アデノシン受容体アゴニストYT-146の虚血/再灌流障害に対する心筋保護作用

アデノシン受容体アゴニスト

YT-146 の

虚血

/再灌流障害に対する心筋保護作用

Cardioprotective effects of adenosine receptor agonsit YT-146

against ischemia/reperfusion injury

張 末 期 圧 に 及 ぼ す 効 果 ... 37 2.2.2.4 YT-146 と ア デ ノ シ ン 受 容 体 ア ン タ ゴ ニ ス ト 組 合 せ 投 与 に よ る 再 灌 流 液 中 ク レ ア チ ン キ ナ ー ゼ 活 性 に 及 ぼ す 効 果 ... 38 2.2.3 YT-146 の 心 保 護 作 用 に 対 す る PKC の 関 与 ... 39 2.2.3.1 YT-146 と PKC 阻 害 薬 組 合 せ 投 与 に よ る 冠 動 脈 灌 流 量 へ の 効 果 ... 39 2.2.3.2 YT-146 と PKC 阻 害 薬 組 合 せ 投 与 に よ る 左 心 室 発 生 圧 及 び 左 心 室 拡 張 末 期 圧 へ の 効 果 ... 40 2.2.3.3 YT-146 と PKC 阻 害 薬 組 合 せ 投 与 に よ る 再 灌 流 液 中 の ク レ ア チ ン キ ナ ー ゼ 活 性 へ の 効 果 ... 41 2.3 考 察 ... 42 小 活 ... 45 第 3 章 ラ ッ ト 虚 血 /再 灌 流 心 臓 に お け る YT-146 の ミ ト コ ン ド リ ア 機 能 へ の 効 果 ... 46 3.1 実 験 材 料 及 び 方 法 ... 47 3.1.1 実 験 動 物 ... 47 3.1.2 ラ ッ ト 摘 出 心 Langendorff 灌 流 標 本 の 作 製 ... 47 3.1.3 試 験 プ ロ ト コ ー ル ... 47 3.1.4 心 筋 細 胞 内 Na+ 含 量 の 定 量 ... 48 3.1.5 ミ ト コ ン ド リ ア の 単 離 と Na+ 含 量 の 定 量 ... 48 3.1.6 心 筋 組 織 ATP 及 び ク レ ア チ ン リ ン 酸 の 定 量 ... 48 3.1.7 心 筋 ミ ト コ ン ド リ ア 酸 素 消 費 速 度 の 測 定 ... 49 3.1.8 Skinned fiber 中 の Na+ 濃 度 の 測 定 ... 49 3.1.9 統 計 解 析 ... 50 3.2 結 果 ... 51 3.2.1 YT-146 処 置 の 左 心 室 発 生 圧 、 左 心 室 拡 張 末 期 圧 及 び 灌 流 圧 に 及 ぼ す 効 果 51 3.2.2 YT-146 処 置 の 心 筋 組 織 ATP 及 び ク レ ア チ ン リ ン 酸 含 量 へ の 効 果 ... 52 3.2.4 YT-146 処 置 の 心 筋 内 Na+ 含 量 へ の 効 果 ... 54 3.2.5 YT-146 処 置 の ミ ト コ ン ド リ ア 内 Na+ 含 量 へ の 効 果 ... 55

3.2.6 YT-146 処 置 の Skinned fiber 中 の Na+ 濃 度 の 評 価 ... 56

略 語

本 文 中 で は 以 下 の 略 語 を 用 い る 。

AMI Acute myocardial infarction

bpm Beats/min

CF Coronary flow

CK Creatine kinase

CrP Creatine phosphate

CSC 1,3,7-Trimethyl-8-(3-chlorostyryl)xanthine DBP Diastolic blood pressure

DPCPX 8-Cyclopentyl-1,3-dipropyl xanthine

HR Heart rate

KAT P channel ATP-sensitive K +

channel LAD Left anterior descending artery LVDP Left ventricular developed pressure LVEDP Left ventricular end diastolic pressure LVSP Left ventricular systolic pressure

MPTP Mitochondrial permeability transition pore OCR Oxygen consumption rate

PC Ischemic preconditioning

PCI Percutaneous coronary intervention PTCA

PTCR

Precutaneous transluminal coronary angioplasty Percutaneous transluminal coronary recanalization RMBF Regional myocardial blood flow

SBFI/AM Sodium-binding benzofuran isophthalate -acetoxymethyl ester SBP Systolic blood pressure

NH₂ CH₃(CH₂)₅C N N N N O O H OH OH 酸 素 種 産 生 抑 制 ）27)_{及 び 鎮 静 ・ 催 眠 作 用 （ 中 枢 神 経 系 抑 制 ）}28)_{が あ る 。 ア デ ノ シ ン は} 心 筋 の 虚 血/再 灌 流 障 害 を 軽 減 さ せ る こ と が 知 ら れ 、 各 種 実 験 動 物 を 用 い た 心 筋 虚 血 / 再 灌 流 障 害 モ デ ル で 心 保 護 効 果 が 示 さ れ て い る 29-31)_{。し か し な が ら 、ア デ ノ シ ン の 生} 体 内 で の 半 減 期 は 非 常 に 短 く 32)_{、 虚 血/再 灌 流 障 害 か ら 心 筋 組 織 を 保 護 す る に は 、 高} 用 量 か つ 長 期 間 の ア デ ノ シ ン 投 与 が 要 求 さ れ る 33, 34)_。 YT-146（ Fig.1）は ア デ ノ シ ン の 2 位 に 炭 素 -炭 素 結 合 で 置 換 基 が 導 入 さ れ た 新 た な ア デ ノ シ ン 受 容 体 ア ゴ ニ ス ト で 、in vivo 条 件 下 で ア デ ノ シ ン デ ア ミ ナ ー ゼ へ の 耐 性 を 示 す 長 時 間 作 用 型 薬 物 で あ る 35, 36)_{。そ こ で 、本 研 究 で は 、ア デ ノ シ ン 受 容 体 ア ゴ ニ ス} ト YT-146 の 心 筋 虚 血 /再 灌 流 障 害 に 対 す る 心 筋 保 護 薬 と し て の 可 能 性 に つ い て 検 討 し た 。 本 研 究 で の 各 章 の 概 要 を 以 下 に 示 す 。 第 1 章 YT-146 の in vivo 心 筋 虚 血/再 灌 流 障 害 モ デ ル に 対 す る 心 保 護 作 用 に つ い て 評 価 す る た め 、麻 酔 開 胸 下 の イ ヌ 心 筋 虚 血/再 灌 流 障 害 モ デ ル を 用 い た 。実 験 で は 、AMI 患 者 に 対 す る PCI 施 行 時 の 虚 血 /再 灌 流 障 害 を 抑 制 す る 薬 物 と し て の 臨 床 応 用 を 想 定 し 、YT-146 投 与 は 虚 血 中 あ る い は 再 灌 流 開 始 時 に 行 い 、 そ の 有 効 性 に つ い て 検 討 し た 。 第 2 章 YT-146 の 虚 血 心 筋 保 護 効 果 の 機 序 に つ い て 検 討 す る た め 、Langendorff 灌 流 し た ラ ッ ト 摘 出 心 に 虚 血/再 灌 流 を 行 っ た 。本 実 験 で は 、虚 血 心 筋 保 護 に 関 与 す る ア デ ノ シ ン 受 容 体 サ ブ タ イ プ に つ い て 検 討 し た 。 第 3 章 YT-146 の 虚 血 /再 灌 流 障 害 に 対 す る 心 筋 保 護 の 機 序 を 明 ら か に す る た め 、ミ ト コ ン ド リ ア 機 能 へ の 薬 物 の 効 果 に つ い て 検 討 し た 。

第 1 節 YT-146 急 速 静 脈 内 投 与 に よ る 冠 血 流 量 へ の 影 響 と 、イ ヌ 心 筋 虚 血 /再 灌 流 障 害 モ デ ル に 対 す る 再 灌 流 直 前 急 速 静 脈 内 投 与 に よ る 心 保 護 作 用 の 検 討 YT-146 は 冠 動 脈 内 へ の 投 与 で 冠 血 流 量 を 増 加 さ せ 、 心 筋 虚 血 後 の 心 機 能 改 善 に 有 効 で あ る こ と が 想 定 さ れ る 。 こ の 冠 動 脈 投 与 は 薬 剤 投 与 カ テ ー テ ル を 冠 動 脈 ま で 挿 入 す る 必 要 が あ る 。 本 研 究 で は 、 冠 動 脈 内 投 与 よ り 実 施 し や す い 末 梢 静 脈 投 与 に よ る 心 保 護 に つ い て 検 討 し た 。本 実 験 で は 、イ ヌ 心 筋 虚 血 /再 灌 流 障 害 モ デ ル へ の YT-146 投 与 後 の 冠 血 流 及 び 全 身 血 行 動 態 を 評 価 し た 。 さ ら に 、 心 筋 梗 塞 サ イ ズ の 抑 制 効 果 に つ い て も YT-146 投 与 に よ る 効 果 を 評 価 し た 。 な お 、 本 実 験 で は 、 虚 血 心 筋 保 護 の 比 較 対 照 と し て 虚 血 プ レ コ ン デ ィ シ ョ ニ ン グ 処 置 を 行 っ た 。 虚 血 プ レ コ ン デ ィ シ ョ ニ ン グ 処 置 は 、非 可 逆 的 な 組 織 障 害 を 生 じ な い 短 時 間 の 虚 血 /再 灌 流 に 心 筋 組 織 を 曝 露 さ せ る こ と に よ り 、 そ の 後 の 長 時 間 虚 血 へ の 心 筋 組 織 の 耐 性 を 生 じ さ せ る 操 作 で あ る (Fig.2 参 照 )。虚 血 プ レ コ ン デ ィ シ ョ ニ ン グ 処 置 は 、最 も 強 力 な 虚 血 心 筋 保 護 効 果 を 発 揮 す る 手 段 で あ り 、 YT-146 の 虚 血 /再 灌 流 障 害 に 対 す る 心 筋 保 護 効 果 の 評 価 た め の 有 益 な 指 標 (positive control) と し て 用 い た 。 1.1.1 実 験 材 料 及 び 方 法 1.1.1.1 実 験 動 物 雌 雄 ビ ー グ ル 犬（ 体 重 7.8～ 12.0 kg）は 入 荷 後 か ら 試 験 期 間 を 通 じ て 、温 度 23±3°C、 湿 度 50±20%、 照 明 時 間 12 時 間 （ 7 時 点 灯 、 19 時 消 灯 ） の 条 件 に 設 定 さ れ た ト ー ア エ イ ヨ ー 株 式 会 社 福 島 研 究 所 内 施 設 に て 飼 育 し た 。イ ヌ 用 固 型 飼 料（ DM-2, 株 式 会 社 船 橋 農 場 製 ） を 、 1 日 1 回 300 g で 給 餌 し た 。 ま た 、 自 動 給 水 装 置 を 用 い て 上 水 道 水 を 自 由 に 摂 取 さ せ た 。

ス デ ュ ー サ ー （ DX-360、 OMEDA 製 ） 及 び 歪 圧 力 ア ン プ （ AP-601G、 日 本 光 電 製 ） を 介 し て 血 圧 を 測 定 し た 。ま た 、心 拍 数 は 瞬 時 心 拍 計（ AT-601G、日 本 光 電 製 ）を 用 い 、 血 圧 脈 波 よ り 算 出 し た 。 血 行 動 態 は マ ル チ チ ャ ネ ル レ コ ー ダ ー （ WR3701、 日 本 光 電 製 ） を 用 い 、 連 続 的 に 記 録 さ れ た 。 電 気 メ ス （ SSE2L、 Valleylab 製 ） を 用 い て 第 四 あ る い は 第 五 肋 間 部 位 か ら 開 胸 し 、 左 心 耳 上 部 付 近 の 心 膜 を 切 開 し て 冠 動 脈 左 前 下 行 枝（ LAD）を 露 出 さ せ た 。LAD を 筋 層 よ り 剥 離 し 、 流 量 測 定 プ ロ ー ブ （ FA020S 、 日 本 光 電 製 ） を 介 し て 電 磁 血 流 計 （ MFV-3700、日 本 光 電 製 ）に て 冠 動 脈 灌 流 量 を 測 定 し た 。試 験 で は 、YT-146 の 0.3、 1.0、 3.0、 10 μg/kg を 累 積 投 与 し て 血 行 動 態 に 及 ぼ す 薬 物 の 効 果 を 評 価 し た 。 1.1.1.3 イ ヌ 心 筋 虚 血 /再 灌 流 障 害 モ デ ル 麻 酔 下 の 雌 雄 ビ ー グ ル 犬 を 開 胸 し て LAD を 露 出 さ せ た 。LAD の 第 一 枝 の 遠 位 部 を 筋 層 か ら 剥 離 し 、ナ イ ロ ン 縫 合 糸（ 2-0、日 本 商 事 製 ）を か け 、そ の 両 端 を ポ リ エ チ レ ン チ ュ ー ブ に 通 し て coronary snare を 作 製 し た 。 試 験 で は coronary snare で LAD を 閉 塞 す る こ と に よ り 、 そ の 支 配 領 域 を 虚 血 と し 、 そ の 閉 塞 を 解 く こ と に よ り 再 灌 流 を 行 っ た 。 試 験 中 は 手 術 台 （ 夏 目 製 作 所 製 ） の 保 温 機 能 を 38°C に 設 定 し て 体 温 を 保 っ た 。開 胸 部 位 は 白 熱 電 灯 に て 38°C に 保 ち 、ビ ニ ー ル シ ー ト で 覆 う こ と で 乾 燥 を 防 い だ 。

1.1.1.4 心 筋 組 織 血 流 量 の 評 価

心 筋 組 織 血 流 量 （ regional myocardial blood flow, RMBF） の 測 定 は 水 素 ク リ ア ラ ン ス 法 に て 行 っ た 4 2 )_{。 心 筋 組 織 中 の 水 素 を 検 出 す る 白 金 電 極 （ UHE-201C、 ユ ニ ー ク メ デ} ィ カ ル 製 ） は LAD 支 配 領 域 の 左 心 室 自 由 壁 内 部 （ 深 さ 約 6 mm） に 設 置 し た 。 人 工 呼 吸 器 に よ る 換 気 量 の 5% の 水 素 ガ ス を 吸 気 と 共 に 1 分 間 負 荷 し 、 そ の 心 筋 組 織 に お け る ク リ ア ラ ン ス は 白 金 電 極 を 接 続 し た ポ ー ラ ロ グ ラ フ ィ ー （ MHG-DI、 ユ ニ ー ク メ デ ィ カ ル 製 ） に て 計 測 し た 。 水 素 ク リ ア ラ ン ス 曲 線 を マ ル チ チ ャ ネ ル レ コ ー ダ ー （ WR3701、日 本 光 電 製 ）で 記 録 し 、曲 線 が ピ ー ク 時 の 90% か ら 40% に 下 降 す る 際 に 要 し た 時 間 T（ 90 to 40） を 求 め 、 下 式 を 用 い て 心 筋 組 織 血 流 量 を 算 出 し た 。 心 筋 組 織 血 流 量 （ mL/min/g） ＝ － ln(40/90） / T(90 to 40) 1.1.1.5 心 筋 梗 塞 サ イ ズ の 評 価

の 圧 に て 同 時 注 入 し た 。LAD 閉 塞 に よ り 虚 血 に 陥 っ た 部 位 は 、色 素 灌 流 に よ り 染 色 さ れ な い 。 こ の 領 域 を リ ス ク 領 域 と し た 。 一 方 、 色 素 灌 流 で 染 色 さ れ た 部 位 は 、 虚 血 に 陥 ら な か っ た 部 位 と い う こ と で 非 リ ス ク 領 域 と し た 。 次 に 、 左 右 心 房 と 右 心 室 自 由 壁 を 切 除 し た 左 心 室 か ら 7 枚 の 冠 状 切 片 を 作 製 し た 。 各 切 片 を 37°C に 加 温 し た 1% TTC 溶 液 中 で 15 分 間 イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し 、 組 織 を 染 色 し た 。TTC 非 染 色 領 域 を 心 筋 細 胞 が 虚 血 /再 灌 流 時 に 壊 死 し た 梗 塞 領 域 と し 、TTC 染 色 領 域 を 心 筋 細 胞 が 生 存 し て い る 非 梗 塞 領 域 と し て 識 別 し た 。さ ら に 切 片 を 3% ホ ル ム ア ル デ ヒ ド 溶 液 を 用 い て 一 晩 固 定 し 、 切 片 の 両 面 を 画 像 解 析 装 置 （ QUANTIMET 500+、 Leica 製 ） を 用 い て 各 領 域 の 面 積 を 算 出 し た 。 7 枚 の 切 片 の 表 裏 に お け る 各 領 域 面 積 を 合 計 し て 総 面 積 と し 、 試 験 成 績 を 以 下 の よ う に 求 め た 。 リ ス ク 領 域（ %）＝ リ ス ク 領 域 総 面 積 / 左 心 室 総 面 積（ リ ス ク 領 域 +非 リ ス ク 領 域 の 総 面 積 ） ×100 心 筋 梗 塞 サ イ ズ （ %） ＝ 梗 塞 領 域 総 面 積 / リ ス ク 領 域 総 面 積 ×100 1.1.1.6 血 漿 中 ク レ ア チ ン キ ナ ー ゼ 活 性 の 評 価 Heparin sodium で 処 理 し た 注 射 筒 を 用 い て 、 採 血 用 カ ニ ュ ー レ か ら 約 1.5 mL の 動 脈 血 を 経 時 的 に 採 取 し 、直 ち に 4°C、1000×g で 10 分 間 遠 心 し て 血 漿 を 得 、ク レ ア チ ン キ ナ ー ゼ 活 性 測 定 時 ま で -20°C で 保 存 し た 。 血 漿 中 ク レ ア チ ン キ ナ ー ゼ 活 性 は 市 販 の 測 定 キ ッ ト（ L-type Wako CK、和 光 純 薬 製 ） を 用 い 、 生 化 学 分 析 装 置 （ CL-8000、 島 津 製 作 所 製 ） に て 測 定 し た 。 1.1.1.7 試 験 プ ロ ト コ ー ル

な お 、 下 記 事 象 が 生 じ た 場 合 、 そ の 時 点 で 試 験 終 了 と し 、 結 果 の 解 析 対 象 か ら 除 外 し た 。 （ 1） 心 筋 虚 血 時 に Vf が 生 じ た 場 合 （ 2） 再 灌 流 中 の Vf か ら の 蘇 生 に 、 4 回 以 上 の 除 細 動 器 の 使 用 を 必 要 と し た 場 合 （ 3） 虚 血 60 分 後 の 局 所 心 筋 血 流 量 が 0.1 mL/min/g 以 上 で あ っ た 場 合 1.1.1.8 統 計 処 理 試 験 結 果 は 平 均 値 ±標 準 誤 差 に て 表 し た 。薬 物 投 与 群 と vehicle 群 の 間 に お け る リ ス ク 領 域 と 心 筋 梗 塞 サ イ ズ の 差 は Dunnett の 多 重 比 較 に て 、 血 圧 、 心 拍 数 、 局 所 心 筋 血 流 量 及 び 血 漿 中 ク レ ア チ ン キ ナ ー ゼ 活 性 の 差 は 二 元 配 置 分 散 分 析 と 多 変 量 検 定 に て 検 定 し た 。

1.1.2 結 果 1.1.2.1 YT-146 の 静 脈 内 投 与 後 の 冠 血 流 量 及 び 全 身 血 行 動 態 の 変 化 麻 酔 し た イ ヌ に YT-146 を 0.3、 1.0、 3.0 及 び 10 μg/kg で 累 積 投 与 し た 時 の 冠 血 流 量 、平 均 血 圧 及 び 心 拍 数 の 薬 物 投 与 前 か ら の 変 化 値 を Fig.3 に 示 す 。薬 剤 投 与 前 の 冠 血 流 量 、 平 均 血 圧 及 び 心 拍 数 の 初 期 値 は そ れ ぞ れ 19±2 mL/min、 96±9 mmHg 及 び 137±9 bpm で あ っ た 。 YT-146 投 与 後 に 、 冠 血 流 量 は 薬 物 用 量 依 存 的 な 増 加 を 示 し 、 10 μg/kg で は 投 与 前 か ら 44±12 mL/min 増 加 し た 。 一 方 、 10 μg/kg 投 与 時 に お け る 平 均 血 圧 及 び 心 拍 数 の 最 大 変 化 値 は そ れ ぞ れ -8.0±4.4 mmHg 及 び -6.3±7.5 bpm で あ っ た 。

Fig. 3. Effects of YT-146 on coronary flow (a),mean arterial pressure (b) and heart rate (c) in dogs. Each value represents the mean±S.E.M.of 5 dogs.

a)

_b)

1.1.2.2 イ ヌ 心 筋 虚 血 /再 灌 流 障 害 モ デ ル に 対 す る YT-146 の 再 灌 流 直 前 急 速 静 脈 内 投 与 に よ る 心 筋 保 護 の 検 討 1.1.2.2-1 YT-146 の 血 行 動 態 へ の 作 用 各 実 験 群 に お け る 虚 血 及 び 再 灌 流 時 の 平 均 血 圧 及 び 心 拍 数 を Fig.4 に 示 す 。平 均 血 圧 及 び 心 拍 数 の 初 期 値 は 、 各 群 で そ れ ぞ れ 約 100 mmHg 及 び 160 bpm に 調 整 さ れ 、 い ず れ の 群 間 で も 同 様 の 値 と な っ た 。 YT-146 投 与 群 で は 、 投 与 直 後 に 拡 張 期 血 圧 が 一 過 性 に 低 下 し た も の の 、 再 灌 流 期 間 中 の 測 定 時 点 で の 平 均 血 圧 及 び 心 拍 数 推 移 に 有 意 な 変 動 は 観 察 さ れ な か っ た 。 虚 血 プ レ コ ン デ ィ シ ョ ニ ン グ 群 の 平 均 血 圧 及 び 心 拍 数 も 同 様 に 有 意 な 変 動 は 観 察 さ れ な か っ た 。

Fig. 4. Effects of YT-146 and the ischemic preconditioning on mean arterial pressure (a) and heart rate (b) during ischemia ( –90 to 0 min) and reperfusion (0 to 300 min) in dogs. Each value represents the mean±S.E.M. of 5 dogs. Groups: vehicle ( ● ), ischemic preconditioning (○ ), 3 μg/kg YT-146 (△), and 10 μg/kg YT-146 (□ ). The mean arterial pressure and heart rate were not altered by treatment with YT-146 or the ischemic preconditioning.

a)

1.1.2.2-2 YT-146 の 心 筋 組 織 血 流 量 へ の 作 用 虚 血 前 値 を 100% と し た 場 合 の 虚 血 及 び 再 灌 流 時 の 各 実 験 群 の 心 筋 組 織 血 流 量 (RMBF) を Fig.5 に 示 す 。虚 血 中 の RMBF は 非 常 に 低 い レ ベ ル に な り 、い ず れ の 群 間 で も 同 様 の 値 と な っ た 。 こ れ ら の 値 か ら 、 各 群 で 同 程 度 の 虚 血 条 件 で あ る こ と が 示 さ れ た 。 RMBF の 再 灌 流 後 の 推 移 で は 、 vehicle 群 と YT-146 高 用 量 投 与 群 が ほ ぼ 同 様 で あ り 、 YT-146 低 用 量 投 与 群 は 高 値 で 推 移 す る 傾 向 が 観 察 さ れ た 。 一 方 、 虚 血 プ レ コ ン デ ィ シ ョ ニ ン グ 処 置 群 の RMBF は 、vehicle 群 の そ れ よ り も 低 値 と な っ た 。再 灌 流 300 分 後 の RMBF は 各 群 と も 虚 血 前 の 約 50% ま で 低 下 し た 。

1.1.2.2-3 YT-146 の 再 灌 流 5 分 後 の 心 筋 組 織 血 流 量 に 対 す る 作 用 虚 血 前 値 を 100% と し た 各 実 験 群 の 再 灌 流 5 分 後 の 心 筋 組 織 血 流 量（ RMBF）値 を Fig.6 に 示 す 。RMBF は vehicle 群 で 124±18% に 上 昇 し 、再 灌 流 開 始 直 後 の 反 応 性 充 血 反 応 が 観 察 さ れ た 。 こ の 反 応 は YT-146 低 用 量 及 び 高 用 量 投 与 群 で 増 強 さ れ 、 そ れ ぞ れ 140±20% 及 び 180±25%（ p<0.05） と な っ た 。 一 方 、 虚 血 プ レ コ ン デ ィ シ ョ ニ ン グ 処 置 群 で は 、 反 応 性 充 血 反 応 は 観 察 さ れ な か っ た 。

1.1.2.2-4 YT-146 の 心 筋 梗 塞 サ イ ズ へ の 作 用 各 実 験 群 の リ ス ク 領 域 及 び 心 筋 梗 塞 サ イ ズ を Fig.7 に 示 す 。各 群 の リ ス ク 領 域 は い ず れ も 約 40% と な っ た 。 一 方 、 心 筋 細 胞 が 壊 死 し た 領 域 の 大 き さ を 表 わ す 心 筋 梗 塞 サ イ ズ は 、vehicle 群 で 56.2±2.7% と な っ た の に 対 し 、YT-146 の 低 用 量 及 び 高 用 量 投 与 群 で は そ れ ぞ れ 29.5±8.7% 及 び 20.2±7.0% と な り 、心 筋 梗 塞 巣 の 大 き さ が vehicle 群 の そ れ よ り も 低 値 と な っ た 。 虚 血 プ レ コ ン デ ィ シ ョ ニ ン グ 処 置 群 で も 、 心 筋 梗 塞 巣 は 19.2±6.3% の 低 値 と な り 、 心 筋 梗 塞 サ イ ズ が 縮 小 さ れ た 。

Fig. 7. Effects of YT-146 and ischemic preconditioning on ischemia/reperfusion -induced myocardial infarct size in dogs (a, Risk/LV; b, Inf/Risk , c, Cross sectional images of left ventricular from vehicle an d YT-146-H treated group). Each value represents the mean±S.E.M. of 5 dogs. Risk/LV, ratio of risk area vs. left ventricle; Inf/Risk, ratio of infarct size vs. risk area. Groups: vehicle, ischemic preconditioning (P.C.), 3 μg/kg YT-146 (YT-146-L), and 10 μg/kg YT-146 (YT-146-H). Infarct size of the ischemic preconditioned and YT-146-treated hearts was significantly smaller than that of the heart without any treatment. * p < 0.05 vs. vehicle group.

c)

1.1.2.2-5 YT-146 の 血 漿 中 ク レ ア チ ン キ ナ ー ゼ 活 性 へ の 作 用 各 実 験 群 に お け る 試 験 期 間 中 の 血 漿 中 の ク レ ア チ ン キ ナ ー ゼ (CK) 活 性 を Fig.8 に 示 す 。血 漿 CK 活 性 は 再 灌 流 5 分 後 か ら 60 分 後 に か け て 上 昇 し 、再 灌 流 120 分 後 か ら 180 分 後 に 最 大 値 に 達 し た 。Vehicle 群 の 血 漿 中 CK 活 性 は 17110±501 IU/mL に 達 し た 。一 方 、YT-146 低 用 量 及 び 高 用 量 投 与 群 の CK 活 性 最 大 値 は 9385±2338 及 び 5981±1612 IU/mL と な り 、血 漿 CK 活 性 の 低 下 が 観 察 さ れ た 。虚 血 プ レ コ ン デ ィ シ ョ ニ ン グ 処 置 群 で も 、 再 灌 流 時 の 最 大 値 が 5095±2364I IU/mL と な り 、 血 漿 CK 活 性 が 低 下 し た 。

1.2.1.6 統 計 処 理

統 計 処 理 は 前 節 と 同 様 に 行 っ た 。

1.2.2 結 果 1.2.2.1 YT-146 の 持 続 投 与 1.2.2.1-1 YT-146 の 血 行 動 態 へ の 効 果 各 実 験 群 に お け る 虚 血 及 び 再 灌 流 時 の 平 均 血 圧 及 び 心 拍 数 を Fig.10 に 示 す 。 平 均 血 圧 と 心 拍 数 の 初 期 値 は 各 群 と も 約 90 mmHg 及 び 160 bpm に 調 整 さ れ 、そ れ ぞ れ の 群 間 に 差 は 無 か っ た 。YT-146 を 0.3 μg/kg/min で 持 続 静 脈 内 投 与 さ れ た 動 物 で は 、投 与 期 間 中 に 平 均 血 圧 が 低 下 傾 向 に あ っ た も の の 、 投 与 前 値 と 比 較 し て も 有 意 な 変 動 に は な ら な か っ た 。

Fig. 10. Effects of YT-146 on mean arterial pressure (a) and heart rate (b) during ischemia (–90 to 0 min) and reperfusion (0 to 300 min) in dogs. Each value represents the mean±S.E.M. of 3-5 dogs. Groups: vehicle (● ), YT-146 0.1 μg/kg/min (75 min infusion, ○ ), YT-146 0.3 μg/kg/min (75 min infusion, △). The mean arterial pressure and heart rate were not significantly altered by vehicle or YT-146 treatment.

a)

1.2.2.1-2 YT-146 の 心 筋 組 織 血 流 量 へ の 効 果

虚 血 前 値 を 100% と し た 虚 血 / 再 灌 流 時 の 各 群 の 心 筋 組 織 血 流 量 (RMBF) を Fig.11 に 示 す 。 虚 血 中 の RMBF は 非 常 に 低 い 値 と な り 、 各 群 間 に 差 は 無 か っ た 。 再 灌 流 開 始 直 後 （ 5 分 後 ） の RMBF は YT-146 0.1 μg/kg/min 投 与 群 及 び YT-146 0.3 μg/kg/min 投 与 群 で い ず れ も 薬 物 未 処 置 群 と 比 較 し て 同 等 あ る い は そ れ 以 下 と な り 、 本 実 験 条 件 下 で の YT-146 に よ る RMBF 量 の 増 加 は 観 察 さ れ な か っ た 。

1.2.2.1-3 YT-146 の 心 筋 梗 塞 サ イ ズ へ の 効 果

各 群 の 心 筋 虚 血 に よ る リ ス ク 領 域 と 心 筋 梗 塞 サ イ ズ を Fig.12 に 示 す 。 各 群 の 心 筋 虚 血 に よ る リ ス ク 領 域 の 大 き さ に 差 は 認 め ら れ な か っ た 。

心 筋 梗 塞 サ イ ズ は vehicle 群 で は 54.9±6.6% と な っ た 。一 方 、YT-146 0.1 μg/kg/min 投 与 群 の 心 筋 梗 塞 サ イ ズ は 、45.7±7.5% と 縮 小 傾 向 に あ っ た 。YT-146 0.3 μg/kg/min 投 与 群 の 心 筋 梗 塞 サ イ ズ は 35.7±4.6% ま で 縮 小 し た 。

Fig. 12. Effects of YT-146 on ischemia/reperfusion -induced myocardial infarct size in dogs (a, Risk/LV; b, Inf/Risk). Each value represents the mean±S.E.M. of 3-5 dogs. Risk/LV, ratio of risk area vs. left ventricle; Inf/Risk, ratio of infarct size vs. risk area. Groups: vehicle, YT-146 0.1 μg/kg/min (75 min infusion), YT-146 0.3 μg/kg/min (75 min infusion) . Infarct size of YT-146 0.3 μg/kg/min-treated hearts was significantly smaller than that of the vehicle treated heart. * p < 0.05 vs. vehicle group.

a)

_b)

1.2.2.1-4 YT-146 の 血 漿 中 ク レ ア チ ン キ ナ ー ゼ へ の 効 果

各 群 に お け る 再 灌 流 時 の 血 漿 ク レ ア チ ン キ ナ ー ゼ (CK) 活 性 を Fig.13 に 示 す 。CK 活 性 は 再 灌 流 5 分 後 か ら 60 分 後 に か け て 急 激 に 上 昇 し 、再 灌 流 120 分 後 か ら 180 分 後 に ほ ぼ 最 大 値 に 達 し た 。 最 大 CK 活 性 は 、 vehicle 群 で は 11335±2857 IU/mL と な っ た 。 YT-146 0.1 μg/kg/min 投 与 群 の 最 大 CK 活 性 は 17792±4610 IU/mL と な り 、 YT-146 処 置 は 心 筋 組 織 か ら の CK 逸 脱 に は 影 響 し な か っ た 。 一 方 、 YT-146 0.3 μg/kg/min 投 与 群 で の 最 大 CK 活 性 は 5700±1398 IU/mL と な り 、再 灌 流 時 の 血 漿 CK 活 性 を 低 下 さ せ た 。

Fig. 13. Effects of YT-146 on plasma creatine kinase activity in dogs at different periods of perfusion. Ischemia was induced at –90 min and reperfusion started at 0 min. Blood samples were collected at the indicated time points. Creatine kinase activity was measured by use of a commercially available assay kit. Each value represents the mean±S.E.M. of 3-5 dogs. Groups: vehicle (● ), YT-146 0.1 μg/kg/min (75 min infusion, ○ ), YT-146 0.3 μg/kg/min (75 min infusion, △) The amount of CK released after reperfusion was significantly reduced by treatment with YT-146 0.3 μg/kg/min. * p < 0.05 vs. vehicle group.

1.2.2.2 YT-146 の 再 灌 流 直 前 の 急 速 静 脈 内 投 与 +再 灌 流 時 の 持 続 静 脈 内 投 与 1.2.2.2-1 YT-146 の 血 行 動 態 へ の 効 果 各 実 験 群 に お け る 、 虚 血 /再 灌 流 時 の 平 均 血 圧 及 び 心 拍 数 を Fig.14 に 示 す 。 平 均 血 圧 と 心 拍 数 の 初 期 値 は 各 群 と も 約 90 mmHg 及 び 160 bpm で 、各 群 間 で 同 様 の 値 と な っ た 。 YT-146 の 投 与 の 有 無 に 関 わ ら ず 実 験 期 間 中 の 平 均 血 圧 及 び 心 拍 数 に 変 動 は み ら れ な か っ た 。

Fig. 14. Effects of YT-146 on mean arterial pressure (a) and heart rate (b) during ischemia (–90 to 0 min) and reperfusion (0 to 300 min) in dogs. Each value represents the mean±S.E.M. of 5 dogs. Groups: vehicle ( ● ), YT-146 3μg/kg（ bolus）+ 0.3μg/kg/min（ 60 min infusion,○ ). The mean arterial pressure an d heart rate were not altered by treatment with vehicle or YT-146.

a)

1.2.2.2-2 YT-146 の 心 筋 組 織 血 流 量 へ の 効 果 虚 血 前 値 を 100% と し た 虚 血 /再 灌 流 時 の 各 実 験 群 の 心 筋 組 織 血 流 量 (RMBF) を Fig.15 に 示 す 。虚 血 中 の RMBF の 平 均 値 は 0～ 0.07 mL/min/g の 極 め て 低 い 値 と な り 、 各 群 間 で 同 様 の 値 と な っ た こ と か ら 、 い ず れ も 同 程 度 の 虚 血 状 態 に 陥 っ て い る こ と が 示 さ れ た 。再 灌 流 開 始 5 分 後 の RMBF は 、vehicle 群 で は 虚 血 前 値 よ り 低 値 と な っ た 。 一 方 、 YT-146 投 与 群 の そ れ は 126.7±16.3% ま で 増 加 し 、 YT-146 の 急 速 静 脈 内 投 与 に よ る RMBF の 上 昇 が 観 察 さ れ た 。

Fig. 15. Effects of YT-146 and ischemic preconditioning on regional myocardial blood flow in dogs. Blood flow at the territory perfused by t he left anterior descending coronary artery before and during ischemia ( –90 to 0 min) and after reperfusion (0 to 300 min) was measured by the hydrogen clearance method. Each value represents the mean±S.E.M. of 5 dogs. Groups: vehicle ( ● ), YT-146 3μg/kg（ bolus）+ 0.3μg/kg/min（ 60 min infusion,○ ). Five min after reperfusion, regional myocardial blood flow of YT-146 treated heart was significantly higher than that of the vehicle treated heart. * p < 0.05 vs. vehicle group.

1.2.2.2-3 YT-146 の 心 筋 梗 塞 サ イ ズ へ の 効 果

各 実 験 群 の 心 筋 虚 血 リ ス ク 領 域 と 心 筋 梗 塞 サ イ ズ を Fig.16 に 示 す 。 各 群 の リ ス ク 領 域 の 大 き さ は 、 い ず れ も 同 様 の 値 と な っ た 。 一 方 、 vehicle 群 の 心 筋 梗 塞 サ イ ズ は 58.8±5.9% で あ っ た の に 対 し 、 YT-146 投 与 群 の そ れ で は 26.2±5.6% の 低 値 と な り 、 薬 物 に よ る 心 保 護 作 用 が 認 め ら れ た 。

Fig. 16. Effects of YT-146 on ischemia/reperfusion -induced myocardial infarct size in dogs (a, Risk/LV; b, Inf/Risk). Each value represents the mean±S.E.M. of 5 dogs. Risk/LV, ratio of risk area vs. left ventricle; Inf/Risk, ratio of infarct size vs. risk area. Groups: vehicle, YT-146 3μg/kg（ bolus） + 0.3μg/kg/min（ 60 min infusion). Infarct size of YT-146-treated hearts was significantly smaller than that of the vehicle treated heart. * p < 0.05 vs. vehicle group.

a)

b)

1.2.2.2-4 YT-146 の 血 漿 中 ク レ ア チ ン キ ナ ー ゼ 活 性 へ の 効 果

各 実 験 群 に お け る 再 灌 流 時 の 血 漿 中 ク レ ア チ ン キ ナ ー ゼ (CK) 活 性 を Fig.17 に 示 す 。 血 漿 中 の CK 活 性 は 再 灌 流 開 始 5 分 後 か ら 60 分 後 に か け て 急 激 に 上 昇 し 、 vehicle 群 で の 最 大 活 性 は 12522±2776 IU/mL に 達 し た 。 一 方 、 YT-146 投 与 群 の そ れ は 、 4409±1278 IU/mL に な り 、 YT-146 に よ る 血 漿 中 の CK 活 性 低 下 が 観 察 さ れ た 。

Fig. 17. Effects of YT-146 on plasma creatine kinase activity in dogs at different periods of perfusion. Ischemia was induced at –90 min and reperfusion started at 0 min. Blood samples were collected at the indicated time points. Creatine kinase activity was measured by use of a commercially available assay kit. Each value represents the mean±S.E.M. of 5 dogs. Groups: vehicle ( ● ), YT-146 3μg/kg（ bolus） + 0.3μg/kg/min（ 60 min infusion,○ ). The amount of CK released after reperfusion was significantly reduced by treatment with YT-146. * p < 0.05 vs. vehicle group.

*

*

第 2 章 ラ ッ ト 摘 出 心 Langendorff 灌 流 標 本 を 用 い た YT-146 の 心 筋 直 接 的 な 保 護 作 用 の 検 討

2.1 実 験 材 料 及 び 方 法 2.1.1 実 験 動 物 雄 性 Sprague-Dawley ラ ッ ト （ 体 重 250～ 300 g） を 用 い た 。 ラ ッ ト は 入 荷 後 よ り 試 験 期 間 を 通 じ て 、温 度 23±3°C、湿 度 30～ 80%、照 明 時 間 12 時 間（ 7 時 点 灯 、19 時 消 灯 ） の 条 件 に 設 定 さ れ た ト ー ア エ イ ヨ ー 株 式 会 社 福 島 研 究 所 内 施 設 に て 飼 育 し た 。 給 餌 は 固 型 飼 料（ F-2, 株 式 会 社 船 橋 農 場 製 ）を 自 由 摂 取 と し た 。ま た 、自 動 給 水 装 置 を 用 い て 上 水 道 水 を 自 由 に 摂 取 さ せ た 。

本 研 究 に お け る実 験 動 物 の 管 理 と 使 用 に 関 し て は 、 米 国 National Research Council の Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington D.C.,1996)に 従 っ た 。本 研 究 は ト ー ア エ イ ヨ ー 株 式 会 社 動 物 実 験 委 員 会 の 審 査 及 び 承

認 を 経 て 行 っ た 。

2.1.2 ラ ッ ト 摘 出 心 Langendorff 灌 流 標 本 の 作 製

ラ ッ ト を sodium pentobarbital (30 mg/kg ） 腹 腔 内 投 与 で 麻 酔 し 、 下 肢 静 脈 か ら heparin sodium を (1000 IU/kg iv） を 静 注 し た 。 十 分 に 麻 酔 が 導 入 さ れ て い る こ と を 確 認 し た 後 、速 や か に 心 臓 を 摘 出 し 、Langendorff 灌 流 装 置 （ Technical Supply 製 ） に 装 着 し た 。 灌 流 液 に は Krebs-Henseleit 液 （ NaCl 120 mM, KCl 4.7 mM, CaCl2 1.25 mM,

MgSO4 1.2 mM, KH2PO4 1.2 mM, NaHCO3 25 mM, glucose 11mM）を 用 い 、70±5 mmHg の

定 圧 下 で 灌 流 を 行 っ た 。 灌 流 液 は 37°C に 加 温 し 、 混 合 ガ ス （ 95%： O2、 5%： CO2） を 通 気 さ せ て 酸 素 分 圧 を 600 mmHg に 保 っ た 。 Langendorff 灌 流 装 置 の 流 路 に 設 置 し た 流 量 測 定 プ ロ ー ブ （ FF-030T、 日 本 光 電 製 ） を 介 し 、 電 磁 血 流 計 （ MFV-3700、 日 本 光 電 製 ）に て 冠 動 脈 灌 流 量（ coronary flow, CF）を 測 定 し た 。左 心 房 か ら 左 心 室 に 生 理 食 塩 液 を 満 た し た ラ テ ッ ク ス バ ル ー ン （ LB2.0、 テ ス コ 製 ） を 挿 入 し 、 圧 ト ラ ン ス デ ュ ー サ ー （ DX-360、 Ohmeda 製 ） を 介 し て 歪 圧 力 ア ン プ （ AP-601G、 日 本 光 電 製 ） に て 左 心 室 内 圧 を 測 定 し た 。 心 拍 数 は 瞬 時 心 拍 計 （ AT-600G、 日 本 光 電 製 ） を 用 い 、 左 室 内 圧 波 よ り 算 出 し た 。 ま た 、 左 室 拡 張 末 期 圧 は 5～ 10 mmHg の 初 期 値 と な る よ う 、 ラ テ ッ ク ス バ ル ー ン の 膨 ら み に よ り 調 整 し た 。 左 心 房 に 電 極 を 設 置 し 、 電 気 刺 激 装 置 （ SEN-7103、 日 本 光 電 製 ） を 用 い て 150 bpm に て 心 臓 を ペ ー シ ン グ し た 。 血 行 動 態 及 び CF は マ ル チ チ ャ ネ ル レ コ ー ダ ー（ WR3701、グ ラ フ テ ッ ク 製 ）に 連 続 的 に 記 録 し た 。 左 心 室 発 生 圧 （ left ventricular developed pressure, LVDP） は 左 心 室 収 縮 期 圧 （ left ventricular systolic pressure, LVSP）か ら 、左 心 室 拡 張 末 期 圧（ left ventricular end diastolic pressure, LVEDP） を 差 し 引 く こ と に よ り 算 出 し た 。

2.1.3 灌 流 液 中 ク レ ア チ ン キ ナ ー ゼ 活 性 の 評 価

性 を 経 時 的 に 測 定 し 、 60 分 間 の 再 灌 流 に お け る 曲 線 下 面 積 （ AUC） を 算 出 し 、 心 臓 か ら 逸 脱 し た 全 酵 素 活 性 と し た 。 2.1.4 試 験 プ ロ ト コ ー ル 2.1.4.1 摘 出 灌 流 心 臓 へ の YT-146 投 与 及 び 虚 血 /再 灌 流 Fig.18 に 試 験 プ ロ ト コ ー ル の 概 略 を 示 す 。 20 分 間 の 通 常 灌 流 に よ る 心 機 能 安 定 化 の 後 、Langendorff 灌 流 装 置 の 流 路 に 設 置 し た 活 栓 よ り 、持 続 注 入 器（ Model-22、Harvard 製 ）を 用 い て 、溶 媒 あ る い は YT-146（ 終 濃 度 0.03、0.1、0.3 μM）を 冠 動 脈 灌 流 量 の 1/100 の 液 量 で 灌 流 液 に 添 加 し た 。薬 剤 を 含 む 灌 流 液 で 10 分 間 灌 流 し た 後 、30 分 間 心 臓 へ の 灌 流 液 供 給 を 完 全 に 停 止 す る こ と に よ り 、 心 筋 虚 血 を 作 製 し た 。 そ の 後 、 灌 流 液 の 供 給 を 再 開 さ せ る こ と に よ り 、 60 分 間 の 再 灌 流 を 行 っ た 。 2.1.4.2 YT-146 の 虚 血 心 筋 保 護 作 用 に 寄 与 す る ア デ ノ シ ン 受 容 体 サ ブ タ イ プ の 関 与 虚 血 前 20 分 間 の 通 常 灌 流 に よ る 心 機 能 安 定 化 の 後 、上 記 経 路 を 介 し て 、YT-146（ 終 濃 度 0.3 μM）と 、各 種 ア デ ノ シ ン 受 容 体 サ ブ タ イ プ の ア ン タ ゴ ニ ス ト と の 組 合 せ 処 置 を 行 っ た 。 ア デ ノ シ ン A1 受 容 体 ア ン タ ゴ ニ ス ト 8-cyclopentyl-1,3-dipropyl xanthine （ DPCPX ） は 、 0.1 μM 、 ア デ ノ シ ン A2 A 受 容 体 ア ン タ ゴ ニ ス ト 1,3,7-trimethyl-8-(3-chlorostyryl)xanthine （ CSC） は 、 1.0 μM、 ア デ ノ シ ン A2 B 受 容 体 ア ン タ ゴ ニ ス ト alloxazine は 、 0.3 μM 及 び ア デ ノ シ ン A3 受 容 体 ア ン タ ゴ ニ ス ト MRS-1191 は 1.0 μM を 灌 流 液 に 添 加 し た 。こ れ ら 薬 物 を 含 む 灌 流 液 で 10 分 間 摘 出 心 臓 を 灌 流 し た 後 、 上 記 と 同 様 に 虚 血 /再 灌 流 を 行 っ た 。 2.1.4.3 YT-146 の 虚 血 心 筋 保 護 作 用 に 対 す る PKC の 関 与 虚 血 前 20 分 間 の 通 常 灌 流 に よ る 心 機 能 安 定 化 の 後 、 上 記 経 路 を 介 し て 、 YT-146 （0.3 μM）及 び PKC 阻 害 薬 chelerythrine（ 1.0 μM）を 冠 動 脈 灌 流 量 の 1/100 の 液 量 で 灌 流 液 に 添 加 し た 。 薬 物 を 含 む 灌 流 液 で 10 分 間 灌 流 し た 後 、上 記 と 同 様 に 虚 血 /再 灌 流 を 行 っ た 。 2.1.5 統 計 処 理

Perfusion Treatment Ischemia reperfusion

Perfusion Treatment Ischemia reperfusion

2.2 結 果

2.2.1 YT-146 の 虚 血 前 投 与 に よ る 心 筋 直 接 的 な 保 護 作 用 の 検 討 2.2.1.1 YT-146 に よ る 冠 動 脈 灌 流 量 へ の 影 響

2.2.1.2 YT-146 に よ る 再 灌 流 後 の 左 心 室 発 生 圧 に 及 ぼ す 効 果 虚 血 /再 灌 流 時 、灌 流 心 臓 の 心 収 縮 力 の 指 標 で あ る 左 心 室 発 生 圧（ LVDP） を Fig.19 に 示 す 。 虚 血 前 の 各 実 験 群 の LVDP は 144.7～ 152.2 mmHg と な り 、 い ず れ の 実 験 群 間 で も 同 様 の 心 収 縮 力 で あ っ た 。 つ ま り 、 YT-146 が 正 常 灌 流 の 心 収 縮 力 に 直 接 影 響 す る こ と は 無 い こ と が 示 さ れ た 。 虚 血 の 開 始 後 3 分 以 内 に 、 LVEP は 0 mmHg に 低 下 し 、虚 血 期 間 中 は 0 mmHg（ 拍 動 停 止 状 態 ）で 推 移 し た 。再 灌 流 開 始 後 、vehicle 群 の LVDP は 徐 々 に 回 復 し 、再 灌 流 終 了 時 の そ れ は 虚 血 前 値 の 約 30% と な っ た 。一 方 、 0.1 及 び 0.3 μM YT-146 虚 血 前 投 与 に よ り 、 再 灌 流 終 了 後 の LVDP 回 復 は 促 進 さ れ 、 そ れ ぞ れ 虚 血 前 値 の 約 40% 及 び 60% ま で 回 復 し た 。

2.2.1.3 YT-146 に よ る 虚 血 /再 灌 流 時 の 左 心 室 拡 張 末 期 圧 に 及 ぼ す 効 果

灌 流 心 臓 の 虚 血 /再 灌 流 時 に お け る 左 心 室 拡 張 末 期 圧 （ LVEDP） を Fig.20 に 示 す 。 Vehicle 群 の LVEDP 値 は 虚 血 開 始 後 上 昇 し た 。 LVEDP は 、 再 灌 流 開 始 直 後 に さ ら に 上 昇 し 、 そ の 5 分 後 に 最 大 値 （ 135±5.7 mmHg） に 達 し た 。 LVEDP は 再 灌 流 時 間 の 経 過 と と も に 斬 減 し た が 、 再 灌 流 終 了 時 で も 82.3±1.7 mmHg の 高 値 と な り 、 再 灌 流 心 臓 で の 拡 張 障 害 の 誘 発 が 示 さ れ た 。 一 方 、 0.1 及 び 0.3 μM YT-146 投 与 群 で は 虚 血 / 再 灌 流 時 の LVEDP 上 昇 が vehicle 群 の そ れ よ り も 抑 制 さ れ 、 再 灌 流 5 分 後 に は そ れ ぞ れ 101.0±6.1 及 び 98.2±10.8 mmHg を 、 再 灌 流 終 了 時 に 値 は そ れ ぞ れ 53.5±4.8 及 び 51.7±4.4 mmHg の 低 値 と な り 、 再 灌 流 時 の 心 筋 拡 張 能 の 改 善 が 示 さ れ た 。

2.2.1.4 YT-146 に よ る 再 灌 流 心 臓 か ら 灌 流 液 中 へ 遊 離 し た ク レ ア チ ン キ ナ ー ゼ 活 性 へ の 効 果 再 灌 流 心 臓 か ら 灌 流 液 へ 流 出 し た 全 ク レ ア チ ン キ ナ ー ゼ （ CK） 活 性 を Fig.21 に 示 す 。Vehicle 群 の 灌 流 液 中 の CK 活 性 は 15.9±1.8 ×104 IU で あ っ た 。YT-146 処 置 群 で は 、CK 活 性 が 薬 物 投 与 量 に 応 じ て 低 下 し 、0.3 μM 投 与 群 で は vehicle 群 の そ れ の 約 50% と な っ た 。

2.2.2.2 YT-146 と ア デ ノ シ ン 受 容 体 ア ン タ ゴ ニ ス ト 組 合 せ 投 与 に よ る 左 心 室 発 生 圧 に 及 ぼ す 効 果 ア デ ノ シ ン A1、 A2 A、 A2 B 及 び A3 受 容 体 の ア ン タ ゴ ニ ス ト と YT-146 の 組 合 せ 投 与 し た 時 の 虚 血 /再 灌 流 時 に お け る 左 心 室 発 生 圧 （ LVDP） を Fig.22 に 示 す 。 CSC、 alloxazine あ る い は MRS-1191 の 同 時 投 与 は YT-146 に よ る 再 灌 流 終 了 時 の LVDP 回 復 促 進 に 影 響 を 与 え ず 、そ れ ぞ れ 虚 血 前 値 の 55.9±5.1、52.1±1.9 及 び 47.5±1.7% と な っ た 。一 方 、DPCPX と の 組 合 せ 投 与 で は 、YT-146 に よ る 再 灌 流 時 の LVDP 回 復 は 打 ち 消 さ れ 、 vehicle 群 の そ れ と 同 様 の 31.7±4.6% と な っ た 。

Fig. 22. Time course of change in LVDP of the 30 -min ischemic/60 -min reperfusion. Data are shown for vehicle treated control hearts ( ● ), hearts treated before ischemia with YT-146 0.3 μM (○ ), YT-146 0.3 μM + A1 AR antagonist DPCPX 0.1 μM (▲), YT-146 0.3 μM + A2A

AR antagonist CSC 1.0 μM (△), YT-146 0.3 μM + A2 B AR antagonist alloxazine 0.3 μM ( □ )

and YT-146 0.3 μM + A3 AR antagonist MRS1191 1.0 μM ( ◇). Each value represents the

2.2.2.3 YT-146 と ア デ ノ シ ン 受 容 体 ア ン タ ゴ ニ ス ト 組 合 せ 投 与 に よ る 左 心 室 拡 張 末 期 圧 に 及 ぼ す 効 果

ア デ ノ シ ン A1、 A2 A、 A2 B 及 び A3 受 容 体 ア ン タ ゴ ニ ス ト を YT-146 の 組 合 せ 投 与

し た 時 の 左 心 室 拡 張 末 期 圧 （ LVEDP） を Fig.23 に 示 す 。 CSC 、 alloxazine あ る い は MRS-1191 と の 組 合 せ 投 与 は YT-146 に よ る 再 灌 流 時 の LVEDP へ の 効 果 に 影 響 を 与 え な か っ た 。 一 方 、 DPCPX と の 組 合 せ 投 与 を 行 う と 、 YT-146 の LVEDP 上 昇 を 軽 減 さ せ る 効 果 は 消 失 し た 。

Fig. 23. Time course of change in LVEDP of the 30 -min ischemic/60 -min reperfusion. Data are shown for vehicle treated control hearts ( ● ), hearts treated before ischemia with YT-146 0.3 μM (○ ), YT-146 0.3 μM + A1 AR antagonist DPCPX 0.1 μM (▲), YT-146 0.3 μM + A2A

AR antagonist CSC 1.0 μM (△), YT-146 0.3 μM + A2 B AR antagonist alloxazine 0.3 μM ( □ )

and YT-146 0.3 μM + A3 AR antagonist MRS1191 1.0 μM (◇). Each value represents the

2.2.2.4 YT-146 と ア デ ノ シ ン 受 容 体 ア ン タ ゴ ニ ス ト 組 合 せ 投 与 に よ る 再 灌 流 液 中 ク レ ア チ ン キ ナ ー ゼ 活 性 に 及 ぼ す 効 果 再 灌 流 心 臓 か ら 流 出 し た ク レ ア チ ン キ ナ ー ゼ （ CK） 活 性 を Fig.24 に 示 す 。 CSC、 alloxazine あ る い は MRS-1191 と の 組 合 せ 投 与 は YT-146 に よ る 再 灌 流 時 に 心 臓 か ら 灌 流 液 中 に 流 出 し た CK 活 性 の 低 下 に 影 響 し な か っ た 。 一 方 、 DPCPX と の 同 時 投 与 で は YT-146 処 置 を 行 っ た に も 関 わ ら ず 、 vehicle 群 の そ れ と 同 様 の CK 活 性 と な っ た 。

Fig. 24. AUC of creatine kinase cal iculated from the activity and amount of coronary effluent during 60-min of reperfusion. Hearts were either vehicle treated control or treated with YT-146 0.3 μM, YT-146 0.3 μM + A1 AR antagonist DPCPX 0.1 μM, YT-146 0.3 μM +

A2 A AR antagonist CSC 1.0 μM, YT-146 0.3 μM + A2 B AR antagonist alloxazine 0.3 μM,

YT-146 0.3 μM + A3 AR antagonist MRS1191 1.0 μM. Each value represents the

2.2.3 YT-146 の 心 保 護 作 用 に 対 す る PKC の 関 与

2.2.3.1 YT-146 と PKC 阻 害 薬 組 合 せ 投 与 に よ る 冠 動 脈 灌 流 量 へ の 効 果

2.2.3.2 YT-146 と PKC 阻 害 薬 組 合 せ 投 与 に よ る 左 心 室 発 生 圧 及 び 左 心 室 拡 張 末 期 圧 へ の 効 果

Chelerythrine と YT-146 を 組 合 せ 投 与 し た 時 の 虚 血 /再 灌 流 時 に お け る 左 心 室 発 生 圧（ LVDP）を Fig.26 (a) に 、左 心 室 拡 張 末 期 圧（ LVEDP）を Fig.26 (b) に 示 す 。YT-146 に よ る 再 灌 流 後 の LVDP 回 復 促 進 効 果 は chelerythrine の 同 時 投 与 に よ り 消 失 し た 。 YT-146 に よ る 再 灌 流 時 の LVEDP 上 昇 抑 制 効 果 も chelerythrine と の 組 合 せ 投 与 で 消 失 傾 向 を 示 し た 。

Fig. 26. Time course of change in LVDP ( a) and LVEDP (b) of the 30-min ischemic/60-min reperfusion. Data are shown for vehic le treated control hearts ( ● ), hearts treated before ischemia with YT-146 0.3 μM (○ ), YT-146 0.3 μM + PKC inhibitor chelerythrine 1.0 μM (■ ). Each value represents the mean±S.E.M. of 6 experiments. *, significantly different from the control group (p<0.05) . #, significantly different from the YT-146 alone treated group (p<0.05).

a)

2.2.3.3 YT-146 と PKC 阻 害 薬 組 合 せ 投 与 に よ る 再 灌 流 液 中 の ク レ ア チ ン キ ナ ー ゼ 活 性 へ の 効 果

再 灌 流 心 臓 か ら 灌 流 液 中 に 流 出 し た ク レ ア チ ン キ ナ ー ゼ （ CK） 活 性 を Fig.27 に 示 す 。 YT-146 に よ る CK 活 性 の 低 下 は chelerythrine と の 組 合 せ 投 与 に よ り 消 失 し 、 vehicle 群 の そ れ と 同 様 の 値 と な っ た 。

2.3 考 察 本 章 で は 、血 液 成 分 を 含 ま な い 塩 類 緩 衝 液（ Krebs-Henseleit 緩 衝 液 ）を 用 い て ラ ッ ト 摘 出 心 臓 を 灌 流 し 、 虚 血 /再 灌 流 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 YT-146 処 置 に よ り 、 薬 物 の 用 量 依 存 的 に 再 灌 流 時 の 心 機 能 回 復 が 促 進 さ れ る こ と を 見 出 し た 。同 時 に 、YT-146 は 再 灌 流 後 の LVEDP 上 昇 を 抑 制 し 、 か つ 灌 流 実 験 で 心 筋 細 胞 壊 死 の 指 標 と さ れ る 心 筋 組 織 か ら の ク レ ア チ ン キ ナ ー ゼ 逸 脱 を 減 少 さ せ た 。 こ れ ら の 結 果 か ら 、 YT-146 の 虚 血 前 投 与 が 、虚 血 に 対 し て 心 筋 へ の 直 接 的 な 保 護 作 用 を 発 揮 し 、灌 流 心 へ の 虚 血 /再 灌 流 障 害 を 軽 減 し た と 考 え ら れ た 。

3.1 実 験 材 料 及 び 方 法

3.1.1 実 験 動 物

本 実 験 で は 体 重 250-280ｇ の Wistar 系 雄 性 ラ ッ ト （ 日 本 実 験 動 物 株 式 会 社 ） を 用 い た 。 飼 料 及 び 水 は 自 由 摂 取 と し 、 恒 温 （ 23±1°C）、 恒 湿 （ 55±5%） 定 時 証 明 （ 12 時 間 明 所 7:00-19:00、 12 時 間 暗 所 19:00-7:00） の 人 工 環 境 下 で 飼 育 し た 。

本 実 験 に お け る実 験 動 物 の 管 理 と 使 用 に 関 し て は 、 米 国 National Research Council の Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington D.C.,1996) に 従 っ た 。本 研 究 は 東 京 薬 科 大 学 動 物 実 験 委 員 会 に て 実 験 計 画 の 審 査 及 び

承 認 を 経 て 行 わ れ た 。

3.1.2 ラ ッ ト 摘 出 心 Langendorff 灌 流 標 本 の 作 製

ラ ッ ト を diethyl ether で 麻 酔 後 、速 や か に 心 臓 を 取 り 出 し た 。摘 出 心 臓 を Langendorff 灌 流 装 置 に 装 着 し 灌 流 を 開 始 し た 。 灌 流 に は Krebs-Henseleit 緩 衝 液 （ 120 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 1.2 mM KH2PO4, 1.2 mM MgSO4, 1.25 mM CaCl2, 25 mM NaHCO3, and 11

当 た り 300 回 の 収 縮 弛 緩 を 灌 流 心 臓 に 行 わ せ た 。 前 章 と 同 様 に 、YT-146 は Krebs-Henseleit 緩 衝 液 に 溶 解 し 、大 動 脈 に 通 じ る カ ニ ュ ー レ か ら 終 濃 度 0.3 μM で 虚 血 10 分 前 か ら 虚 血 開 始 時 ま で の 10 分 間 の み 作 用 さ せ た 。 正 常 灌 流 群 で は 、 正 常 酸 素 分 圧 下 に て YT-146 有 り あ る い は 無 し の 条 件 で 90 分 間 の 灌 流 を 行 っ た （ normoxic group）。 3.1.4 心 筋 細 胞 内 Na+ 含 量 の 定 量 心 筋 細 胞 Na+ _{含 量 は 既 報 に 従 っ て 測 定 し た} 8 )_{。虚 血 、再 灌 流 あ る い は 正 常 酸 素 灌 流} 終 了 時 に 氷 冷 し た 320 mM sucrose、 20 mM Tris-HCl（ pH7.4） で 心 臓 を 1 分 間 灌 流 す る こ と で 、 血 管 内 腔 お よ び 細 胞 外 領 域 の 灌 流 液 を 洗 い 流 し た 。 心 臓 か ら 左 心 室 壁 の 一 部 を 採 取 し 、 細 切 後 、120°C で 24 時 間 乾 燥 さ せ た 。乾 重 量 を 測 定 後 、組 織 を 60% HNO3に て 180°C で 消 化 ・ 蒸 発 乾 固 さ せ た 。 残 渣 を 0.75N HNO3 で 懸 濁 し 、 原 子 吸 光 光 度 計 （ AA-680、 Shimazu,Kyoto Japan） を 用 い て 心 筋 細 胞 Na+ 含 量 を 測 定 し た 。 3.1.5 ミ ト コ ン ド リ ア の 単 離 と Na+ 含 量 の 定 量 虚 血 前 、 虚 血 後 及 び 再 灌 流 後 の 心 臓 か ら 左 心 室 壁 の 一 部 を 採 取 し 、 氷 冷 し た 緩 衝 液 （ 180 mM KCl, 0.5% fatty acid-free BSA, 10 mM EDTA (pH 7.4)） 中 に て 細 切 後 に 、 テ フ ロ ン ホ モ ジ ナ イ ザ ー で ホ モ ジ ナ イ ズ し た 。得 ら れ た ホ モ ジ ネ ー ト を 2°C、800×g で 10 分 間 遠 心 し た 後 、そ の 上 清 を さ ら に 2°C、8000×g で 10 分 間 遠 心 し た 。得 ら れ た 沈 殿 を sucrose 緩 衝 液 （ 320 mM sucrose, 0.25% BSA, 20 mM Tris-HCl (pH 6.8)） で 懸 濁 し 、 ミ ト コ ン ド リ ア 画 分 を 得 た 。

ミ ト コ ン ド リ ア 画 分 の Na+ _{含 量 は 3.1.4 記 載 の 方 法 で 原 子 吸 光 光 度 計 に て 測 定 し}

た 。 ミ ト コ ン ド リ ア 画 分 の タ ン パ ク 質 量 は Lowry 法 で 測 定 し た 。 3.1.6 心 筋 組 織 ATP 及 び ク レ ア チ ン リ ン 酸 の 定 量

心 筋 の ATP 及 び creatine phosphate（ CrP） 含 量 を 既 報 に 従 っ て 測 定 し た 8 3 )_{。 正 常}

灌 流 後 、 虚 血 終 了 時 あ る い は 再 灌 流 終 了 時 に 、 心 臓 を あ ら か じ め 液 体 窒 素 で 冷 却 し た ア ル ミ ニ ウ ム ク ラ ン プ を 用 い た フ リ ー ズ ク ラ ン プ 法 に て 瞬 時 に 凍 結 し た 。 凍 結 組 織 を 粉 砕 し 、0.3N HClO4 と 0.25 mM EDTA 溶 液 を 加 え 、ポ リ ト ロ ン ホ モ ジ ナ イ ザ ー（ model

RT 10-35, Kinematica, Littau, Switzerland ） に て ホ モ ジ ナ イ ズ し た 後 、 4°C、 8000×g に て 15 分 間 遠 心 分 離 し た 。 上 清 を 2.5 M K2CO3 で 中 和 し 、 生 じ た KClO4 を 除 去 す る

た め 、再 度 同 条 件 に て 遠 心 分 離 し た 上 清 を 心 筋 高 エ ネ ル ギ ー リ ン 酸 測 定 用 試 料 と し た 。 試 料 中 の ATP は HPLC を 用 い て 定 量 し た 。HPLC に よ る 測 定 に は イ オ ン 交 換 カ ラ ム（ 100×7.6 mm、Asahipak ES-502N, Shoko Tsushou, Tokyo）を 使 用 し 、移 動 層 に は 250 mM KH2PO4+15% CH3CN（ pH 6.5） を 用 い た 。 CrP の 測 定 は CrP を ATP に 変 換 後 、

3.1.7 心 筋 ミ ト コ ン ド リ ア 酸 素 消 費 速 度 の 測 定

ミ ト コ ン ド リ ア 酸 素 消 費 速 度 （ oxygen consumption rate, OCR） は 心 筋 脱 膜 化 標 本 （ skinned fiber） を 用 い 、 既 報 に 従 っ て 測 定 し た 8 4 )_{。 正 常 灌 流 後 、 虚 血 終 了 時 あ る い}

は 再 灌 流 終 了 時 の 心 臓 か ら 左 心 室 筋 の 一 部 を 採 取 し 、 McIlwain Tissue Chopper（ Mick Lab. Engineering Co., NY ） を 用 い て 細 切 し 、 幅 0.3-0.4 mm、 長 さ 3-4 mm の 小 片 を 作 製 し た 。 こ の 小 片 を 溶 液 A （ 10 mM EGTA, 3 mM MgSO4, 20 mM taurine, 0.5 mM

dithiothreitol, 20 mM imidazole, 160 mM potassium MOPS, 5 mM ATP, and 15 mM C rP (pH 7.0)、4°C）中 で 洗 浄 し た 。そ の 後 、75 μg/mL の saponin を 含 む 1 mL の 溶 液 A 中 で 、 20 分 間 の 脱 膜 処 理 を 行 い 、 skinned fiber を 作 製 し た 。 脱 膜 処 理 後 、 標 本 を 溶 液 B （ medium A without ATP and CrP, but supplemented with 0.5% BSA、 4°C） 中 で 10 分 間 の イ ン キ ュ ベ ー ト す る こ と に よ り 、 saponin を 除 去 し た 。

1 ｍ L の 溶 液 B 中 の skinned fiber を 測 定 試 料 と し 、OCR は Clark 型 酸 素 電 極 を 用 い て 測 定 し た （ 30°C）。 測 定 試 料 に 5 mM glutamate、 3 mM malate 及 び 3 mM KH2PO4

を 添 加 し た 時 に 測 定 さ れ る OCR を V0 と し た 。 さ ら に 、 1 mM ADP 及 び 7.5 mM

creatine を 添 加 し た 時 に 測 定 さ れ る OCR 値 を 最 大 OCR （ Vma x） と し た 。Vma x と V0

の 差 を ADP か ら ATP に 変 換 さ れ る た め に 必 要 な 酸 素 量 OCR （ VAD P）と し た 。酸 素

消 費 速 度 測 定 後 に skinned fiber を 0.5 mL の 2 N NaOH （ 60°C）中 で 30 分 間 可 溶 化 し 、 タ ン パ ク 質 量 を 測 定 し た 。

Sodium lactate 存 在 下 の 心 筋 ミ ト コ ン ド リ ア OCR の 測 定 で は 、 0.3 μM YT-146 処 置 あ る い は 未 処 置 の 灌 流 心 臓 か ら 作 製 し た skinned fiber を 6.25 か ら 50 mM の sodium lactate と 共 に イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し た 。

3.1.8 Skinned fiber 中 の Na+ 濃 度 の 測 定

Skinned fiber 中 の Na+ 濃 度 は 既 報 に 従 っ て 測 定 し た 8 5 )。 膜 透 過 性 Na+ 指 示 薬 で あ る sodium-binding benzofuran isophthalate -acetoxymethyl ester （ SBFI/AM） を 1 mM と な る よ う DMSO に 溶 解 し た 。次 に 、3 μL の 25%（ w/v） Pluronic F-127R_{と 3 μL の 1}

ド リ ア の Na+ _{の 取 り 込 み 量 は 2 波 長 励 起 に よ り 放 射 さ れ た 蛍 光 強 度 比 で 評 価 し た 。}

3.1.9 統 計 解 析

試 験 結 果 は 平 均 値 ±標 準 誤 差 に て 表 し た 。 統 計 学 的 解 析 は EXSAS（ CAC EXICARE 製 ）を 用 い て 行 っ た 。有 意 差 の 検 定 に は 一 元 配 置 分 散 分 析（ ANOVA）を 行 い 、必 要 に 応 じ て Bonferroni ま た は Dunnett の 多 重 比 較 を 用 い た 。 検 定 は 95% の 信 頼 度 （ p<0.05） を も っ て 有 意 差 あ り と 判 定 し た 。

Fig. 29. Perfusion protocol of isolated rat hearts.

3.2 結 果

3.2.1 YT-146 処 置 の 左 心 室 発 生 圧 、 左 心 室 拡 張 末 期 圧 及 び 灌 流 圧 に 及 ぼ す 効 果

Fig. 30 に YT-146 未 処 置 あ る い は 処 置 群 に お け る 虚 血 / 再 灌 流 時 の 左 心 室 発 生 圧 （ LVDP, A）、左 心 室 拡 張 末 期 圧 （ LVEDP, B）及 び 灌 流 圧（ C）を 示 す 。YT-146 処 置 群 に お け る 再 灌 流 時 の LVDP 回 復 は 未 処 置 群 の そ れ よ り も 促 進 さ れ た（ 73.0±3.4 mmHg vs. 33.0 ± 2.5 mmHg ）。 LVEDP 及 び 灌 流 圧 は YT-146 処 置 群 で 有 意 な 低 値 を 示 し 、 YT-146 に よ る 心 保 護 作 用 が 確 認 さ れ た 。

Fig. 30. Time course of change in LVDP (A), LVEDP (B) and perfusion pressure (C) during the 30-min ischemia (isch) / 60-min reperfusion (rep). Data are shown for hearts treated with (○ ) and without 0.3 μM YT-146 (● ). Each value represents the mean±SE M (n=5). *Significant difference from the group without YT-146 treatment (p<0.05) .

isch

rep

A

B

3.2.2 YT-146 処 置 の 心 筋 組 織 ATP 及 び ク レ ア チ ン リ ン 酸 含 量 へ の 効 果

YT-146 未 処 置 あ る い は 処 置 群 に お け る 心 筋 ATP 及 び ク レ ア チ ン リ ン 酸 （ CrP ） 含 量 を Fig.31 に 示 す 。 YT-146 未 処 置 群 の 虚 血 前 ATP 及 び CrP 含 量 は 、 そ れ ぞ れ 23.6±0.5 及 び 34.0±1.3 μmol/g dry tissue で あ っ た 。正 常 灌 流（ Nor）を 30 分 あ る い は 90 分 間 行 っ た 群 に お い て 、こ れ ら 高 エ ネ ル ギ ー リ ン 酸 の 値 は 、虚 血 前 の そ れ ら と 同 様 の 値 と な り 、正 常 灌 流 の 灌 流 時 間 に よ る 影 響 は 無 か っ た 。 一 方 、虚 血 心 筋 （ Isch）の ATP 及 び CrP 含 量 は 虚 血 前 の そ れ ぞ れ 12% 及 び 2% に 減 少 し 、 再 灌 流 後 の そ れ ら の 値 は そ れ ぞ れ 33% 及 び 30% の 回 復 に 留 ま っ た 。一 方 、YT-146 処 置 群 の 虚 血 終 了 時 の ATP 及 び CrP 含 量 は 未 処 置 群 の そ れ ら と 同 じ レ ベ ル ま で 減 少 し た が 、 再 灌 流 後 の そ れ ら 含 量 は 虚 血 前 の 76% 及 び 66% ま で 回 復 し た 。

3.2.3 YT-146 処 置 の ミ ト コ ン ド リ ア 酸 素 消 費 速 度 へ の 効 果

YT-146 未 処 置 あ る い は 処 置 群 の 灌 流 心 か ら 作 製 し た skinned fiber に お け る 虚 血 前 、 虚 血 後 及 び 再 灌 流 後 の ミ ト コ ン ド リ ア 酸 素 消 費 速 度 （ OCR） を Fig.32 に 示 す 。 虚 血 前 の OCR は 52.6±1.2 nano-atomO/min/mg protein で あ っ た 。 YT-146 未 処 置 群 に お け る 虚 血 後 の ミ ト コ ン ド リ ア OCR は 、 虚 血 前 値 の 約 45% に 低 下 し 、 再 灌 流 後 で は 虚 血 前 値 の 約 30% と 、さ ら に 低 下 し た 。一 方 、YT-146 処 置 群 の 虚 血 終 了 時 お よ び 再 灌 流 終 了 時 の ミ ト コ ン ド リ ア OCR は 、 未 処 置 群 の そ れ よ り も 高 値 に 保 た れ て お り 、 そ れ ぞ れ 虚 血 前 値 の 約 80% 及 び 85% で あ っ た 。 な お 、 正 常 灌 流 心 で は 、 い ず れ の 時 点 で も YT-146 未 処 置 及 び 処 置 群 間 で の ミ ト コ ン ド リ ア OCR に 差 は 無 く 、 好 気 的 な 条 件 下 で の 灌 流 時 間 及 び 薬 物 処 置 は ミ ト コ ン ド リ ア OCR に 影 響 し な い こ と が 示 さ れ た 。

3.2.4 YT-146 処 置 の 心 筋 内 Na+ 含 量 へ の 効 果

YT-146 未 処 置 あ る い は 処 置 群 に お け る 虚 血 前 、 虚 血 後 及 び 再 灌 流 後 の 心 筋 Na+ 含 量 を Fig.33 に 示 す 。虚 血 前 の 心 筋 Na+

含 量 の 値 は 54.57±0.68 μmol/g dry tissue で あ っ た 。 YT-146 未 処 置 群 に お い て 、 虚 血 後 の 心 筋 Na+ 含 量 は 虚 血 前 値 の 約 2 倍 に 増 加 し 、再 灌 流 後 に は さ ら に 高 値 と な っ た 。YT-146 処 置 群 で は 、虚 血 後 の 心 筋 Na+ 含 量 は 未 処 置 群 の そ れ と 同 様 の 値 に な っ た 。 一 方 、 再 灌 流 後 の 心 筋 Na+ 含 量 は 67.11±2.26 μmol/g dry tissue と な り 、 YT-146 非 投 与 群 の 129.99±6.43 μmol/g dry tissue よ り も 低 値 と な っ た 。 正 常 灌 流 心 で は 、 灌 流 時 間 お よ び YT-146 処 置 に 関 わ ら ず 心 筋 Na+ 含 量 は い ず れ も 約 55 mol/g dry tissue と な っ た 。

3.2.5 YT-146 処 置 の ミ ト コ ン ド リ ア 内 Na+ 含 量 へ の 効 果

YT-146 未 処 置 あ る い は 処 置 群 に お け る 虚 血 前 、 虚 血 後 及 び 再 灌 流 後 の 心 筋 ミ ト コ ン ド リ ア 画 分 の Na+

含 量 を Fig.34 に 示 す 。虚 血 前 の 心 筋 ミ ト コ ン ド リ ア 画 分 の Na+ 含 量 は 35.04±2.79 μmol/g dry tissue で あ っ た 。 YT-146 未 処 置 群 に お け る ミ ト コ ン ド リ ア 画 分 の Na+

含 量 は 虚 血 後 及 び 再 灌 流 後 に そ れ ぞ れ 虚 血 前 値 の 約 2.5 倍 及 び 2.1 倍 に 増 加 し た 。一 方 、 YT-146 処 置 群 で は 、虚 血 後 及 び 再 灌 流 後 の Na+

含 量 は そ れ ぞ れ 64.05±3.29 及 び 43.44±3.74 μmol/g dry tissue と な り 、虚 血 前 値 の 約 1.8 倍 及 び 1.2 倍 と な り 、YT-146 未 処 置 群 の そ れ と 比 較 し て い ず れ も 低 値 と な っ た 。つ ま り 、YT-146 処 置 群 の 心 筋 で は 、 虚 血 時 の ミ ト コ ン ド リ ア で の Na+

蓄 積 が 軽 減 さ れ る こ と が 示 さ れ た 。正 常 灌 流 心 で は 、YT-146 未 処 置 及 び 処 置 に 関 わ ら ず ミ ト コ ン ド リ ア 画 分 の Na+

含 量 は 、 い ず れ も 虚 血 前 値 と 同 様 の 値 と な っ た 。

3.2.6 YT-146 処 置 の Skinned fiber 中 の Na+ 濃 度 の 評 価

YT-146 未 処 置 あ る い は 処 置 群 の 灌 流 心 臓 か ら 作 製 し た skinned fiber 中 の ミ ト コ ン ド リ ア の SBFI シ グ ナ ル 変 化 を Fig.35 に 示 す 。 Skinned fiber を 様 々 な 濃 度 の sodium lactate（ 6.25～ 50 mM） 存 在 下 で イ ン キ ュ ベ ー ト し た 結 果 、 sodium lactate の 濃 度 に 依 存 し て SBFI シ グ ナ ル 強 度 が 上 昇 し た 。 一 方 、 YT-146 処 置 群 の 心 筋 か ら 作 製 し た skinned fiber で は 、sodium lactate 存 在 下 で の SBFI シ グ ナ ル 強 度 の 上 昇 度 合 い が 軽 減 さ れ た 。 つ ま り YT-146 処 置 群 の 心 筋 で は 、 sodium lactate に よ る ミ ト コ ン ド リ ア 内 の Na+

蓄 積 が 軽 減 さ れ る こ と が 示 さ れ た 。 な お 、 sodium lactate 濃 度 の 上 昇 に よ る 浸 透 圧 変 化 が SBFI シ グ ナ ル 強 度 に 与 え る 影 響 を 検 討 す る た め 、 skinned fiber を 様 々 な 濃 度 の choline chloride と 共 に イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。そ の 結 果 、choline chloride は SFBI シ グ ナ ル を 変 化 さ せ な か っ た こ と か ら 、 浸 透 圧 変 化 に よ る シ グ ナ ル へ の 影 響 は 無 い と 考 え ら れ た 。

3.2.7 Sodium lactate 存 在 下 に お け る ミ ト コ ン ド リ ア 酸 素 消 費 速 度 に 及 ぼ す YT-146 の 効 果

ミ ト コ ン ド リ ア の ATP 産 生 能 へ の Na+

の 作 用 を 検 討 す る た め 、正 常 灌 流 心 臓 か ら 作 製 し た skinned fiber の 酸 素 消 費 速 度 (OCR) を 、 sodium lactate 存 在 下 あ る い は 非 存 在 下 で 測 定 し た 結 果 を Fig.36 に 示 す 。Skinned fiber を 6.25 か ら 50 mM の sodium lactate で イ ン キ ュ ベ ー ト し た と こ ろ 、 OCR 値 は sodium lactate 濃 度 上 昇 に 伴 い 減 少 し た 。YT-146 処 置 し た 心 臓 か ら 作 製 し た skinned fiber で 同 様 の 検 討 を 行 っ た と こ ろ 、 sodium lactate 濃 度 上 昇 に よ る OCR 低 下 の 度 合 い は 軽 減 さ れ た 。 つ ま り 、 YT-146 処 置 群 の 心 筋 組 織 で は sodium lactate に よ る エ ネ ル ギ ー 産 生 能 低 下 へ の 耐 性 が 生 じ て い る こ と が 示 さ れ た 。

3.3 考 察 第 2 章 の 摘 出 灌 流 心 臓 を 用 い た 研 究 で 、YT-146 の 心 筋 保 護 作 用 は ア デ ノ シ ン A1 受 容 体 刺 激 を 介 し て 発 揮 さ れ る と 考 え ら れ た 。 一 方 、 ラ ッ ト 摘 出 心 臓 を 定 圧 で Langendorff 灌 流 す る と 、 YT-146 投 与 に よ る ア デ ノ シ ン A2 A 受 容 体 を 介 し た 冠 動 脈 拡 張 作 用 で 冠 動 脈 灌 流 量 は 顕 著 に 増 加 し た 。 ア デ ノ シ ン A2 A 受 容 体 ア ン タ ゴ ニ ス ト の 同 時 投 与 で 、 YT-146 の 再 灌 流 時 の 心 収 縮 力 回 復 が わ ず か で は あ る も の の 減 弱 さ れ る 傾 向 も 観 察 さ れ た 。 つ ま り 、 YT-146 の 心 筋 直 接 的 な 保 護 の 機 序 と し て 、 ア デ ノ シ ン A2 A 受 容 体 刺 激 を 完 全 に 除 外 で き な か っ た 。 そ こ で 本 章 で は 、 ラ ッ ト 摘 出 心 臓 を 定 流 量 の Langendorff 灌 流 を 行 っ た 。そ の 結 果 、定 流 量 灌 流 試 験 に お い て も YT-146 は 再 灌 流 時 の 心 収 縮 機 能 回 復 を 増 加 さ せ た こ と か ら 、 虚 血 /再 灌 流 障 害 に 対 す る YT-146 の 心 筋 保 護 効 果 に ア デ ノ シ ン A2 A 受 容 体 刺 激 を 介 す る 冠 灌 流 量 増 大 の 寄 与 は 極 め て 小 さ い と 考 え ら れ た 。 本 試 験 に お い て 、 YT-146 処 置 群 の 灌 流 心 臓 で は 、 再 灌 流 後 の 心 収 縮 能 の 回 復 だ け で な く 、 心 筋 高 エ ネ ル ギ ー リ ン 酸 含 量 の 回 復 も 促 進 さ れ た 。 こ れ ら の 結 果 は 、 虚 血 心 筋 で の ミ ト コ ン ド リ ア の エ ネ ル ギ ー 産 生 能 の 保 持 を 示 唆 し た 。虚 血 心 筋 に お い て Na+ チ ャ ネ ル 及 び Na+

/H+ exchanger（ NHE） を 介 し た 細 胞 外 領 域 （ extracellular space） か ら 細 胞 内 へ の Na+ の 過 剰 な 流 入 に よ っ て 誘 発 さ れ る Na+ 過 負 荷 は 、ミ ト コ ン ド リ ア の エ ネ ル ギ ー 産 生 能 力 を 非 可 逆 的 に 減 少 さ せ る こ と が 示 さ れ て い る 8 6 , 8 7 )_{。し か し な が} ら 、本 試 験 に お い て 虚 血 終 了 時 に 心 筋 組 織 の Na+ 含 量 を 測 定 し た と こ ろ 、YT-146 処 置 群 の 心 筋 Na+ 含 量 は 未 処 置 群 の そ れ と 同 様 の レ ベ ル ま で 増 大 し て お り 、YT-146 が 虚 血 心 筋 で の Na+ 過 負 荷 を 軽 減 さ せ る 能 力 は 低 か っ た 。 そ こ で 虚 血 心 筋 の ミ ト コ ン ド リ ア へ の YT-146 の 作 用 に つ い て 検 討 し た 。虚 血 終 了 時 の 心 筋 ミ ト コ ン ド リ ア 画 分 の Na+ 含 量 は 、 虚 血 前 値 の そ れ の 2 倍 以 上 に 増 大 し 、 心 筋 組 織 だ け で な く 心 筋 ミ ト コ ン ド リ ア で も Na+ 過 負 荷 が 生 じ て い る こ と を 見 出 し た 。 一 方 、YT-146 処 置 群 の 心 筋 組 織 の ミ ト コ ン ド リ ア 画 分 の Na+ 含 量 は 、 未 処 置 群 の そ れ よ り も 低 値 と な っ た 。 こ の こ と は 、虚 血 に よ る 心 筋 ミ ト コ ン ド リ ア で の Na+ _{過 負 荷 が YT-146 に よ り 抑 制 さ} れ る こ と を 示 唆 す る も の で あ る 。つ ま り 、YT-146 は 虚 血 心 筋 組 織 へ の Na+ 過 負 荷 を 抑 制 し な い が 、 ミ ト コ ン ド リ ア で の Na+ 過 負 荷 を 抑 制 す る こ と に よ り 、 虚 血 時 の ミ ト コ ン ド リ ア エ ネ ル ギ ー 産 生 能 力 を 保 持 す る と 考 え ら れ た 。 さ ら に 、 YT-146 に よ る ミ ト コ ン ド リ ア へ の Na+ 過 負 荷 抑 制 が オ ル ガ ネ ラ の エ ネ ル ギ ー 産 生 能 に 及 ぼ す 効 果 に つ い て 検 討 し た 。 YT-146 処 置 し た 正 常 灌 流 の み を 行 っ た 心 臓 か ら skinned fiber を 作 製 し た 。 こ の skinned fiber を 虚 血 心 筋 で 蓄 積 す る 嫌 気 的 代 謝 物 と し て 想 定 し た sodium lactate 存 在 下 で イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。そ の 結 果 Na+

指 示 薬 で あ る SBFI 蛍 光 強 度 比 が 上 昇 し 、sodium lactate が ミ ト コ ン ド リ ア 内 の Na+

濃 度 を 上 昇 さ せ る こ と を 示 し た 。 上 述 し た よ う に 、 虚 血 心 筋 で は 細 胞 外 か ら の Na+