論文 内 容の 要旨
医 薬 品 が 適 正 に 薬 効 を 発 揮 す る た め に は 、 有 効 成 分 で あ る 薬 物 を 必 要 量 、 標 的 部 位 に 送 達 さ せ る こ と が 重 要 で あ る 。 一 般 に 、 経 口 投 与 さ れ た 薬 物 は 、 吸 収 お よ び 分 布 過 程 を 経 て 標 的 臓 器 に 到 達 す る が 、 そ の 際 の 薬 物 の 吸 収 性 お よ び 分 布 性 は 個 々 の 薬 物 に よ り 大 き く 異 な り 、 そ の 特 性 に は 細 胞 膜 透 過 性 が 関 与 す る 。 一 般 に 、 薬 物 の 生 体 膜 透 過 過 程 は 、 薬 物 の 物 理 化 学 的 性 質 に 基 づ く 単 純 拡 散 と 輸 送 担 体 （ ト ラ ン ス ポ ー タ ー ） を 介 す る 特 殊 輸 送 に 大 別 さ れ る 。 単 純 拡 散 は 、 細 胞 膜 内 外 の 濃 度 勾 配 に 基 づ く 拡 散 現 象 で あ り 、 薬 物 自 体 の 物 理 化 学 的 性 質 に 大 き く 依 存 す る 。 一 方 、 ト ラ ン ス ポ ー タ ー を 介 す る 特 殊 輸 送 は 、ATP の 加 水 分 解 エ ネ ル ギ ー を 直 接 利 用 し 、薬 物 の 細 胞 外 排 出 に 関与 す る ト ラ ン ス ポ ー タ ー 群（ATP-binding cassette（ ABC）transporters）と 種 々 の イ
オ ン 濃 度 勾 配 や 化 合 物 と の 共 輸 送 、 交 換 輸 送 お よ び 促 進 拡 散 を 担 う ト ラ ン ス ポ ー タ ー
群 （solute carrier（ SLC） transporters） に 大 別 さ れ る 。 ABC ト ラ ン ス ポ ー タ ー は 、
を 明 ら か と す る た め 、 促 進 拡 散 を 行 う 分 子 実 体 の 同 定 及 び そ の 解 析 法 の 開 発 を 目 的 と し 、 本 研 究 で は 促 進 拡 散 型 ト ラ ン ス ポ ー タ ー の 関 与 が 想 定 さ れ る 内 因 性 化 合 物 の 生 体 膜 透 過 に 関 わ る ト ラ ン ス ポ ー タ ー の 機 能 同 定 に 関 す る 検 討 を 行 っ た 。ま た 本 検 討 で は 、 膜 電 位 に よ る 輸 送 現 象 の 影 響 を 除 外 す る た め に 、 電 気 化 学 的 に 中 性 な 内 因 性 物 質 で あ る creatine お よ び creatinine を 被 験 化 合 物 と し て 選 定 し た 。 第 1 章 Creatine に 対 す る 促 進 拡 散 型 ト ラ ン ス ポ ー タ ー と し て の SLC16A12/MCT12 の 機 能 同 定 Creatine は 生 体 内 に お い て 、 腎 臓 、 肝 臓 を 経 て 生 合 成 さ れ 、 血 流 を 経 て 骨 格 筋 や 心 筋 へ 取 り 込 ま れ 、 高 エ ネ ル ギ ー リ ン 酸 結 合 体 の phosphocreatine と な る こ と で ATP の エ ネ ル ギ ー 保 存 に 関 与 す る 。creatine は 、 そ の 分 子 構 造 中 に カ ル ボ キ シ ル 基 お よ び グ ア ニ ジ ド 基 を 有 し 、 生 体 内 pH に お い て 双 性 イ オ ン の 状 態 で 存 在 す る た め 、 単 純 拡 散 に よ る 生 体 膜 透 過 性 は 極 め て 小 さ く 、 そ の 膜 透 過 に は ト ラ ン ス ポ ー タ ー の 関 与 が 必 須 で あ る 。Creatine の 骨 格 筋 へ の 取 り 込 み に 関 わ る ト ラ ン ス ポ ー タ ー と し て 、Na+お よ び Cl-濃 度 勾 配 依 存 的 に
creatine を 輸 送 す る SLC6A8（ CRT1: creatine transporter 1） が 古 く か ら 知 ら れ て
い る 一 方 、 近 年 、 新 た な creatine ト ラ ン ス ポ ー タ ー と し て SLC16A12 （ MCT12: monocarboxylate transporter 12） が 同 定 さ れ て い る 。 MCT12 は 、 Na+、Cl-非 依 存 的 な 輸 送 特 性 を 示 し 、 ま た H+依 存 性 モ ノ カ ル ボ ン 酸 ト ラ ン ス ポ ー タ ー で あ る MCT1-4 と は 異 な り 、 高 pH で 輸 送 活 性 の 増 強 が 認 め ら れ て お り 、 MCT12 に よ る creatine 輸 送 の 詳 細 な メ カ ニ ズ ム は 不 明 で あ る 。 そ こ で 本 研 究 で は 、MCT12 が creatine 輸 送 を 行 う 促 進 拡 散 型 ト ラ ン ス ポ ー タ ー で あ る と 仮 説 を 立 て 、 哺 乳 類 培 養 細 胞 系 に お け る MCT12 の creatine 輸 送 を 評 価 し 、 そ の 輸 送 機 構 を 検 討 し た 。 哺 乳 類 培 養 細 胞 系 に お け る MCT12 の creatine 輸 送 活 性 を 確 認 す る た め 、ヒ ト 胎 児 腎 由 来 細 胞 で あ る HEK293 細 胞 を 用 い 、 MCT12 お よ び MCT12 と 分 子 シ ャ ペ ロ ン を 形 成 し 、MCT12 の 細 胞 膜 安 定 性 を 向 上 さ せ る と 報 告 さ れ て い る CD147 を 一 過 性 に 発 現 さ せ 、[14C]creatine の 取 り 込 み を 評 価 し た 。[14C]creatine の 取 り 込 み は 、CRT1 発 現 細 胞 に お い て 、 顕 著 な 増 加 が 認 め ら れ た 一 方 、MCT12 単 独 発 現 お よ び MCT12、 CD147 共 発 現 細 胞 に お い て は 有 意 な 活 性 変 動 は 認 め ら れ な か っ た（ Fig. 1）。こ の 結 果 は 、先 の ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル 卵 母 細 胞 発 現 系 に お け る MCT12 の creatine 輸 送 活 性 の 報 告 と 矛 盾 す る も の で あ っ た 。 一 般 に 、SLC タ イ プ の ト ラ ン ス ポ ー タ ー は 生 体 膜 を 隔 て た 双 方 向 へ の 輸 送 能 を 有 し 、
そ の 多 く は 基 質 あ る い は 共 輸 送 す る イ オ ン の 濃 度 勾 配 に 対 応 し て 輸 送 方 向 が 決 定 さ れ る 。 し か し 、CRT1 に よ る creatine 輸 送 に お い て は 、 細 胞 外 の Na+お よ び Cl-濃 度 勾 配 を 利 用 し て 細 胞 内 に creatine を 取 り 込 ま せ た 後 、細 胞 外 の Na+を 除 去 し て も 、細 胞 内 か ら 細 胞 外 へ の 逆 方 法 へ の 輸 送 は 起 き な い こ と が 報 告 さ れ て い る 。 そ こ で 、 こ の 特 異 的 な CRT1 の 輸 送 機 能 を 応 用 し 、 MCT12 の creatine 排 出 活 性 を 評 価 し た 。 す な わ ち 、CRT1 に よ り 細 胞 内 へ[14C]creatine を プ レ ロ ー ド し た 後 、 細 胞 外 を NaCl を 含 ま な い uptake buffer（ efflux buffer） に 置 換 し た 後 、既 定 時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト を 行 っ た 後 の 細 胞 内 [14C]creatine 残 存 率 を 評 価 し た 。CRT1 単 独 発 現 お よ び CRT1 + CD147 共 発 現 細 胞 に お い て 、[14C]creatine の 細 胞 内 残 存 率 は 10 分 間 の イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン に よ り 約 71%に 低 下 し た が 、そ の 値 は そ れ 以 降 60 分 ま で ほ ぼ 一 定 に 維 持 さ れ た 。 一 方 、 CRT1 + MCT12 共 発 現 細 胞 お よ び CRT1 + MCT12 + CD147 共 発 現 細 胞 に お け る [14C]creatine 細 胞 内 残 存 率 は 、 時 間 依 存 的 に 減 少 し 、60 分 経 過 後 に は 5％ 未 満 に 低 下 し た（ Fig. 2）。ま た 、プ レ ロ ー ド し た 後 の 細 胞 内[14C]creatine 初 期 濃 度 は 、 CRT1 単 独 発 現 細 胞 と 比 較 し 、 MCT12 共 発 現 細 胞 に お い て 約 76％ に 低 下 す る こ と が 示 さ れ た 。ま た 、こ の 細 胞 外 へ の 排 出 は 細 胞 外 pH、Na+や Cl-に 依 存 し な い こ と が 示 さ れ た 。 こ の よ う な[14C]creatine 排 出 活 性 は 、MCT12 と 構 造 的 類 似 性 を 有 す る MCT1 で は 認 め ら れ ず 、MCT12 特 異 的 な 輸 送 現 象 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 部 位 特 異 的 変 異 法 に よ る 輸 送 解 析 よ り 、MCT12 に よ る creatine 輸 送 活 性 に は 、TMD（ transmembrane domain） に 存 在 す る 65 番 目 と 299 番 目 の Asp お よ び
Fig. 2. The efflux of creatine from HEK293 cells transientl y expressing CRT1 and MCT12. Time course profiles of intracellular [1 4C]creatine levels in HEK293 cells transiently expressing CRT1 alone (open circle), CRT1 and CD147 (closed circle), CRT1 and MCT12 (open triangle), and CRT1 and MCT12 with CD147 (open square) after replacing the uptake buffer for the efflux buffer. ** p < 0.01, * p < 0.05 compared with the value for residual [14C]creatine (% of 0 min) in HEK293 cells expressing CRT1 alone.
Fig. 3. Effect of amino acid substitution in the transmembrane domains (TMD) of MCT12 in MCT12 -mediated creatine efflux in HEK293 cells. **
37 番 目 の Arg が 関 与 す る こ と が 示 唆 さ れ た（ Fig. 3）。MCT12 お よ び CD147 の mRNA は ヒ ト 腎 臓 に お い て 発 現 が 認 め ら れ 、MDCKII 細 胞 に 発 現 し た GFP-MCT12 は CD147 と の 共 発 現 に よ り 側 底 膜 に 局 在 し た こ と か ら 、MCT12 は 腎 臓 に お い て 細 胞 内 creatine の 血 液 側 へ の 排 出 に 関 与 し て い る と 推 測 さ れ た 。 以 上 よ り 、MCT12 に よ る creatine の 輸 送 機 構 は 促 進 拡 散 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 ま た 、 濃 縮 型 ト ラ ン ス ポ ー タ ー と 促 進 拡 散 型 ト ラ ン ス ポ ー タ ー を 共 発 現 さ せ る 本 手 法 は 、 促 進 拡 散 型 ト ラ ン ス ポ ー タ ー の 機 能 同 定 に 有 用 で あ る こ と が 示 さ れ た 。 第 2 章 Creatinine の 生 体 膜 透 過 に 与 え る ト ラ ン ス ポ ー タ ー の 影 響
Creatinine は 、 creatine の 最 終 代 謝 産 物 で あ り 、 主 と し て 骨 格 筋 で creatine お よ
び phoshocreatine か ら 非 酵 素 的 に 産 生 さ れ 、 臨 床 に お い て 血 清 creatinine 値 は 腎 機 能 マ ー カ ー と し て 汎 用 さ れ て い る 。近 年 、Creatinine は 、各 種 ト ラ ン ス ポ ー タ ー（ OCT2、 OAT2、MATE1 お よ び MATE2-K）の 基 質 で あ り 、 腎 臓 に お い て 尿 細 管 分 泌 を 受 け る こ と が 明 ら か と な っ た こ と か ら 、骨 格 筋 内 で 産 生 さ れ た creatinine の 血 液 へ の 移 行 に お い て も ト ラ ン ス ポ ー タ ー の 関 与 が 想 定 さ れ る が 、骨 格 筋 で は 上 述 の creatinine を 輸 送 す る ト ラ ン ス ポ ー タ ー の 発 現 は ほ と ん ど 認 め ら れ ず 、 ま た 、 筋 細 胞 や 骨 格 筋 組 織 に お け る creatinine の 輸 送 現 象 自 体 は 検 出 さ れ て い な い た め 、骨 格 筋 に お け る 細 胞 外 へ creatinine の 排 出 に 関 わ る 分 子 機 構 は 不 明 で あ る 。 そ こ で 、前 章 で 確 立 し た 排 出 輸 送 の 評 価 方 法 を 応 用 し 、促 進 拡 散 型 creatinine ト ラ ン ス ポ ー タ ー の 探 索 を 行 っ た 。細 胞 内 へ creatinine を 濃 縮 的 に 取 り 込 ま せ る ト ラ ン ス ポ ー タ ー と し て OAT2 を 選 択 し 、 各 種 ト ラ ン ス ポ ー タ ー を 共 発 現 し た 細 胞 に お け る creatinine 排 出 活 性 を 評 価 し た 。 OAT2 に よ る [3H]cGMP の 取 り 込 み 活 性 は 、 検 討 し た 各 種 ト ラ ン ス ポ ー タ ー と の 共 発 現 に よ り 有 意 な 影 響 を 受 け な か っ た が 、同 条 件 で[14C]creatinine の 取 り 込 み を 顕 著
に 低 下 さ せ る ト ラ ン ス ポ ー タ ー を 2 種 同 定 し た（ creatinine transporter 1：CreT1 お
よ び creatinine transporter 2:CreT2）。 CreT1 お よ び CreT2 共 発 現 細 胞 に お け る
[3H]cGMP と [14C]creatinine の 取 り 込 み 比 は 阻 害 剤 存 在 下 に お い て 顕 著 に 増 加 し 、
