ）を触媒する一方アｏｒｗａｒｄｒｅａｃｔ．. ，. ルカリ側ｐＨのもとでは，ＡＴＰとクレアチン（Ｃｒ）からＡＤＰとクレアチンリン酸（ＣＰ）合成の方向へと進む逆反応（ｉ）が主となるといわれている．この酵素は脊椎動物の各ｔｒｅｖｅｒｓｅｒｅａｃｏｎ，種組織や器官に広く分布しており，しかも多量に存在しているそして筋収縮系や生体内の物質輸．送系と共役して，ＡＴＰ生産という生体にとって重要な役割を担っていると考えられている特に，．筋肉細胞中においては，多種類にわたる水溶性蛋白質中にあってＣＫは１０～２０％含まれ大きな，，｝割合を占めている１．筋肉中には，１０～２０ｍＭという大量のクレアチンリン酸（ＣＰ）が含まれているＡＴＰが２～３．４１（）.

(3) . 一・出由香矢沢洋一・東. ９０. ０倍近く存在していることになる．生体中のＡＴＰｍＭ存在しているのと比較して，その数倍から１だけなら，急激な運動はほんの２～３秒しか出来ないが，この大量のＣＰを利用してクレアチンキ０秒～２０秒間，収縮運動を行う事ナーゼ（ＣＫ）がＡＴＰ合成反応を触媒することにより，さらに１が出来る様になるとされている．他のＡＴＰ生産系である解糖系やＴＣＡ回路・酸化的リン酸化と共に生物のエネルギー源であるＡＴＰ供給をつかさどる．特にクレアチンキナーゼ（ＣＫ）系は，解糖系とならんで，急激な無気的運動の際のＡＴＰ供給を行っているが，生理的条件下で両系の関与する割合などについては全くわかっていないといえる現状である．）や化学修飾による酵素また，筋肉中に大量に含まれている酵素である事から，反応速度論的解析２｝など数多く｝あるいはＥＳＲ法を用いた酵素－基質複合体の立体構造に関する研究４活性点の研究３，－ＤＮＡ法）により，Ｃの報告がなされている．一方，近年急激な発展を示してきた遺伝子組換え法（５）それによると９８４年に決定された列が１家兎骨格筋クレアチンキナーゼ（ＣＫ）のアミノ酸配，．３８０個のアミノ酸から成る分子量４３Ｋのサブユニット２個で構成されていた．それ以後，ヒト骨格筋から電気ウナギ骨格筋に至る１０種類余りの脊椎動物のクレアチンキナーゼ（ＣＫ）のアミノ酸配列が報告されており，その配列に相違はあるものの，いずれも３８０個のアミノ酸から成るサブユニッ｝ト２個から成っていることが明らかにされている６．. この様に，遺伝子組換え法の発展により，クレアチンキナーゼ（ＣＫ）のアミノ酸配列について｝その酵素活性に関する研究は，最近ほとんどなされていない．特は多くの報告がなされているが１，に，魚類のそれに関する報告は非常に少く，先に述べた電気ウナギ骨格筋クレアチンキナーゼ（Ｃ｝程度しかなされていないコイやニシンでは，生理的条件下でＫ）についてのアミノ酸配列の報告７．９｝）・の骨格筋抽出物の電気泳動で１～２本のバンドから成っていると報告されているにすぎない８．今回，我々は硬骨魚類のコイ骨格筋よりクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の単離・精製を試みると同. 時にその生化学的，物理化学的性質を検討し，他の脊椎動物骨格筋（ＣＫ）との比較を行い，今迄ほとんど明らかとなっていない魚類骨格筋のクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の性質を解明する事を目的とした．. 実験材料と実験方法. 材料ｉｎｕｓｃａｒｐｉｏＬｉｍ・）は，旭川市内養鯉場より購入した新鮮なものを用いた．コイ（ＣＩ叩ｒａｅｕｓ. タンパク質の調製０）を修正した以下に述べる方法を用いて，コイ骨格筋よりｎ瞳等の方法１クレアチンキナーゼは，Ｕ調製を試みた．. 硫安分画タンパク質の分画のために，硫安分画法を用いた．必要な硫安濃度にするために，固形硫安Ｗｇを以下の式に従って求めた．）０５１５× ＶＸ（Ｓ２ーＳ．１） …”．…（Ｗ＝－１‐０－０‐２９２×Ｓ２. （１）式は，００Ｃにおける場合のものであり，Ｖはタンパク質溶液の体積（ｍの，Ｓ，は，体積Ｖｍｇ４２（）.

(4) . . コイ骨格筋クレアチンキナーゼの単離・精製とその諸性質. ９１. のタンパク質溶液の硫安飽和度，Ｓ２は，これから必要とする硫安飽和度である．クレアチン定量のための標準曲線正反応で生じたクレアチンの定量のために，アルカリ中でクレアチンとのα－ナフトールを反応１｝を改良したＲｏさせる事によって赤色を生じさせ，その比色定量を行う坂口反応１ｓｅｎｂｅｒｇ等の方１２）法をさらに改善した方法を用いた．図１にその方法を用いて作成した標準曲線を示したこの結．果は，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等の方法で作った標準曲線とくらべて，２倍近い感度の上昇を示した．２Ｏ．. ／. 十／. Ｅ. ｑｌ０．. ／／. ５０. Ｏ. ＱＩ. Ｑ２. Ｑ３. ０Ａ. Ｑも. ｃｒｅｑｔｉｎｅＦｉｇ‐１．Ｃｏｎｃｅｎｔｉｏｎｏｆｃｒｅａｔｒａｔｉｎｅｖｓｃｏｌｏｒｉｎｔｅｎｓｉｔｙ．. 正反応の活性測定ｏＣで適当条件下に正反応を行い一定時間反応させた後２５ＮＮａＯＨと００５ＭＥＤＴＡで２５，， ‐ ， ‐ 反応を停止させた．それに発色剤（５％α－ナフトール及び０‐０２５％ジアセチル溶液）を加えて，室温で３０分放置後，５３５ｒＩＣｒｌｍで比色を行い，図１の標準曲線より，正反応の比活性（／ｍｇ・ｍｉ）ｎ〆ｍｏを算定した．. 逆反応の活性測定ｏＣの湯浴中逆反応は，適当条件下，２庁Ｃで一定時間反応させた後，０‐ＩＮＴＣＡで反応停止後ｌｏｏ，で１分間インキュベートして，反応中に生じたクレアチンリン酸をクレアチンとリン酸に加水分解した．生じたリン酸に，硫酸とモリブデン酸アンモニウムを加えて発色後６６０【ｌｍで比色定量を行，い，別に作成したリン酸の標準曲線より，逆反応の比活性（ｌｐｉ／ｍｇ・ｍｉｎ）を求めた．リン酸〆ｍｏ３）を改良して用いたの定量は，Ｆｉｓｋｅ－ＳｕｂｂａＲｏｗ法１．. 電気泳動４ＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）はＰｏｒｚｉｏ＆Ｐｅａｒｓｏｎの方法１）を改良し，４３（）.

(5) . ９２. 矢沢. 洋一・東出由香. て，１０．０％ポリアクリルアミドゲルを用いて行った．生理的条件下でのポリアクリルアミド電気泳. 動（ｎａｔｉｖｅ－ＰＡＧＥ）は，. ５｝を一部改良してスラブゲル電気泳動法で行っｉｎ＆Ｄａｖｉｏｍｓｔｅｓの方法１，. ｌた．いずれも１５ｍＡ／ｓａｂで約１時間泳動させ，４５％エタノールで約５分間固定した．続いて，２５０で１５～２０分間染色後，５％エタノール‐７．５％酢酸を含む脱染色液で蛋白質以２５％ＣＢＢＲ－０．１外の部分を脱染色した．. ６）に従って日立アミノ酸分析器（モデルＫＬＡ－３型）ｉｎの方法１アミノ酸分析は，Ｍｏｏｒｅ＆Ｓｔｅ，を用いて行った．ＡＴＰ，ＡＤＰは，オリエンタル酵母Ｋ‐Ｋ‐ と協和醗酵Ｋ‐Ｋ．の特級試薬を用い，クレアチンは. 半井化学Ｋ‐Ｋ‐ の特級試薬を用いた．硫安は，半井化学Ｋ‐Ｋ－の生化学用特製試薬を用い，２冊メルカプトエタノールも同じ半井製品の蛋白質研究用特製試薬を購入した．ＤＥ！Ｕートヨパールとｌ－トヨパールは東洋曹達Ｋ‐Ｋ‐ から購入したものを用いた．デキストランゲルはファルマシＢｕｔｙア社のＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００を用いた．その他の試薬は，すべて市販の特級品を用いた．. 実験結果および考察クレアチンキナーゼの精製以下に述べるクレアチンキナーゼ調製の試みは，すべて４℃の低温室で行った．まず生きている）を加え，ミキサーを用い０５０ｇ）に，その約５倍容のｌｍＭＥＤＴＡ（新鮮なコイの骨格筋（ＰＨ７‐ ｏｒｐｍで１０分間遠心にかけ，上清をメスシて１５秒間隔で３回破砕ホモゲナイズして抽出後，１０，０ｏ）１）を加えた後，（ｉ ‐ＨＣ１（ｓリンダーに移して，その体積を求めた．その１月０容の０‐５ＭＴｒＰＨ８ ‐００．４０ＳＡＳ）濃度になるように，固形硫安を少しずつ加えていき，３０式に従って，０．４０飽和硫安（０分間遠心にかけた．上清をメスシリンダー分間マグネチックスターラーで撹梓後，１２，００ｏｒｐｍで１０ＳＡＳになるように固形硫安を加えて１５１）式に従って，０‐７で集めて，その体積を求めた後，再び（２，０ｏｏｒｐｍで１０分間遠心した．沈殿を少量の水に溶かした分間マグネチックスターラーで撹梓後，１Ｈ８１）溶液に透析した後，１ｏｍＭＴｒｉ（０ｓ－ＨＣＰ ‐ ．同じ透析外液を用いて約８時間おきに３回取り替えた後，透析チューブから試料をとり出し，１６，０ｏｏｒｐｍで２０分遠心にかけた上清をとって，０‐４０～０．７０ＳＡＳ分画成分とした．クレアチンキナーゼ活性は大部分がこの分画に存在していた．ｉ一方，あらかじめ，１ｏｍＭＴｒｓ‐ＨＣ１（ＰＨ８‐０）溶液で平衡化しておいた，ＤＥＡＥ－トヨパール. ）ｉ－ＨＣ１（ｓカラムに，この０‐４０－０‐７０ＳＡＳ分画成分をつめた．つめ終った後，１ｏｍＭＴｒＰＨ８‐０ｏｏｍβ を用いて，ＫＣＩ濃度を直線勾配で変化させて，蛋ｌｏｏｍゑと同緩衝液を含む０ ‐３ＭＫＣＩ溶液ｌ白質の溶出分離を試みた‐ その溶出曲線が図２に示されている．溶出した各画分の蛋白質濃度はＬｏｗｒｙ法により求めた．各分画について正反応を用いて，クレアチンキナーゼ活性を測定した所，Ｉで溶出してくる２番目のピークにその大部分の活性が存在しており，その比活性は，ｏ‐１４ＭＫＣ１５５～１６０〆ｍｏＩＣｒ／ｍｇ・ｍｉｎを示した．この部分について，ＳＤＳ‐ＰＡＧＥで検討した所，図には示さ. ）１２の成分を集めて，先の（なかったが，まだ多くの蛋白質成分を含んでいたので，試験管番号２４～３水を加えて沈殿に少量の式に従い，ｏ‐９ＯＳＡＳとなるように固形硫安を加えた後，遠心にかけた．ｉｓ‐ＨＣ１（ＰＨ７‐６）に透析した．懸濁液として後，３０ｍＭＮａＣ１，１ｏｍＭＴｒこの透析物をＳｅｐｈａｄｅｘＧー２ｏｏカラムにかけて溶出・分離した結果を図３に示した．試験管番号ＩＣｒ／ｍｇ・ナーゼ活性の大部分が存在しており２６～３６にクレアチンキ，その比活性は，２１０～２４０〆ｍｏｍｉｎとＤＥそＵートヨパールカラムで溶出した分画の約１ ‐５倍に上昇していた‐ 活性の高い試験管番４４（）.

(6) . . コイ骨格筋クレアチンキナーゼの単離・精製とその諸性質. × ′ノ. ＥＱＥＵａＥユ）〉＝〉；Ｕｏ￥Ｕ（仁－０００. ヘｊ十ムリにｏｏに帯さ＆ＯＥ＼ゆＥ） ‐. 」ｔｕｂｅＮｏ. Ｆｉｉｇ．２．ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａＰｈｙｏｆｏ‐４０一０‐７０ＳＡＳＰｒｅｃｉＰｉｌｅｔａｌｍｕｓｃｔａｔｅｏｆｃａｒＰｓｋｅｌｅｉｅ×ｔｒａｃｔ４４２ｍｇｏｆｅ×ｔｉｎｅｒａｃｔｗａｓａＰＰ１ｅｄｔｏａ２‐２×１５‐３ｃｎｎｃｏｌｍｍｍ．Ｃｒｅａｔｋｉｎａｓｅ（ＣＫ）ｗａｓｅｌｕｔｅｄｂｙａｌｉｎｅａｒ惇ｒａｄｉｅｎｔｆｏｒｍｅｄｆｏｍＭＴｒｒｏｍｌｉｓ一ＨＣ１ｆｅｒ）ａｎｄｏ‐３ＭＫＣ１ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ廿ｌｅｓａｍｅｂｕｆ（ｉｏｎｒａｔＰＨ８‐０ ‐ ＴｈｅＫＣ１ｃｏｎｃｅｎｔｉｉｎｅｉｏｎｉｓｓｈｏｗｎａｓａｂｒｏｋｅｎｌｉｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｃｔｓ５ “”． ○，Ｐｒｏｔｅｒａ‐ ‐ Ｅａｃｈｆｉｏｎ； ×，ｃｒｅａｔｉｎｅｋｉｎａｓｅａｃｔｔｉｖｉｔｈｅｆｏｒｗａｒｄｒｅａｃｔｉｏｎ）．Ｔｈｅａｓｓａｙｗａｔｙ（ｓｉｅｄｏｕｔｕｎｄｅｒｔｈｅｆｏｌｌｏＷｉｎｇｃｏｎｄｉｉｏｎｓ：５ｍＤ４ＰｈｏｓＰｈｏｃｒｅａｔｉｎｅｔｃａｎｒ１ｒ述収，１. ＡＤＰ，ｌｍＭＭｇＣ１０）ａｔ２５ ℃‐ ＰＨ７２，ａｎｄｌｏｍＭＭＯＰＳｂＬ最ｅｒ（，. ０に‐. ‐ ・３表す－０. ｔｕｂｅＮｏ. ４０. ５０. 晒ｇ‐３．ＳｅｐｈａｄｅｘＧー２００ｃｈｒｏｍａｔｏ鱒ａｐｈｙｏｆｃａゆｃｒｅａｔｉｎｅｋｉｎａｓｅ（ＣＫ）．Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ（ｔｕｂｅｎｕ４ｔｏ３２）ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｈｅｅｎｚｙｍｅｆｒｏｍ位ｅＤＥＡＥ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌｕ □ ｎｂｅｒ２ｃｏｌｗｎｏｎｗｅｒｅｐｏｏｌｅｄＬｆａｔｅｔ口ｒａｅｄａｎｕｎｏｎｉｍｍｓｕｌ，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄｗｉ仇９０％ｓａｔ，ａｎｄｄｉａｌｙｚｅｄａｇａｉｎｓｔｌｏ口立川Ｔｒｉ）ｃｏｎｔａｉｍｎｇ３０ｍＭＮａＣ１Ｔｈｅｓ一日Ｃ１（ＰＨ７－６. ‐ １３６ｍｇ）ｗａｓａｐｐｌｉｓａｍｐｌｅ（３２Ｘ‐ ｅｄｔｏａＳｅｐｈａｄｅｘＧ‐２００ｃｏｌｍｍ（８６ｃｍ）ａｌ．ｄｌｕｔｅｄｗｉ魚ｔｈｅｓｅｉｏｎｉａｍｅｓｏｌｕｔｉｏｎａｓｉｎｔｈｅｄｉａｌｙｓｉｓ‐ Ｅａｃｈｆｒａｃｔ０ｓｌｏフ卿Ｚ．，ｉｎｅｋｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉａｂｓｏｒｂａｎｃｅａｔ２８０ｍｍ； ×，ｃｒｅａｔｔｙ（故ｅｆｏｒｗａｒｄｒｅａｃｔｉｏｎ）‐ ＴｈｅａｓｓａｙｃｏｎｄｉｉｏｎｗａｔｓａｓｄｅｓｃｒｉｂｅｄｉｎＦｉｇ‐２‐. ４５（）. ９３.

(7) . 矢沢洋一・東出由香. ９４. ）に透析した後，同溶液で，平衡化しておいたヒ号２９～３１を集めて，５ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ７ ‐５）６００ｍ２と３００ｍＭリン酸緩衝液（ドロキシルアパタイトカラムにつめた後，同緩衝溶液６ＰＨ７‐５が図４に示されてたその溶出曲線かけて溶出・分離を試みｍｇの間で，リン酸の直線濃度勾配に．／０～４０ｍＭリン酸濃度で溶出してくる２つのピークは，３００～３４０〆ｍｏＩＣｒいる．それによると，１ＣＫｈたＳｄＧ－示し２００カラムで溶出してきた分画のｅｐａｅｘｍｇ・ｍｉｎの比活性を持っており，図３に比活性よりも約１４倍高い値を示した．０‐ＩＭのリン酸で溶出してくる３番目のピークはＣＫ活性がみられなかった．. ＥＯＥＵるＥコ）〉”；一で一. 互のＥｃｏのＮｑー… （Ｘ）ｌｏｔｕｂｅＮｏ. ｉｎｅｋｉｆｃａｒｐｃｒｅａｔｉＦｉｇ‐４ｔｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｏｎａｓｅ（ＣＫ），２７．６ｍｇｏｆ ‐ Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｐａｔｉｏｎｓ（ｆｆｉｒｏｍｔｈｅｓｅｔｏｎｎｕｍｎｂｅｒ２８ｔｏ３４）ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｈｅｅｎｚｙｍｅｆｒａｃｔｒａｃｌｃｏｌｗｍｍｗａｓｐｏｏｌｅｄ，ｄｉａｌｙｚｅｄａｇａｉｎｓｔ５ｍＤｄｐｈｏｓｐｈａｔｅｐｈａｄｅｘＧ－２００ｇｅｉｉｅｄｔｏｈｙｄｒｏｘｙｌａｐａｔｔｅｃｏｌｍｍ（１．７×１‐３ｃｍ），ａｎｄｅｌｕｔｅｄｆ）ｂｕｆｒ（ＰＨ７．５ｅ，ａｐｐｌｆｄｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｉｎｅａｒｇｒａｄｉｅｎｔｆｏｒｂｙａｌｅｒａｎｄ３００ｍＤ４ｐｈｏｓ‐ ｌｎｅｄｆｒｏｍ５ｍＤｆｅｒ（）ｐ日７‐５ｐｈａｔｅｂｕｆ．０，ａｂｓｏｒｂａｎｃｅａｔ２８０ｎｍ；Ｘ，．Ｅａｃｈｆｒａｃｔｉｏｎｉｓ４粥‘ ｉｅｄｏｕｔｉｏｎ）‐ Ｔｈｅａｓｓａｙｗａｓｃａｒｒｉｖｉｔｙ（ｔｈｅｆｏｒｗａｒｄｒｅａｃｔｉｎｅｋｉｎａｓｅａｃｔｃｒｅａｔｉｂｅｄｉｎＦｉｏｎｓｄｅｓｃｒｉｈｅｃｏｎｄｉｔｕｎｄｅｒｔｇ－２‐. ｉｓ‐ＨＣ１ＣＫ活性が示されていたピーク試験管番号９～１３を集めて，４０％ＳＡＳ，１ｏｍＭＴｒｌ－トヨパールカラムにつめ）溶液に透析後，同溶液であらかじめ平衡化しておいた．Ｂｕｔ（６ｙＰＨ７．）６０ｍｇの間でた．同溶液の６０ｍＢとｉｏｍＭＴｒｉｓ（ＰＨ７‐６，硫安濃度を直線勾配に変化させて得た溶出曲線を図５に示した．２０％ＳＡＳでシングルピークが溶出してきたが，そのＣＫ比活性は，. ３３０～３５０“ｍｏＩＣｒ／ｍｇｍｉｎを示した．. 今まで述べてきた，精製操作の各段階における蛋白質の組成をＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて検討した結果を図６‐ａに示した．それによると，０‐４０～０‐７０ＳＡＳ分画では多数のバンドが観察され，多数のｌ蛋白質が含まれていた（ａｎｅｌ）．ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００カラムによるゲル癒過で溶出してきた分画では，クレアチンキナーゼとそれより分子量の少し小さい成分の２種類のメインバンドと数種類のマクレｌイナーな成分となっていた（ａｎｅ２）．ヒドロキシルアパタイトカラムで溶出してきた分画は，ｌａｎｅアチンキナーゼのみが主成分を示したが，その他に数種類のマイナーなバンドを含んでいた（ゼｌ－トヨパールカラムで溶出した成分は，完全に精製されたクレアチンキナーのシ３，４）ｔｙ．Ｂｕ６４（）.

(8) . コイ骨格筋クレアチンキナーゼの単離・精製とその諸性質. ２０ｔｕｂｅＮｏＦｉｇ‐５‐ Ｂｕｔｙｌ－Ｔｏｙ。ｐｅａｒＩＣｈｒ。ｍａｔ。ｇｒａｐｈｙｏｆｃａｒｐＣｒｅａｔｉｎｅｋｉｎａｓｅ（ＣＫ）‐ Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ（ｔｕｂｅｎｕｍｂｅｒ９ｔｏ１３）ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｈｅｅ・臣ｚｙ１ｍｅｆｉｔｅｒｏｍ廿ｌｅｈｙｄｒｏｘｙｌａＰａｔｌＣｏｕｍｎＷｅｒｅｐｏｏｌｅｄａｎｄｄｉａｌｙｚｅｄａｇａｉｎｓｔ１ｏｍＭＴｒｉｓ一日Ｃ１（ＰＨ７‐６）Ｃｏｎｔａｉｎ‐ ｉｎｇ４０％ｓａｔｕｒａｔｅｄａｍ・ｎｏｎｉｕｍｓｕｌｆａｔｅｉａｌｙｓａｔｅｓ（ｅｄ６．ｌｍｇ）ｗｅｖｅ．Ｔｈｅｓａｍｐｌｉｌｃｏｌｕｍｍ（１－２×１‐５ｃｍ）ａｎｄｅｌｕｔｅｄｂｙａｌａｐｐｌｅｄｔｏｔｈｅＢｕｔｙｌ－Ｔｏｙ。ｐｅａｒｉｎｅａｒｉｅｎｔｆｏｒｍｅｄｆｒｏｍｌｏｍＭＴｒｇｒａｄｉｓ－ＨＣ１（ＰＨ６）Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ４０％ｓａｔｕｒａｔｅｄｉｉａｍｍｏｎｉｏｎ＝４創Ｚｏ）１ｆｒａｃｔｕｍｓｕｌｆａｔｅａｎｄ１ｏｍＭＴｒｓ一日Ｃ１（ＰＨ７‐６，ｉｎｅｋｉｎａｓｅａ８０山中； ×，Ｃｒｅａｔａｂｓｏｒｂａｎｃｅａｔ２ｔ電ｔｌｉｏｎ）．ｃｅｆｏｒｗａｒｄｒｅａｃｔｙ（せＴｈｅａｓｓａｙＷａｉｄｔｄｈｉｏｎｓｄｅｓｃｒｔｉｂｅｄｉｎＦｉｇ－２ｓｃａｎｒｅｏｕｕｎｅｒｔｅｃｏｎｄｉ．. Ｇ）. Ｆｉｇ‐６ｉｏｎｓｏｂｔａｉｎｅｄｄｕｒｔｅｒｎｓｏｆｆｉｎｇｐｕｒｉｒａｃｔｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃａｒｐ ‐ａ．ＳＤＳ－ＰＡＧＥｐａｔｉｎｅｋｉｎａｓｅｉｃｒｅａｔｉｅｄｏｕｔｂｙｌｏ％ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｅｃｔｒｏｐｈ。ｒｅｓｓｗａｓｃａｒｒ ‐ Ｅ１ｇｅＩＣｏｎｔａｉｎｉｎｇｏ‐１％ＳＤＳ‐ ＬａｎｅｌｌｅｔａｌｒａｃｔｆｒｏｍＣａｒｐｓｋｅ，ｌｍＭＥＤＴＡｅｘｔｌｉｎｅｋｉｎａｓｅ（ｍｕｓｃｅｔｕｂｅｎｕｍｎｂｅｒ３０）ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄｂｙｓｅ ‐ Ｌａｎｅ２ ‐ ，ｃｒｅａｔ００ｇｅｌｃｏｌｍｍｍｃｌ立。ｍａｔ。虹ａｐｈｙ．Ｌａｎｅ３ｃｒｅａｔｐｈａｄｅｘＧ－２ｉｎｅｋｉｎａｓｅ（ｔｕｂｅ，ｉｏｎａｔｅｄｂｙｈｙｄｒｏｘｙ．ａｐａｔｎｕｍｂｅｒ７）ｆｒａｃｔｉｔｅｃｏｌｗｍｍｃｍｏｍａｔｏ騨ａｐｈｙ ‐ Ｌａｎｅ４Ｃｒｅａｔｉｎｅｋｉｎａｓｅ（ｔｕｂｅｎｕｍｂｅｒｌｏ）ｆｉｏｎａｔｅｄｂｙｈｙｄｒｏｘｙｌａｐａｔｒａｃｔｉｔｅ，Ｃｏｌｕｎｎｎｃｈｒｏｍａｔｏｇａｐｈｙｉｎｅｋｉｎａｓｅ（ｔｕｂｅｎｕｍｎｂｅｒ１７）ｐｕｒ ‐ ．Ｌａｎｅ５，ｃｒｅａｔｆｉｉＩＣｏｌ毘ｍｍＣｈｒ。ｍａｔ。ｇｒａｐｈｙＬａｎｅ６ＣｒｅａｔｅｄｂｙＢｕｔｙｌ－Ｔｏｙ。ｐｅａｒｉｎｅ ‐ ，ｋｉｎａｓｅ（ｔｕｂｅｎｕｍｎｂｅｒ１８）ｐｕｒｉｆｉｌｃｏｌｕｅｄｂｙＢｕｌｙｌ－Ｔｏｙ。ｐｅａｒｌｌｐｍｃｈｒ。ｍａｔｏ‐ １ｇごａｐｈｙ．. ４７（）. ９５.

(9) . 矢沢洋一・東出由香. ９６. ｌａｎｅ５，６）ングルバンドのみを示した（．すなわち，以上の諸操作段階をへて，コイ骨格筋クレア. チンキナーゼは，精製を完了したと結論された．コイクレアチンキナーゼの諸性質Ｓｃｏｐｅｓ等は，コイ骨格筋抽出物の電気泳動を行い，２つのクレアチンキナーゼ活性を持つバンド｝コイの他にもニシを得た事から，２種類のアイソフォーム型が存在するのではないかと推定した８．ｉｔンの骨格筋抽出物のｎａｖｅ電気泳動により，ニシン２５０個体について検討した所，２４９個体から，）クレアチンキナーゼ活性を持つ２種類のバンドが検出されたという報告が出されている９．ｉｔｖｅな状件下での電気泳動を行った所，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ我々は，精製コイクレアチンキナーゼのｎａｓ等の場合と同様に，１本のバンドしか検出する事が出来なかった（図６．ｂ）．我々の結果とＳｃｏｐｅ｝のちがいを明かにするために，現在，コイ骨格筋クレアチンキナーゼを抗原として，家兎抗の結果８血清を調製中であり，間もなくさらにはっきりとして結論が出る予定である．. ｂ｝至. ２. ｉｎｅｋｉｎａｓｅｉｌｅｌｔｅｎｌｓｏｆｃａｒｐｃｒｅａｔｉｖｅｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅＦ～ｇ‐６‐ｂ‐ Ｎａｔｓｐａｔｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓ ‐ ｉｌｃｏｌｕｍｎｃｈｒｏｒｏｐｈｏｌｅｓｓｆｉｉｌｎａｔｏｇＴａｐｈｙｅｄｂｙＢｕｔｙｌ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｐｕｒ．Ｅ１ｅｃｔ “ｍａｔｅｒｌｄｉｄｉｂｄｉｄｔｌｉｈｄｉｔｓａｎｉｄｔｎｔｃｒｅａｅｓｍｅｏｒｎｏｅａｃｃｏｃａｒｒｅｏｕｗａｓｇｒーｌｅｔｈｏｄｓ“ １‐ Ｌａｎｅｌ．Ｌａｎｅ２，ｔｕｂｅ８，ｔｕｂｅ１７. このコイクレアチンキナーゼのサブユニット分子量を算定するために，分子量既知の標準蛋白質を用いて，ＳＤＳ‐ＰＡＧＥを行い，その電気泳動移動度と分子量の対数との間に直線関係を作成した３Ｋとなり，今ゼの分子量を算定した所，４（図７）．この標準曲線を用いて，コイクレアチンキナー迄に知られている脊椎動物のクレアチンキナーゼのサブユニット分子量と良い一致を示した．図３のＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００を用いたゲル漉過法の場合も，標準蛋白質の分子量の対数と，それらの蛋白質）との間に以下の関係式を作成して，）とブルーデキストランの溶出容積（Ｖｏの溶出位置の容積（Ｖｅクレアチンキナーゼの分子量を求める事が出来た．ｌｏｇ分子量＝６‐８０５－１‐０５８×Ｖｅ／Ｖｏ. この関係式より求められた蛋白質の分子量は，生理的条件下でのものであり，コイクレアチンキナーゼの場合は約８５Ｋと算定された．以上により，コイ骨格筋クレアチンキナーゼは，今迄に報告３Ｋのサブユニット２個から構成されていると結論された．されている脊椎動物のものと同様，４４８（）.

(10) . . コイ骨格筋クレアチンキナーゼの単離・精製とその諸性質０７ ‐. ７０. ６＼０～一＼ｇ０５．. ‘ ‐ ｝０－３ｏ．. ２０．. ４３. ４４．. ５４４６４８７４．・．ーｏ９ＭＷ. ‘ ９. ０曳. 爾ｉｇ‐７‐ Ｒｅｌａｔｉｖｅｍｏｉｌｉぢｖｓ仕ｔｌｉＩ灯）ｕｓｉｎｇ８％ＳＤＳ－ｅｌｏｇｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｇｈｔ（ＮＩＰＡＧＥ‐ Ｓｔａｎｄａｒｄｐｒｏｔｅｉｎｓ：１２ｉｈｉｎｏｇｅ；ｂｏｖｎｅｃｏｑ「ｙｐｓｌｍｅｌＩＡ，ｙｌヒロ，ｅｇｇｌｙｓｏｚｙ，３；ｃａｍｂａｎ・ｉｎ，４；ｓｃａｌｌｏｐａｒｇｎｉｎｅｋｉｎａｓｅ５；ｒａｂｂｉｉｎ；６ｌｍｙｓｓｔｒｏＰｏｔａｃｔ，，ｅｇｇａｌｂｕ］ｍｉｎ；７亘ｎａｌｂｕｔｊｍｉｎ．，Ｃａｒｐｓｅｒ. Ｔａｂｌｉｏｎｏｆｃｒｅａｔｉｄｃｏｍｐｏｓｉｔｉｎｅ１ｎｉｎｏａｃｅｌ‐ ＡＬ）Ｋｉｎａｓｅａ. Ｃａｒｉｐ. Ｒａｂｂｉｔ ▲ ４７ｔっムＱＪＱＶ＾ ‘ハ＝ＶｎＸＵ . ＡｓｘＴｈｒ. ４６. ４４. １６. １７. Ｓｅｒ. ２３. ２２. Ｇ１ｘ. ３８. ３９. Ｇ１ｙＡ１ａ. ３３. ３３. ２０. ２２. ３０. Ｖａ１. ３０. Ｍｅｔ１ｌｅ. ８１３. １４. Ｌｅｕ. ３９. ３７. ＴｙｒＰｈｅＬｙｓ. ｌｌ. ｌｌ１６. ３０. ３４. Ｈｉｓ. １８. １７. Ａｒｇ ‐ Ｐ１ｏ. ２１. １８. １８. １８. ｂ）Ｃｙｓ）ｃＴｒｌ）. ４. Ｔｏｔａ１. ３８０. ４. ハ．ＡＩ. １６. ３８０. Ｑ｝Ｖａｌｌｏｆａｍｉｉｄハｎｏｌｏｆｃｕｅｓａｒｅｍｏｉｉｎｏａｔｔｃｒ税ＩｅｋＥ凪ｓｅ．Ｔｈｌｌｉｆｃｔｏｉｅｍｏｅｉ〔コ」ａｒｗｅｔｉｍａｒｔｔｄｔｅ盟ｔｅｋｎａｇｈａｆＰｃｓｅｗａｓｅａｅｏｂｅ４３ｉｏｏｏａｄｎｔｌｆＳＤＳ‐ＰＡＧＥａｒｔｔｄｔｈｃｃｏｏｔｅｐａｅ・ｎｏｇｔ１・ｅ，５ｌ）ｂｂｂ｝ｉｉｔｃｉｖａｕｅｒｒｔｅゴｉｄｂｙＰｕｓｆｏ２１ｒｌｅａｎｅｋｎａｔｔａｓｅｄｖｅｎｅｙｅ ‐ Ｄｅｔｄａｉｉｄａｆｆｔｅｒｍｉｎｅｔｌｎｊｉｄｏｘｓｃｙｉｄｉｄｓｅｃａｃｒｐｅｔｅｒｏｃａｃａｏｎａｌｌ１ゎＣ）Ｄｅｈｙ（もｒｌｉ１ｆ１８ｏｓｓｉｎ６ＮＨＣｔｄｂｙ仕｝ｏｒ１１ｒｙｅｒｍｉｎｔｅｅｓｃｒｏ ‐ ｐｅ．１８）ｔｔ ± ｌｆＥｄｌｈｏ（五ｏｍｅロｉｃｍｅｏｄｏｐｈｏｅ．. ４９（）. ９７.

(11) . ９８. 矢沢洋一・東出由香. 精製コイクレアチンキナーゼのアミノ酸分析を行い，すでに報告されている家兎骨格筋クレアチンキナーゼのアミノ酸組成と共に表１にのせた．若干のアミノ酸の含有量に差がみられるもののよく似た組成を示し，家兎の場合と同様に，全部で３８０個のアミノ酸から成っていた．コイクレアチンキナーゼ活性へのｐＨの影響を検討した．図８に示されている様に，正反応では，ｐＨ７‐０に至適ｐＨを持ち，それ以上のアルカリ側ｐＨでは活性の急激な低下を示した．一方，逆反０応ではｐＨの上昇と共に活性も少しずつ増大していき，ＰＨ８‐５～ｐＨ９ ‐０のあたりで最大活性２ｉ／ｍｇ・ｍｉｎの値を示した．これは，正反応のｐＨ７ ‐０における最大比活性の約１月５であった． ”ｍｏｌｐコイクレアチンキナーゼに対する２価金属イオンの影響について，正反応の場合を図９に示した．. 活性化の程度は，Ｍｎ＞Ｍｇ＞ＣａキＣｏという順であり，これは今迄に知られている，晴乳類と鳥類の. ＵＯＸＵ－で墓参ＥさＡ零Ｅユーに〉－. ｐＨ. ｉｔｉｖｉｉｅｓｏｆｔｈｅｆｔｏｎｓ（△）ｓｅｒｅａｃＦｉｉｏｒｗａｒｄ（○）ａｎｄｒｅｖｅｒｇ．８．ＥｆｆｅｃｔｏｆｐＨｏｎｔｈｅａｃｔｉｏｎｗａｓｔｈａｔｆｄｆｔｈｔｄｉｉｔｒｅａｃｉｎｅｋｉｎａｓｅＴｈｏｒｗａｒｎｏｅｃｎｏａ祭；ａｏｏｆｃｒｅａｔｅｙ．ｉｏｕｓｈ … ｄＯＰｓｂｕａｄｅｓｃｒｉｂｅｄｉｎＦｉｇ．２ｅｘｃｅｐｔｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｖａｒｅｒｓｏｆｌｏｍ４ ‐ ｉｏｎ：ｌＡｌｏｗｉｎｇｃｏｎｄｉｔｏｍハｉｏｎｗａｓａｓｓａｙｅｄｕｎｄｅｒ社ｌＴｈｅｒｅｖｅｒｓｅｒｅａｃｔｅｆｏｌｉ江○ＰＳｂｕｆｆｅｒｓａｔ２Ｃ．ｏｍ凸４Ｄｉｎｅ５ｒ述虻ＡＴＰｃｒｅａｔ２，ａｎｄｖａｒｏｕｓｌ，１，ｌｍＤαＤｄｇＣ１. １００. ｎｎ. ｎ［. １１. ，，. ｅＣＩＦＯＣＱＭ９ＢＱ一ｎＮ. ｉｖｉｔｙｉｎｔｈｅｆｏｒｗａｒｄｉｎｅｋｉｎａｓｅａｃｔＦｉｉｇ．９．ＥｆｆｅｃｔｏｆｄｉｖａｌｅｎｔｍｅｔａｌｉｏｎｓｏｎｃｒｅａｔｉせまｄｉｄｄｔｄｅＴｈｒコヒｌｔｎｎｏｓｉｅｒｅｃｏｕｎｓｃｄｂｅｄｉｎＦｉｇｔｗａａｅｏｕｅａｓｓａｙｓｃｒｅａｃｏｎ－２ ‐. ｉｖａｌｉｏｕｓｄｅｎｔｍｅｔａｌｉｏｎｓｏｆｌｍＤ４ＥＤＴＡ．ｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｌｍＤαｏｆｖａｒｅ×ｃｅｐｔｆｏｒせｌ. ５０）（.

(12) . コイ骨格筋クレアチンキナーゼの単離・精製とその諸性質. ９９. ９）と良く似た結果を示したクレアチンキナーゼについて得られたもの１．以上より，コイ骨格筋クレアチンキナーゼの物理化学的，生化学的諸性質は今までに報告されてきた脊椎動物の鳥類や哨乳類の骨格筋クレアチンキナーゼとよく似た性質を持つと結論された．. 要. 約. コイ骨格筋より，硫安分画，イオン交換カラム，ゲル澱過法，疎水力ラムを用いてクレアチンキナーゼを単離精製した．ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるサブユニット分子量は，４３Ｋでありｎａｔｉｖｅ－ＰＡＧＥで，. 単一のバンドを示した．生理的条件下での分子量は約８５Ｋと算定され，他の脊椎動物骨格筋同様２量体である事が示された．アミノ酸分析結果より，３８０個のアミノ酸から成っている事が明かとなった．その酵素活性の，ＰＨ依存性と二価金属イオンに対する効果を検討した所，分子量やアミノ酸組成と同様に，鳥類や哨乳類のクレアチンキナーゼと似た傾向を示した．Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ１）Ｋｕｂｙ），Ｊ１９５４ｏｌ．Ａ．－，Ｓ，Ｎｏｄａ．Ｂｉ．Ｃｈｅｍ‐ ，Ｌ，ａｎｄＬａｒｄｙ，Ｈ．Ａ‐（，２０９，１９１ｈｅＴＮ２）ＮｉｉｄＬｄＭｌＭＦ（１９１Ｂｉｌ６）ＣｈＪ２３６ｏａａｎｏｒａｅｓｏｅｍ．．．． ‐ ，，，，．．，，，，３２０３３）Ｂｅｎｅｓｃｈ１９５５）ｃｈｏｌ，Ｒ．Ｅ．，Ｌａｒｄｙ．Ｂｉ，Ｈ．Ａ．，ａｎｄＢｅｎｅｓ ‐Ｃｈｅｍ．，Ｒ－（，Ｊ，２１６，６６３４）ＲｅｅｄＧ日ｄｃｈＭ（Ｂ１９７２）ｉｌＣｈ２４７３０７３ｊａｎｏｅｎｏｅｍ ‐ ‐ ‐ ‐ ．，，，，，ｌ５）Ｐｕｔｎｅｙｉｌｙｌｌａｇａａｎｃｋｅ１頃ｎｇｊｅｅｍａｍｎ－，Ｓ，Ｈｅｒ，帆もＲｏｙａ，Ｎ．，Ｐａｎｇ，Ｈ‐ ，ＡＰｏｓｈｉ，Ｈ－Ｖ‐ ，Ｐｉ，Ｌ－ ‐ ，Ｂｅ，Ｒ‐ ，Ｂｉ，Ｋ．，ＰａｇｅＤ．ＳｄｓｈｉｌＰ（Ｂ１９８４）ｉｌＣｈ２５９１４３１７ＪａｎｃｍｍｅＩ孔ｏｅ－－－，Ｋｕｂｙ．，，，，，，６）Ｐｅ”ｙｍａｎ１９８６）ｒｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓｓ，ＡりＢｏｈｍｅｙｅｒ，Ｍ‐Ｂ，，，Ｋｅｍｅ，Ｓ，ａｎｄＲｏｂｅ【ｓ，．Ｊ ‐Ｒｅ，Ｒ，（ ‐ ．ｃｏｍｍｕｎ，Ｂｉ，１４０，９８１ｉｌｌｉ７）Ｇｉｒａｕｄａｔ１９８４ｅｒｓ‐Ｔｈｅ），Ｐｒｏｃｌｉーばｉａｒｄｌｙ，Ａ‐ ．，Ｊ，Ｄｅｖ．（，Ｐｅ，ｊ‐Ｃ‐ ，ａｎｄＣｈａｎｇｅｕｘ，ｊ‐Ｐ．．Ｎａｔ．Ｓｃ．ＵＳＡ，Ａｃａｄ. ，. ８１，７３１３８）Ｓｃｏｐｅｓｌｉ１９６８）Ｊｓｅｎ‐Ｒｅｙｓｈ，Ｆｉ，Ｒ，Ｋ，，ａｎｄＧｏｓ ‐Ｂｄ，Ｃａｎ ‐Ｒｅｓ，Ｃ‐（－，２５，２７１５９）ＳｉｍｏｎａｒｓｏｎＢｄｗｒＤＣｔ（１９７２ｌｉｔ）ｂｈｄｄａｎａｓｔｕｌ．ｕｓｅａａｐ ‐ ． ‐ ，，，，）Ｕｈｒｌｏ１９６６）ｃｕｓｏｌ－．Ｆ－（，Ｍ．Ｌ，ａｎｄＭｏｌｄｓｏｎ，Ｍａｒ，Ｆ．．Ｂｉ－Ｃｈｅｍ．，Ｊ，ｊ，２２１，５４２８１１）ＳａｋａｉＳ（１２）Ｂｉｈ９５２５５ヱｏｃｅｍ玉型ｃｈ．，．，，，１２）ＲｏｓｅｎｂｅｒｇＴｉｓｏｎ）Ｂｉｏｃｈｅｍ‐Ｊ１９５６．（，日．Ａ．，Ｅ１ｍｏｒ，日．，ａｎｄＭｏＺ ‐ ，日．Ｆ，６３，１５３. １３）Ｆｉｓｋｅ１９２５）ｌ，Ｃ．Ｈ．，ａｎｄＳｕｂｂａＲｏｗ，Ｙ．（．Ｂｉｏ ‐Ｃｈｅｍ．，ｊ，６６，３７５Ｐ１４ｄＡＭ）Ｐｏｒｚｉｏ，Ｍ．Ａ．（９）Ｂ１７７ｉｈｉＢｉｈａｎｅａｒｓｏｎｏｃｍｏｐｙｓ－－Ａｃｔａ，，．－，，４９０，２７１５）ｏｍｓｉｉｔｅ）１９６４Ｊｉｎｓ－（．Ｎ‐Ｙ－Ａｃａｄ，Ｌ‐ ，ａｎｄＤａｖ，Ｂ．．Ｓｃ－，Ａｎｎ，１２１，３２１１６）ＭｏｏｒｅＳｄＳｉァ ‘ ＺＨ（９）Ｍｔ１６ｔ士ｌｄｉＥｌｎ６１９６３ａｅｎ）３ｅｏｓｎｎｚ立Ｉｏｏｙｇｙ－， ‐ ，，，，８１９（１７）ＭｏｏｒｅＳ（１９６３）Ｂｉ１ｈＣ２３８２３Ｊ５ｏｅｍ ‐ ， ‐ ．，・，，１８）Ｅｄｅ１ｈｏｃｈ１９６７）ｔｏｃｈｅｍｉｓ．ｙ，６，日．（，Ｂｉ，１９４８１９）Ｍｉｌｉｔｅ１９７１）ｔｎｅｒ－▽Ｖｈｓｏｃｈｅ１コ・ ‐ｊ，ＥＪ．，ａｎｄＶＶａｔ，Ｄ．Ｃ．（．，Ｂｉ，１２２，７２７. ５１（）.

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