博 士 （ 理 学 ） 高 瀬 尚 文
学 位 論 文 題 名
Studies of transcriptional regulation in plants ‑Analysis of DNA‑binding proteins that interact with cis‑regions of wheat histone genes
（ 植 物 にお け る 転 写制御 機構に 関する研 究一コ ムギヒ ストン 遺伝子 の シ ス 調 節 領 域 に 相 互 作 用 す る DNA 結 合夕 ン パ ク 質の 解 析 一 ）
学位論文内容の要旨
種 々 の 生 命 現 象 は 、 現 譲 を 担 う 機 能 タ ン パ ク 質 の 合 成 量 及 び 活 性 の 調 節 の 結 果 で あ る と 考 え る こ と が 出 来 る 。 こ の こ と は 、 遺 伝 子 発 現 の メ カ ニ ズ ム を 理 解 す る こ と が 、 種 々 の 生 命 現 象 を 解 明 す る ア コ ． ロ ー チ の ひ と つ と な る こ と を 意 味 す る 。 遺 伝 子 の 発 現 制 御 は 、 ＠DNA量 と 構 造 変 化 レ ベ ル 、 ＠ 転 写 レ ベ ル 、 ◎ 転 写 後 レ ベ ル 、 ＠ 翻 訳 レ ベ ル 、 ◎ 翻 訳 後 レ ベ ル 、 の5つ の 段 階 に 分 け る こ と が で き る 。 特 に ＠ の 転 写 レ ベ ル で の 制 御 は 遺 伝 子 発 現 調 節 の 主 要 な 段 階 で あ り 、 転 写 開 始 位 置 付 近 の 基 本 シ ス エ レ メ ン ト が 転 写 開 始 点 を 規 定 し 、 転 写 開 始 位 置 か ら 離 れ た 位 置 に あ る 調 節 シ ス エ レ メ ン ト が 転 写 活 性 量 の 増 減 に 関 わ る こ と が 明 ら か に さ れ て い る 。 そ し て 各 々 の シ ス エ レ メ 冫 ト に は 基 本 転 写 因 子 群 と 遺 伝 子 特 異 的 転 写 調 節 因 子 群 が 結 合 し 、ONA― タ ン パ ク 質 、 及 び タ ン バ ク 質 一 タ ン パ ゥ 質 相 互 作 用 に よ っ て 遺 伝 子 の 転 写 調 節 が な さ れ て い る 。 現 在 、 遺 伝 子 の 発 現 制 御 研 究 に お い て は 、 調 節 シ ス エ レ メ ン ト と そ れ に 作 用 す る 転 写 因 子 群 の 同 定 、 そ れ ら の 機 能 解 析 、 そ し て 各 因 子 間 の 相 互 作 用 等 を 明 ら か に す る こ と が 重 要 な 研 究 課 題 と な っ て き て い る 。 本 論 文 は 、 植 物 に お け る 転 写 制 御 機 構 を 解 明 す る こ と を 目 的 と し て 、 コ ム ギ ヒ ス ト ン 遺 伝 子 を 材 料 と し 、 そ の 調 節 シ ス エ レ メ ン ト に 結 合 す る タ ン バ ゥ 質 因 子 群 に っ い て 解 析 し 、 そ の 結 果 を ま と め た も の で あ る 。
私 が 所 属 す る 研 究 グ ル ー プ で は 、 こ れ ま で に コ ム ギ ヒ ス ト ンH3遺 伝 子 （ 以 下H3遺 伝 子 と 略 す ） を 中 心 に 、 そ の 発 現 制 御 機 構 の 解 明 を 行 っ て き て い る 。 そ の 5 上 流 域 に は 、 調 節 シ ス エ レ メ ン ト と し て へ キ サ マ ー(ACGTCA)、 オ ク タ マ ー(CGCGGATC)、 ノ ナ マ ー(CATCCAACG)モ チ
ー フ が 同 定 さ れ て い る 。 こ れ ら の モ チ ー フ は 他 の 植 物 ヒ ス ト 冫H3お よ びH4遺 伝 子 の5'上 流 域 に も 見 い だ さ れ 、 植 物 ヒ ス ト 冫 遺 伝 子 の 転 写 調 節 に お い て 重 要 な 役 割 を 担 っ て い る と 推 定 さ れ て い る 。 ま たH3及 びH4遺 伝 子 の へ キ サ マ ー モ チ ー フ に 結 合 す るDNA結 合 タ ン バ ク 質 因 子HB P‑laとHBP‑lb、 ノ ナ マ ー モ チ ー フ に 結 合 す る 因 子HBP‑2が コ ム ギ 胚 芽 の 核 抽 出 物 中 に 存 在 す る こ と が 示 さ れ て い る 。 さ ら に HBP‑lbは 、 カ リ フ ラ ワ ー ． モ ザ イ ゥ ・ ウ イ ル ス35S RNA遺 伝 子 フIロ モ ー タ ー お よ び ア グ ロ バ ク テ リ ウ ム ． Tiフ ． う ス ミド 上 の ノ パ リ ン 合成 酵 素 遺 伝 子 プ ロ モ ー タ ー に 存 在 す る へ キ サ マ ー モ チ ー フ に も 特 異 的 に 結 合 す る こ と が わ か っ て い る 。
以 上 の 知 見 を 背 景 に 、 私 は へ キ サ マ ー モ チ ー フ を 介 し たH3遺 伝 子 の 転 写 制 御 構 構 を 理 解 す る た め 、HBP‑la及 びHBP‑lb両 因 子 の 分 離 ・ 精 製 法 を 確 立 し 、 部 分 精 製 し た 両 因 子 の 諸 性 質 を 調 べ た 。 コ ム ギ 胚 芽 粗 核 抽 出 物 を 出 発 材 料 に し た ホ ス ホ セ ル ロ ー ス 、 ブ テ ル セ フ ァ ロ ー ス 、 配 列 特 異 的DNAア フ ィ ニ テ ィ ー ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー を 行 う こ と に よ り 、 両 因 子 を 分 離 しHBP‑
laに つ い て は1,100倍 、HBP‑lbに 対 し て は1，800倍 以 上 に 精 製 し た 。 こ の 最 終 部 分 精 製 標 品 を 用 い て 、 以 下 の 解 析 を 行 っ た 。 メ チ ル 化 干 渉 法 に よ りH3遺 伝 子 に 対 す る 両 因 子 の 結 合 部 位 を 調 べ た と こ ろ 、 両 因 子 に お い て 若 干 の 差 こ そ あ れ 、 共 に へ キ サ マ ー モ チ ー フ と そ の 周 辺 に あ る グ ア ニ 冫 残 基 に 結 合 し て お り 、 両 因 子 の 結 合 部 位 が 重 複 し て い る こ と が 確 認 さ れ た 。 次 に 、 ゲ ル シ フ ト ア ッ セ イ 法 を 用 い て 、 両 因 子 のDNA結 合 活 性 に つ い て 調 べ た 。DNAと 両 因 子 の 複 合 体 が 解 離 す る 程 度 は 両 因 子 と も 似 て い る こ と か ら 、 両 因 子 のDNA結 合 安 定 性 は 似 て い る と 考 え ら れ た 。 し か し 、HBP‑lbが 結 合 活 性 を 失 う 高 塩 濃 度 下 でHBP‑laは ま だDNA結 合 活 性 を 示 し た 。 こ の こ と は 、HBP‑laの へ キ サ マ ー モ チ ー フ に 対 す る 親 和 性 はHBP‑lbの そ れ よ り も 高 い こ と を 示 唆 す る も の で あ っ た 。 動 物 等 の 転 写 制 御 因 子 の 活 性 に は 、 リ 冫 酸 化 ・ 脱 リ ン 酸 化 が 関 与 し て い る こ と が 報 告 き れ て い る の で 、 フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ 処 理 し たHBP‑la及 ぴHBP‑lbに つ い て そ のDNA結 合 活 性 能 を 調 べ た 。 そ の 結 果 、 HBP‑lbに つ い て の みDNA結 合 活 性 の 低 下 が み ら れ た 。 こ の こ と よ り 、 少 な く と もHBP‑lbのDNA結 合 制 御 に は り ン 酸 化 ・ 脱 リ ン 酸 化 が 関 与 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 ま た 、 サ ウ ス ウ ェ ス タ ン 法 、 プ 口 テ ア ー ゼ 耐 性DNA結 合 コ ア の 解 析 結 果 か ら 、 両 因 子 は 異 な る タ ン パ ク 質 因 子 群 に 属 す る こ と と サ ブ タ イ71が 存 在 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。 従 っ て 、 上 記 の 結 果 、H3遺 伝 子 の 転 写 は 、 少 な く と もHBP‑laとHBP‑
lbの2つ の タ ン パ ク 質 因 子 の へ キ サ マ ー モ チ ー フ ヘ の 結 合 に よ っ て 制 御 さ れ て い る こ と が 考 え ら れ る 。 現 在 、 私 た ち の 研 究 グ ル ー プ で は 両 因 子 を コ ー ド す るcDNA群 が 単 離 さ れ 、 そ れ ら がbZIP型 の 転 写 因 子 に 属 し 、 各 々 異 な る タ 冫 バ ク 質 因 子 で あ る こ と や 、 サ ブ フ ァ ミ リ ー を 形
成 し て い る こ と が 明 ら か と な っ て お り 、 ぎ ら に り ン 酸 化 酵 素 の 認 識 部 位 に な り う る 部 位 が 複 数 見 い だ さ れ る こ と が 示 さ れ て い る 。 こ れ ら は い ず れ も 上 述 の 考 察 を 支 持 す る も の で あ る 。 こ れ ら 両 因 子 の 機 能 お よ び 役 割 分 担 に っ い て は 、 今 後 の 研 究 課 題 で あ る 。
植 物 ヒ ス ト ンH3とH4遺 伝 子 で は 、 し ぱ し ぱ オ ク タ マ ー モ チ ー フ が へ キ サ マ ー モ チ ー フ の2 塩 基 下 流 に 見 い だ き れ る 。 そ し て 、 両 モ チ ー フ の 位 置 関 係 は よ く 保 存 さ れ て い る 。 こ の こ と は 、 ヘ キ サ マ ー モ チ ー フ とHBP‑laやHBP‑lbに よ る 転 写 制 御 を 理 解 し て い く 上 で 、 オ ク タ マ ー モ チ ー フ （ あ る い は へ キ サ マ ー と オ ク タ マ ー 両 モ チ ー フ を 含 む 領 域 ） に 相 互 作 用 す る 因 子 を 同 定 し 、 そ の 転 写 制 御 へ の 関 与 を 調 べ る こ と の 必 要 性 を 示 す も の で あ る 。 そ こ で ヽ コ ム ギ 胚 芽 粗 核 抽 出 物 か ら 、 両 モ チ ー フ を 含 む 領 域 に 結 合 す る 因 子 を ゲ ル シ フ ト 法 で 検 索 し た 。 そ の 結 果 、 単 饋DNA特 異 的 か つ 鎖 特 異 的 結 合 活 性 を 示 す タ ン バ ク 貿 因 子 が2種 類 同 定 ぎ れ た 。 両 モ チ ー フ を 含 むlower鎮 特 異 的 に 結 合 す る 因 子 をssDBP‑l (si ngle‑strand DNA壘indi ng 旦r。tein(s)゛1） 、uppe「 鐘 特 異 的 に 結 合 す る 因 子 をssDBP‑2と 命 名 し た 。 両 単 鎖DNA結 合 因 子 の 結 合 特 異 性 を 調 べ る た め に 、 コ ム ギH3及 びH4遺 伝 子 、 イ ネ の フ ィ ト ク ロ ー ムA3遺 伝 子 （ 以 下PhyA3遺 伝 子 と 略 す ） の シ ス 領 域 に あ る オ ゥ タ マ ー モ チ ー フ を 含 む 領 域 の 合 成 オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド を 用 い て 、 ゲ ル シ フ ト ア ッ セ イ と メ チ ル 化 干 渉 法 を 行 っ た(3遺 伝 子 と も オ ク タ マ ー モ チ ー フ と し てlower鎖 にCGCGGATN配 列 、upper鎖 にNATCCGCG配 列 が あ る ） 。 そ の 結 果 、 ssDBP‑lは3つ の 遺 伝 子 のlower鎖 上 のCGCGGATNGG配 列 に 結 合 す る こ と 、 そ し てssDBP‑2は H3及 び H4遺 伝 子 のupper鎖 に は 結 合 す る が 、PhyA3遺 伝 子 のupper鎖 に は 結 合 し な い こ と が 示 さ れ た 。 こ の こ と は 、ssD B‑P ‑2の 結 合 に は オ ヶ タ マ ー モ チ ー フ 中 の 配 列 だ け で は 不 十 分 で あ る こ と を 示 す も の で あ る 。 一 方 、PhyA3遺 伝 子 のupper鎖 の オ ゥ タ マ ー モ チ ー フ 中 に 結 合 部 位 が 同 定 さ れ る 因 子 が 新 た に 見 い だ さ れ た （ ssDBP‑3と 命 名 ） 。 動 物 や 動 物 ウ イ ル ス の 系 で は 配 列 特 異 的 な 単 鎖DNA結 合 因 子 が 転 写 制 御 に 関 わ る こ と を 示 唆 す る 報 告 が な さ れ て お り 、
ま たCrick(1971)は 二 本 鎖DNA内 に で き る 単 鎮DNA部 分 が 転 写 調 節 部 位 と し て 適 し て い る と い う モ デ ル を 提 唱 し て い る こ と か ら 、 今 後 こ れ ら 単 鎖DNA結 合 因 子 が 転 写 制 御 に 関 与 し て い
る 可 能 性 を 検 証 し て い く こ と が 重 要 で あ る と 思 わ れ る 。 ま た 、ssDBP‑l、ssDBP‑2の 結 合 部 位
が HBP‑la 及びHBP‑lb の結合部位と一部重複することから、これらの因子群の相互関係も明ら
か にする必要があろう。
主 副 副 副
学位論文審査の要旨
査 教 授 谷 藤 茂 行
学 位 論 文 題 名
