ヒトヘルペスウイルス7型のDNA ポリメラーゼサブユニットに対する単クローン抗体の性状と有用性

岡山 医学会雑 誌 第117巻 January2006,pp.219-224

原

著

ヒ トヘ ル ペ ス ウ イル ス7型

のDNAポ

リメ ラー ゼ サ ブ ユ ニ ッ トに

対 す る単 ク ロー ン抗 体 の 性 状 と有 用 性

難波 ひか る

Characterization and usefulness of a monoclonal antibody against human herpesvirus-7 DNA polymerase processivity factor

Hikaru Namba

Department of Virology,Okayama University Graduate School of Medicine, Dentistry and Pharmaceutical Sciences,Okayama 700-8558,Japan

(Director:Prof.M.Yamada)

A monoclonal antibody(MAb),IK17,was developed and found useful for the analysis of human herpesvirus-7 (HHV7)genome replication.In Western blot analysis,the MAb IK17specifically detected an HHV7 DNA polymerase subunit,U27protein,expressed in both Escherichia coli(E.Coli)and HHV7-infected cells.Analysis by the same method of truncated U27proteins expressed in E.Coli demonstrated that the MAb IK17recognizes an epitope between amino acid1and133of the U27protein.The indirect immunofluorescence(IF)method with MAb IK17detected an unexpected reduction of U27protein in the infected cells that were treated with a viral DNA polymerase inhibitor,phosphonoacetic acid(PAA),although no reduction of U27mRNA was observed in the cells by Northern blot analysis.The data suggest the possible usefulness of the MAb IK17for obtaining clues to characterize an unknown feature of the U27protein.Immunoprecipitation experiments with the MAb IK17enabled to detect at least four U27protein-associated phosphorylated polypeptides in addition to the U27protein itself.The result indicates the usefulness of the MAb IK17for qualitative and quantitative analysis of the U27protein-associated viral and cellular factors.These analyses contribute to elucidation of the HHV7genome replication system.

キ ー ワ ー ド:ヒ トヘ ル ペ ス ウ イ ル ス7型(Human Herpesvirus-7),DNA polymerase processivity factor, 単 ク ロ ー ン 抗 体(monoclonal antibody) 緒 言 大 多 数 の ヒ トが ヒ トヘ ル ペ ス ウ イル ス をそ の 身 体 の 中 に 保 有 して い る.そ の な か で も,β ヘ ル ペ ス ウ イル ス に属 す る3種 の ウ イ ル ス,ヒ トサ イ トメガ ロ ウ イ ル ス,ヒ トヘ ル ペ ス ウ イ ル ス6型(HHV6) _{,ヒ トヘ ル ペ ス ウ イ ル ス7型} (HHV7)は,ほ とん どの ヒ トに よ り保 有 され る ウ イ ル ス で あ る1,2).この 保 有 率 の 高 さ は,こ れ らの ウ イル ス が,巧 妙 な免 疫 回避 機 能 を備 え て い る こ と,並 び に宿 主 細 胞 へ の 障 害 を最 小 限 に 抑 え た効 率 の 良 い ウ イル ス増 殖 機 構 を持 っ て い る こ と,に 起 因 す る と考 え られ る.特 に,HHV7は, 宿 主 の 免 疫 能 が低 下 した 際 に も特 記 すべ き疾 病 を引 き起 こ した とい う報 告 が 認 め られ な い.ま た,健 常 人 で も唾 液 中 に 高 頻 度 に感 染 性 ウ イ ル ス を排 出 して い る3-7).これ らの事 実 か らHHV7が 宿 主 と最 も よ く調 和 し,共 存 共 栄 を は か っ て い る ウ イ ル ス で あ る と言 う こ とが で き る. 保 有 率 の 高 さ を説 明す る上 記 二 つ の理 由 の う ち,「免 疫 回 避 機 能 」 は 数 多 くの研 究 が な さ れ,解 明 さ れ つ つ あ る8-11). しか し,「宿 主 細 胞 障 害 を最 小 限 に抑 え た効 率 的 ウ イル ス増 殖 機 構 」 につ い て は ほ とん ど明 らか に され て い な い.ウ イ ル ス 増 殖 機 構 の 中 で 最 も重 要 な もの は ウ イル ス ゲ ノム 複 製 で あ る.そ して,ウ イ ル ス ゲ ノム 複 製 の 中 心 に位 置 す る の が ウ イ ル ス 由来DNAポ リメ ラ ー ゼ で あ る.そ こ で,HHV7 が 如 何 に して 「宿 主 細 胞 障 害 を最 小 限 に 抑 え た効 率 的 ウ イ ル ス増 殖 機 構 」 を作 り上 げ て い るか を 明 らか にす る一 環 と して,HHV7由 来DNAポ リメ ラー ゼ と,他 のHHV7由 平 成17年7月15日 受 理 〒700-8558岡 山 市 鹿 田町2-5-1 電 話:086-235-7167 FAX:086-235-7169 E-mail:[email protected]

比 較 す る こ と が 重 要 で あ る.こ の 調 査 ・研 究 を 行 う た め に はHHV7由 来DNAポ リ メ ラ ー ゼ に 対 す る 単 ク ロ ー ン 抗 体 が 必 要 で あ る.特 に,免 疫 沈 降 法 に よ りHHV7由 来DNA ポ リ メ ラ ー ゼ と複 合 体 を 形 成 す る 他 の 因 子 を 分 取 で き る 単 ク ロ ー ン 抗 体 が 必 須 で あ る.今 回,筆 者 はHHV7由 来DNA ポ リ メ ラ ー ゼ に 対 す る 単 ク ロ ー ン 抗 体 を作 成 し,そ の 単 ク ロ ー ン 抗 体 がHHV7由 来DNAポ リ メ ラ ー ゼ と相 互 作 用 す る他 の 因 子 を 解 析 す る こ と に 有 用 で あ る こ とが 判 明 し た の で 報 告 す る. 材 料 と 方 法 1.  細 胞 と ウ イ ル ス ウ イ ル ス 増 殖 に は 臍 帯 血 単 核 球(CBMC)を 用 い た.臍 帯 血 をPBS(-)で 希 釈 後,Ficoll-conrayに て 分 離 し,

10%fetal calf serum(FCS),5ug/ml phytohemag-glutinin(PHA),0.1U/ml組 換 え ヒ トinterleukin-2(IL -2)含 有RPMI1640培 地 で3日 間 培 養 後 ,ウ イ ル ス を 感 染 させ た.HHV7は 臨 床 分 離 株 で あ るMSO株 とMRK株12) を使 用 し た.培 養3日 目 のCBMCとHHV7感 染 細 胞 を5: 1で 混 合 し,10%FCS,5ug/mlPHA,0.1U/ml IL-2 含 有RPM I1640培 地 で5日 間 共 培 養 し た.培 養 液 を 遠 心 分 離 し,上 清 か ら 感 染 実 験 の ウ イ ル ス 液,あ る い は,精 製 ウ イ ル ス 粒 子 を 調 製 し た.こ の 精 製 ウ イ ル ス 粒 子 は,単 ク ロ ー ン 抗 体 作 製 の 抗 原_{,ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ の 抗 原 に} 供 し た.一 方,HHV7感 染 細 胞 は 間 接 蛍 光 抗 体 法 や ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ の 抗 原 に 供 し た. 2.  単 ク ロ ー ン 抗 体 の 作 成 単 ク ロ ー ン 抗 体(MAb)の 作 成 は 常 法 に 従 っ た13).HHV7 感 染 細 胞 をFreund's complete adjuvantと 共 に,6週 齢

BALB/cマ ウ ス の 背 面 皮 下 に 免 疫 し た.3∼4週 後,精 製 HHV7粒 子 を静 脈 注 射 し ブ ー ス ト を か け,そ の3日 後 に エ ー テ ル 麻 酔 に よ り安 楽 死 さ せ_{,脾 臓 リ ン パ 球 を 分 離 し た.} 脾 臓 リ ン パ 球 をP3×63-Ag8-U1myeloma cellsと50% polyethylene glycol4000存 在 下 で 融 合 し,96穴 プ レ ー トで HAT培 地 を 用 い て 培 養 し た.増 殖 し た 細 胞(ハ イ ブ リ ドー マ)の 上 清 を 用 い て,HHV7感 染 細 胞 を 抗 原 とす る 間 接 蛍 光 抗 体 法 を お こ な い,抗 体 産 生 細 胞 を選 択 し た.さ ら に, 抗 体 産 生 細 胞 を 限 界 希 釈 法 に よ り単 一 ク ロ ー ン と し た. 3. Glutathione-S-transferase(GST)融 合HHV7U27蛋 白 質 の 作 製 HHV7JI株14)のU27蛋 白 質 ア ミ ノ 酸 配 列 をGENETYX ソ フ トウ エ ア を用 い て 解 析 し,T細 胞 認 識 エ ピ トー プ を 検 索 し た.そ こ でU27全 長(727F;Met1-Met364)と,予 想 さ れ るT cell epitopeの 分 布 よ り3つ の 部

分(727N;Met1-割 し てGST融 合 蛋 白 質,GST727N,GST727M,GST727C

を 作 製 し た(図1).蛋 白質 の 発 現 は ア マ シ ャ ム ジ ャ パ ン の GST融 合 蛋 白 質 発 現 キ ッ トを 用 い た.ま ず,目 的 部 分 の プ ラ イ マ ー と し て,727FはH7U27BEA (5'-cgggatccgcgat ggatcgtagcaa-3') とH7U27BE3E (5'-ccggaattccgg

cattccacatctttgtct-3'), 727N は H7U27BEA と H7U27BENIE (5'-ccggaattccggtgatgccgtgacta-3'),

727M は H7U27M2BEB (5'-cg99atccgatatttgtg cacaag-3') とH7U27BEMlF (5'-ccggaattccggtttagc

gattaaaa-3'), 727CはH7U27BECIB (5'-cg99atccgc gaatgtttttctgacc-3')とH7U27BE3Eを 用 い,HHV7MSO 株 のDNAを 鋳 型 と し て,94℃30秒 間,56℃60秒 間,72℃ 60秒 間 の 反 応 を25サ イ ク ル 行 い,目 的 遺 伝 子 を 増 幅 し た. 増 幅 し た 遺 伝 子 を 制 限 酵 素Bam H IとEco R Iで 処 理 し, 精 製 後 に.Bam H IとEco R Iで 処 理 し たpGEX-4T-1ク

ロ ー ニ ン グ ベ ク タ ー に 接 合 し,大 腸 菌JM109に 形 質 導 入 し た.ア ン ピ シ リ ン 添 加LB培 地 上 で コ ロ ニ ー を 選 別 し た 後, 目 的 の 蛋 白 質 を 発 現 し て い る コ ロ ニ ー を 選 択 し,プ ラ ス ミ ドク ロ ー ン を 抽 出 し保 存 し た.得 ら れ た ク ロ ー ン を 大 腸 菌 BL21株 に 導 入 し,0.1mM IPTGで 発 現 誘 導 し た 大 腸 菌 lysateを 抗 原 と し て 供 し た. 4. ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ HHV7MRK株 感 染 細 胞 ま た はGST融 合U27蛋 白質 を 発 現 す る大 腸 菌 を 抗 原 と し,10%SDS-PAGE電 気 泳 動 後, ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 に 転 写 し,5%ス キ ム ミル ク,0.2% Tween-20添 加TBS(20mM Tris-HCI,0.5M NaC1,pH 7.5)で ブ ロ ッ キ ン グ し た.単 ク ロ ー ン 抗 体 反 応 後,TBSで 洗 浄 し,2次 抗 体(ア ル カ リ フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ 標 識 抗 マ ウ スIgG抗 体)を 更 に 反 応 さ せ た.検 出 は バ イ オ ラ ッ ド製 発 色 キ ッ ト を 用 い た. 図1  GST融 合U27部 分 蛋 白 質 の 構 造 HHV7U27蛋 白 質 の 全 長 を727F(Met1-Met364),部 分 蛋 白 質 を 727N(Met1-Ser133),727M(Asp134-Lys267),727C(Asn268-Met364)と し,N末 側 にGSTを 融 合 し て,GST727F,GST727N, GST727M,GST727Cと し た.GENETYXソ フ ト ウ エ ア で 予 想 さ れ るT cell epitopeの 存 在 を*で 示 す.PSORTソ フ ト ウ

抗HHV7単 ク ロ ー ン 抗 体 解 析:難 波 ひ か る 5.  免 疫 蛍 光 抗 体 法(IF) HHV7MSO株 感 染 細 胞 をPBS(一)で 洗 浄 後,14穴 ス ラ イ ドグ ラ ス 上 で 風 乾 後,冷 ア セ トン 固 定 し た.ハ イ ブ リ ドー マ の 培 養 上 清 を1次 抗 体 と し,FITC標 識 抗 マ ウ ス IgG抗 体 を2次 抗 体 と し た. 6.  ノ ザ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ 培 養3日 目 のCBMCにHHV7MSO株 を 感 染 させ, 12,36,72時 間 後,cycloheximide存 在 下 で12時 間 後,ホ ス ホ ノ 酢 酸(PAA)存 在 下 で36時 間 後 に 細 胞 を 回 収 し,AGPC 法15)に てRNAを 抽 出 し た.抽 出 し たRNAをDNaseI処 理 し,20ugtotalRNAを 泳 動 に 用 い た.ホ ル ム ア ル デ ヒ ドゲ ル で 泳 動 し,Hybond-N+(Amersham)に プ ロ ッ テ ィ ン グ し た.HHV7U27全 長,U54全 長,β 一actin遺 伝 子 を 放 射 標 識 プ ロ ー ブ と し て 用 い て ハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ン し, オ ー トラ ジ オ グ ラ フ ィ ー に て 検 出 し た. 7.  免 疫 沈 降 法 HHV7MSO株 を1TCID50/cel1でCBMCに 感 染 さ せ, 感 染 後3日 目 に 培 養3日 目 の 非 感 染 細 胞 と1:3で 混 合 し,

50uCi/ml[35S]methionine(Amersham)

200uCi/ml[32P]orthophosphate

(Dupon)を 加 え た10% FCS,5ug/mlPHA,0.1U/ml

IL-2含 有RPMI1640培 地(GIBCO)で48時 間 培 養 し た. HHV7感 染 細 胞 をRIPA緩 衝 液(0.15MNaCl,1mM

EDTA,1% TritonX-100,1% deoxycholic acid,0.1 %sodium dodecyl sulfate,1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride,0.1 mM TLCK,0.1 mM TPCK,2 mM

Tris-HCI,pH7.2)に て 溶 解 し,遠 心(50,000xg,1時 間)し て 上 清 に 抗HHV7MAbIK17を 加 え て4℃ で 反 応 後,

recombinant Protein G Sepharose 4B(Zymed

Labora-tories)で 免 疫 複 合 体 を 回 収 し,SDS-PAGE泳 動 後 に オ ー ト ラ ジ オ グ ラ フ ィ ー に て 検 出 し た. 結 果 1.  GST融 合HHV7U27蛋 白 質 に 対 す る 抗HHV7単 ク ロ ー ン 抗 体 の 反 応 性 HHV7のDNAポ リ メ ラ ー ゼ サ ブ ユ ニ ッ トで あ るU27蛋 白 質 全 長(727F)をGST融 合 蛋 白 質(GST727F)と し て 大 腸 菌 で 発 現 さ せ た(図1).こ のGST727Fを 発 現 す る 大 腸 菌lysateを 用 い て,作 製 し た 抗HHV7MAbの 反 応 性 を ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト法 で 調 べ た.そ の 結 果,MAbIK17 がGST727Fを 認 識 し た(図2). 2.  HHV7MRK株 感 染 細 胞 に お け るMAbIK17の 反 応 性 MAbIK17を 用 い てHHV7感 染 細 胞lysateを 抗 原 と し た ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ を 行 っ た と こ ろ,40kDaの 単 一 バ ン ドが 検 出 さ れ た(図3) .ま た,間 接 蛍 光 抗 体 法 に よ りHHV7感 染 細 胞 に お い てMAbIK17に 認 識 さ れ る抗 原 (U27蛋 白質)の 発 現 が 核 に 認 め ら れ た(図4).ま た,ウ イ ル スDNA polymerase阻 害 剤 で あ るPAA添 加 に よ り, U27蛋 白 質 の 発 現 が 減 弱 し た.ノ ザ ンハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 法 に よ る解 析 で はPAA添 加 に よ る低 下 は 認 め られ な か っ た.一 方,後 期 遺 伝 子 で あ るU54遺 伝 子 の 発 現 はPAA添 加 に よ り減 弱 し た(デ ー タ は 示 し て い な い). 3.  MAbIK17が 認 識 す る領 域 の 同 定 HHV7U27蛋 白 質 を3つ の 領 域 に 分 け,GST融 合 蛋 白 質 と し て,GST727N,GST727M,GST727Cを 発 現(図 1)し,ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ を 行 っ た.そ の 結 果, 3つ の 部 分 蛋 白 質 の う ち,GST727Nの み がMAbIK17に 反 応 し た(図5). 4.  MAbIK17に よ り共 沈 す る 蛋 白 質 複 合 体 MAbIKI7を 用 い た[35S]methionine標 識 免 疫 沈 降 法 に よ り,共 沈 す る複 数 の 蛋 白質 が 認 め ら れ た(図6).加 え て, [32P]orthophosphate標 識 に よ る免 疫 沈 降 法 で は,リ ン 酸 化 活 性 の 強 いU27蛋 白質(40kDa)の 他 に,複 数 の リ ン 酸 化 蛋 白 質 の 共 沈 が 認 め ら れ た(図6). 図2  MAbIK17のGST融 合U27蛋 白質 に 対 す る 反 応 性 GST727F発 現 プ ラ ス ミ ドを 導 入 し た大 腸 菌BL21(lane1) に0.1mMIPTG添 加(lane2),empty vectorを 導 入 し0.1 mMIPTG添 加(1ane3)し て 発 現 誘 導 させ た大 腸 菌lysate

を抗 原 に し た ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ.左 側 の 数 字 は タ ンパ ク 分 子 量 マ ー カー の 位 置 を 示 す.矢 印 はGST727F(66kDa)を 示

図3  HHV7感 染 細 胞 に お け るMAbIK17の 反 応 性 HHV7感 染5日 後 の 臍 帯 血 単 核 球lysateを 用 い た ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ.非 感 染 臍 帯 血 単 核 球(lane1),HHV7感 染 臍 帯 血 単 核 球(1ane2)のlysateを 抗 原 と し,MAbIK17で 検 出 した.左 側 の 数 字 は 蛋 白分 子 量 マ ー カ ー を示 す.矢 印 はU27蛋 白 質 に 相 当 す る40kDaの バ ン ドを示 し て い る. 図5GST融 合U27部 分 蛋 白質 を用 い たMAbIK17認 識 領 域 の 同 定 GST727N(lane1),GST727M(1ane2),GST727C(lane 3)を 発 現 させ た 大 腸 菌lysateを 抗 原 と し て,MAbIK17に 対 す る 反 応 性 を ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト法 で 調 べ た.左 側 の 数 字 は蛋 白 分 子 量 マ ー カ ー を示 す.右 側 矢 印 はGST727Nに 相 当す る41kDa の バ ン ドを示 し て い る. HHV7感 染5日 後 の臍 帯血 単核球 に対す るMAbIK17の 反 応性 を間接 蛍光 抗体 法 で調べ た.矢 印 はMAbIK17で 検 出されるU27 蛋 自質 の核 局在 を示 す. 図6  MAbIK17を 用 い たHHV7感 染 細 胞 に お け る免 疫 沈 降 反 応 HHV7感 染3日 目の 臍 帯 血 単 核 球 と培 養2日 目 の 非 感 染 臍 帯 血 単 核 球 を[35S]methionine(lane1)ま た は[32P]orthophosphate (lane2)存 在 下 で 共 培 養 して 放 射 標 識 さ れ た 細 胞lysateを 用 い てMAbIK17で 免 疫 沈 降 させ た.沈 降 した免 疫 複 合 体 をSDS -PAGEで _{泳 動 ,乾 燥 し た ゲ ル の オ ー トラ ジ オ グ ラ フ ィー.左 側} の 数 字 は 蛋 白 質 分 子 量 マ ー カー,右 側 の 矢 印 はU27に 相 当 す る40 kDaの バ ン ド を示 す.

抗HHV7単 ク ロー ン抗 体 解 析:難 波 ひ か る 考 察 MAbIK17は 大 腸 菌 で発 現 させ たHHV7のDNAポ リ メ ラー ゼ サ ブ ユ ニ ッ トU27蛋 白質 を ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト法 で特 異 的 に検 出 した.ま た,MAb IK17はHHV7感 染 細 胞 のlysateを ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト法 で解 析 した 際 に,U27蛋 白質 に 相 当す る40kDaの 蛋 白質 を検 出 した.さ らに,U27 蛋 白質 の 一一部 を大 腸 菌 で 発 現 させ て,MAb IK17を 用 い た ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト法 で解 析 す る と,MAb IK17はU27蛋 白質 の1-133ア ミノ酸 を発 現 させ た場 合 に蛋 白質 と結 合 し た.こ れ らの 事 実 か らMAb IK17はHHV7U27蛋 白質 の N末 端 を特 異 的 に 認 識 す る こ とが 明 らか とな った.Takeda ら16)はHHV7のU27蛋 白質 のC末 端 を認 識 す るMAb5H4 を報 告 して い る.こ れ に対 し,MAb IK17はMAb5H4と は 異 な る エ ピ トー プ を認 識 して い る.こ の こ とが 下 記 に 述 べ る よ うに 重 要 な意 味 を もっ て くる.

MAb IK17を 用 い た免 疫 沈 降 法 に よ って,感 染 細 胞lysate を調 べ た とこ ろ,U27蛋 白質 と結 合 す る5つ 以 上 の 蛋 白質 が 同定 され た.こ の うち少 な く と も4つ の 蛋 白質 は リン酸 化 蛋 白質 で あ り,1つ は 非 リン酸 化 蛋 白質 で あ った.こ の 結 果 は,こ れ らの 蛋 白質 が,U27蛋 白質 と結 合 し,何 らか の 相 互 作 用 を して い る こ とを示 唆 す る.U27蛋 白質 はDNA polymeraseの サ ブ ユ ニ ッ トで あ る こ とか ら,U27蛋 白質 と の 結 合 が 確 認 さ れ た こ れ らの 蛋 白 質 群 の 一 部 は,HHV7 DNA複 製 に関 連 す る ウ イル ス 由 来 蛋 白質 で あ るこ とが 予 想 され る.ま た,こ れ らの 蛋 白質 群 の 中 に は,そ の推 定 分 子 量 か ら考 え て ウ イ ル ス 由 来 複 製 関 連 蛋 白質 とは 考 え が た い もの も あ り,細 胞 側 因 子 で は な い か と考 え られ る.こ れ ら の事 柄 か らMAb IK17はU27蛋 白質 を 中心 とす るHHV7 DNA複 _{製 を解 析 す るの に役 立 つ 抗 体 で あ る.一 方,U27蛋} 白質 のC末 端 を認 識 す るMAb5H4を 用 い た実 験 で は,U 27蛋 白質 と共 沈 す る蛋 白質 の 存 在 は示 され て い な い.こ れ は,MAb5H4の 認 識 エ ピ トー プ がU27蛋 白質 と他 の 因子 の 結 合 を 阻 害 す る部 位 に存 在 す る ため と考 え られ る.し たが って,U27蛋 白質 を 中心 とす るHHV7 DNA複 製 の解 析 に は,MAb 5H4よ りMAb IK17の 方 が優 れ て い る と言 え る. MAb IK17をIF法 に よ る感 染 細 胞 中 の抗 原検 出 に用 い て み る と,U27蛋 自質 は核 の 中 に局 在 す る こ とが 認 め られ た.こ の 結 果 はTakedaら16)の _{報 告 と一 致 す る.ま た,PAA} を用 い て 同 様 の検 討 を試 み た 際 に,U27蛋 白質 発 現 の 減 少 が 認 め られ た.し か し,ノ ザ ン法 に よ りU27遺 伝 子 の 発 現 を調 べ た と こ ろ,U27 mRNAは 減 少 して い な か っ た(デ ー タ は 示 して い な い).し たが っ て,こ の 予 期 せ ぬPAAに よ るU27蛋 白質 発 現 の減 少 は,U27遺 伝 子 の転 写 レベ ル で 生 じた もの で は な く,U27mRNAか らの翻 訳,ま た はU27 蛋 白質 の安 定 性 の低 下 か ら起 こ っ た 可 能 性 が 推 測 さ れ る. この よ うに,MAb IK17はU27蛋 白質 の 代 謝 に 関 す る未知 な る部 分 を調べ る こ とに役 立 つ か も しれ な い.

今 後 は,MAb IK17を 用 い て,U27蛋 白質 を中 心 と した HHV7DNA複 製 の質 的,量 的 な解 析 を行 っ て い くつ も り で あ る.

結 語

HHV7 DNA polymeraseの サ ブ ユ ニ ッ トで あ るproces-sivity factorに 対 す るMAb _{IK17を 作 製 した.MAb IK17} は ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト,蛍 光 抗 体 法(IF),免 疫 沈 降 法 に 適 用 可 能 で あ っ た.特 に,MAb IK17を 用 い た 免 疫 沈 降法 に よ りU27蛋 白質 と結 合 す る複 数 の 蛋 白質 を 同定 す る こ とが で き た こ とか ら,U27蛋 白質 の 関 与 す る,ウ イ ル スDNAの 複 製 機 構 の解 析 に 有 用 で あ る こ とが示 唆 さ れ た. 謝 辞 稿 を終 えるにあた り,御指導 と御校 閲を賜った岡山大学大学院医歯 薬総合研究科病 原ウイルス学教室の山田雅夫教授 に深謝致 します. 文 献

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