博 士 （ 農 学 ） イ ル ナ ユ リ ロ ザ レ イ ダ シ テ プ
Screening of plant growth‑promoting thizobacteria from Dipterocarpaceae plants growing in Indonesian tropical rain forests, and investigations of their functions on seedling growth
（インドネシアの熱帯雨林に自生するフタバガキ幼木の根面からフタバガキ 実生 の生育 を促 進す る細 菌類の 検索 とそ れら の機能性に関する研究）
学位論文内容の要旨
本研 究は、根面を中心としたフタバ ガキ表面から付着細菌を単離・同定し、それら がフ タバ ガキ実生の生育促進に及ぼす効 果を検証したものである。生育促進活性はフタ バガ キ芽 生え への 接種 試験 で評 価し 、高 い 効果 を示 したPGPR候補菌株群については、
細菌と実生の関係を理解するために、幾つかのin vitro試験を行った。研究は大きく4部 に分かれるが、それぞれはbioreforestationに応用可能な菌株を効率的に検索する方法を 模 索 し た も の で あ る た め 、 細 菌 分 離 と 考 察 部 分 は ― 括 し て 行 っ て い る 。 1． イ ン ド ネ シ ア の 熱 帯 多 雨 林 に 生 育 す る フ タ バ ガ キ と 共 存 す る 着 生 細 菌の 検 索、
分離、および同定
0.3％ジェラン ガムで半流動化させた、1％ ショ糖を含む無窒素窒Winogradsky s無機塩 培地をトラップ用培地として用い、Carita，Bogor，Jasinga（ジャワ）およびNyaru Menteng Palangkaraya（カリマンタン）で採取したフ タバガキ科植物の根面、根圏、葉面、種子表 面か ら合 計191株の 細菌 を分離した。その結果、属名を同定できた細菌 株136株のうち、
グラム陰性細菌に含まれるロ‐，T−，ぱ・プ口テオバクテリアがそれぞれ25％、22％、20％ を占め、低GCグラム陽性細菌(bacilli)は4％ に過ぎなかった。56菌株(29％）は16S rRNA 遺伝 子解 析に よる ルー チンな同定ができな かった。この検索結果から、フタバガキは多 様な 細菌 を保 持し てい るこ と、 ま たそ の種 子表 面にはsphingomonadsを高頻度で付着さ せて いる こと が分 かり 、植物と共存する多 様な細菌を検索する分離源として有望である ことが明らかとなった。
2.ポ ッ ト 試 験 に よ る フ タ パ ガ キ 実 生 の 生 育 を 促 進 す るPGPR‑候 補 細 菌 の 検 索 a1Z！五丑Z2生i1；土豊仝Q苴佳接盈エ尅Shorea selanica
コ ロニ ーを 全面 に生 育さ せたNB寒 天平 板を 砕き 、こ れを 培 地ご と直 接、 無菌ボット 土 壌に接種した。これに、無菌土壌に生育させておいたShorea selanica実生を直ちに 移 植 し た。 ―菌 株の 接種 につ き、6反復 で実 験を 行っ た。44株を接種試験に供した結果、
32株に生育促進効果が認められ、細菌接種によって実生の 苗高と葉面積量を増大させた。
b）Z！i左Z豐 童(2:根 仝Q錮 菌 ス 量 ル ニ ニ ニ とLエQ撞 疊 エ 竝Shorea leprosula 無菌 土壌 に 生育 させた＆ Ieprosula実生は、細菌の接種 に対して多様な応答を示し、そ の 効 果 は 接 種後5ケ月 まで 継続 した 。バ イオ アッ セ イ1で効 果の 高か った7菌株 と、 ボ
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ッ ト 試 験 に 供 し た 実 生 根 か ら 再 分 離 し た 根 圏 細 菌 株15株 の 計22株 に つ い て 、 半 流 動 ゲ ル を マ ト リ ッ ク ス と し た 細 菌 懸 濁 液 を 根 系 ヘ 直 接 浸 す 接 種 試 験 に 供 し た 。22株 の う ち 、 20株 に 何 ら か の 生 育 促 進 効 果 が 認 め ら れ た 。 実 験 に 用 い た 実 生 種 が 異 な る も の の 、 根 部 を バ ク テ リ ア の 半 流 動 ゲ ル 懸 濁 液 に 浸 す 方 法 で 細 菌 を 接 種 し た 実 生 で は 、 バ イ オ ア ッ セ イ1に 比 較 し て そ の 効 果 が 長 く 持 続 さ れ る こ と が 分 か っ た 。
必 Z！ i童 Z‑:!生 i墨 ； 担 仝 I■ ス 乏 リ ニ Q接 1、 対 Shorea selanica 野 外 へ の 移 植 を 考 慮 し 、 非 滅 菌 土 壌 に 生 育 さ せ たShorea selanica実 生 を バイ オ アッ セ イ2で 行 っ た 接 種 法 に よ っ て 接 種 し 、 そ のPGPR効 果 を 検 定 し た 。 接 種 試 験 に 供 し た19 株 は 、 フ タ バ ガ キ 実 生 な ら び に 種 子 表 面 か ら 分 離 し たSphingomonas spp.を 中心 と する 細 菌 群 か ら 選 ん だ も の で あ る 。 こ れ ら19株 の う ち 、12株 に 何 ら か の 生 育 促 進 効 果 が 認 め ら れ 、 そ の 実 生 伸 長 促 進 効 果 は 接 種 後6ケ 月 ま で 継 続 し た 。6ケ 月 後 の 菌 根 形 成 率 に は 大 き な ば ら つ き(40‑86％ ） が 認 め ら れ 、 ポ ッ ト 試 験 で は 菌 根 形 成 は 必 ず し も 芽 生 え 生 育 促 進 に 繋 が ら ず 、 む し ろ 抑 制 す る こ と が 分 か っ た 。
3． ねvitro試 験 に よ る フ タ パ ガ キ 実 生 の 生 育 を 促 進 す るPGPR‑候 袖 一 ■ の 検 索 中 央 カ リ マ ン タ ン の 熱 帯 泥 炭 林 に 生 育 し て い る フ タ バ ガ キ 幼 木 の 根 面 と 根 圏 か ら 分 離 し た 、71株 の 細 菌 に つ い て 、 リ ン 可 溶 化 能 、 菌 根 形 成 制 御 能 、 お よ びIAA産 生 能 に つ い て 加vitro検 定 に 供 し た 。 難 溶 性 無 機 リ ン 酸 塩 で あ るCa3(HP04)2を 可 溶 化 で き 、 か つ 、 有 機 体 リ ン 酸 塩 で あ る フ ィ チ ン 酸Naを 無 機 化 し て 利 用 す る 能 カ を も つ 細 菌 と し て6菌 株 を 得た 。 菌根 菌Laccaria sp.を指 標菌 とし て 検定 した 場合 、唯‑ ChromobacterzMmsp．CK8 1菌株のみがエロccロ′ぬsp．菌糸生育を促進した。一方、B釘′肋D絖′ぬsp．CK46，nロ肥Hrぬsp． CK29， お よび 岡PぬfP〃口sp．CK6は対 峙培 養 条件下でエロccロ′ぬsp．の菌糸生育を明らかに 抑 制 した 。 簡易IAA産生 試験 であ るSalkowsky s試薬 に よるL−tびptophan代 謝能 検 定で は、
71菌 株 の う ち30菌 株 が 何 ら か の 陽 性 反 応 を 示 し た が 、 こ の 試 験 に よ る 呈 色 強 度 （at660 nm） とM邪 ロ ′ ロ あ 洒 ぬ 芽 生 え 生育 促進 効果 の 間に は、 何ら 相関 が 認め られ なか っ た。 以上 の 加vf釘 ．D試 験 は 、 効 率 的 なPGPR候 補 菌 株 の 検 索 に お い て 指 標 に な る と 考 え ら れ た 。
4．フ タ バガ キ科 植物 と共 存 する 窒素 固定 鋼菌
こ れ ま で に 単 離 し た 全 菌 株 を ア セ チ レ ン 還 元 法 に よ る 検 定 試 験 に 供 し た 結 果 、191菌 株 の う ち12菌 株 に 窒 素 固 定 活 性 が 認 め ら れ 、 そ の う ち7菌 株 が3次 元 マ ト リ ッ ク ス と し て イ ネ 根 有 機 溶 媒 抽 出 物 残 渣 を 加 え た 半 流 動 ゲ ル 無 窒 素 培 地 で 高 い エ チ レ ン 生 成 能 を 示 し た。 これ らの う ち、Azospirillum spp. JW14，JW13お よ びBurkholderia sp. CK32の3株が 特に 高い 窒素 固定 能 を示 すこ とが 明 らか にな った 。一 方 、Enterobacter sp. FL13.2.1では、
先 の 菌 株 に 比 較 し て 若 干 、 活 性 が 弱 く 、 植 物 性 繊 維 マ ト リ ッ ク ス 存 在 下 で は 窒 素 固 定 能 を 示 さ な か っ た 。 こ れ ら 菌 株 のnifH遺 伝 子 に つ い てPCR増 幅 を 試 み 、Enterobacter sp.
FL13.2.1がも つnifH遺伝 子の 塩基 配 列を 明ら かに した 。
以 上 の 研 究 に よ っ て 、 フ タ バ ガ キ 芽 生 え 生 育 を 促 進 す る 根 圏 細 菌 群 を 同 定 す る こ と が で き た 。 芽 生 え の 苗 高 は 、 そ の 伸 長 効 果 が 森 林 伐 採 跡 地 へ の 移 植 後 に 苗 木 が 低 木 や 草 本 と の 生 育 競 争 に 打 ち 勝 つ こ と に 直 接 関 係 し て く る 要 因 で あ る と 考 え ら れ る こ と か ら 、 PGPR接 種 は 伐 採 跡 地 に 移 植 し た 芽 生 え の 生 存 率 向 上 に 役 立 っ と 考 え ら れ る 。 芽 生 え 伸 長 促 進 は 、 主 に 細 菌 に よ る 栄 養 素 の 獲 得 に よ る も の と 思 わ れ た 。 従 っ て 、 フ タ バ ガ キ の 根 面 細 菌 の 幾 つ か は 、 熱 帯 雨 林 再 生 を 目 的 とし た植 林の 際の 有 望なbioreforestation資 材 に な る 可 能 性 が 示 さ れ た 。
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学位論文 審査の要旨 主査
副査 副査 副査
助教授 教授 教授 助教授
橋 床 泰 之 田 原 哲 士 小 池 孝 良 玉 井 裕
学 位 論 文 題 名
ScreenlngofplantgrOWth― promotingrhiZObaCteriafrom DipterOCarpaCeaeplantSgrOWlnglnIndoneSlantropiCalrainforeStS， andinVeStigationSOftheirfunCtionSOnSeedlinggrOWth
（ イ ン ド ネ シ ア の 熱 帯 雨 林 に 自 生 す る フ タ バ ガ キ 幼 木 の 根 面 か ら フ タ バ ガ キ 実 生 の 生 育 を 促 進 す る 細 菌 類 の 検 索 と そ れ ら の 機 能 性 に 関 す る 研 究 ）
本 論 文 は 、 英 文93頁 、 図37、 表15、4章 か ら な り 、 参 考 論 文2編 が 付 さ れ て い る 。 フ タ バ ガ キ は 、 イ ン ド ネ シ ア を は じ め 東 南 ア ジ ア 熱 帯 雨 林 に 広 く 分 布 す る 、 主 要 な 高 木 樹 種 で あ り 、 高 い 経 済 的 価 値 を も つ 。 ま た 、 生 態 学 的 に も 重 要 な 位 置 を 占 め 、 熱 帯 林 生 態 系 の 生 物 多 様 性 を 支 え る 中 心 的 役 割 を 果 た し て い る 。 し か し な が ら フ タ バ ガ キ 苗 木 を 森 林 伐 採 跡 地 ヘ 移 植 し て も 、 そ の 活 着 率 は 著 し く 低 い と こ ろ で 留 ま る た め 、 フ タ バ ガ キ 林 再 生 に は 苗 木 生 存 率 を 高 め る 技 術 の 導 入 が 不 可 欠 で あ る と さ れ て い る 。 近 年 、 植 物 生 育 促 進 根 圏 微 生 物(Plant Growth Promoting曲izobacteria，PGPR)を 森 林 の 管 理 再 生 や 苗 木 生 産 に 応 用 す る 研 究 が 注 目 を 集 め て い る が 、 研 究 対 象 の 多 く は 温 帯 か ら 亜 熱 帯 の 針 葉 樹 に 限 ら れ て お り 、 熱 帯 雨 林 樹 種 、 特 に フ タ バ ガ キ の 実 生 の 生 育 を 促 進 す るPGPRの 検 索 ・ 研 究 は 全 く な さ れ て い な か っ た 。 本 研 究 で は 、 根 面 を 中 心 と し た フ タ バ ガ キ 表 面 か ら 付 着 細 菌 を 検 索 ・ 単 離 ・ 同 定 し て い る 。 それ らが フタ ノく ガ キ 実 生 の 生 育 促 進 に 及 ば す 効 果 を 実 生 ポ ッ ト 試 験 に て 検 定 し 、 以 下 の結 果を 得て いる 。 1． イ ン ド ネ シ ア の 熱 帯 雨 林 に 生 育 す る フ タ バ ガ キ と 共 存 す る 着 生 細 菌 の 検 索 、 分 離 、 お よ び 同 定
0．3％ ジ ェ ラ ン ガ ム で 半 流 動 化 さ せ た 、1％ ショ 糖を 含む 無窒 素窒Winogradsky s無 機 塩 培 地 を ト ラ ッ プ 用 培 地 と し て 用 い 、Carita，Bogor，Jasinga（ ジ ャ ワ ） お よ ぴNyaru Menteng，Palangkaraya（ カ リ マ ン タ ン ） で 採 取 し た フ タ バ ガ キ 科 植 物 の 根 面 、 根 圏 、 葉 面 、 種 子 表 面 由 来 細 菌 の 取 得 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 合 計191株 の 細 菌 を 分 離 し た 。 属 名 を 同 定 で き た 細 菌 株136株 の う ち 、 グ ラ ム 陰 性 細 菌 に 含 ま れ る ロ ― ッ− ，Qープ ロ テ オ バ ク テ リ ア が そ れ ぞ れ25％ 、22％ 、20％ を 占 め 、 低GCグ ラ ム 陽 性細 菌(bacilli） が 4％ に 過 ぎ な い こ と を 示 し た 。 こ の 検 索 結 果 か ら 、 フ タ バ ガ キ は 多 様 な 細 菌 を 保 持 し て い る こ と 、 ま た そ の 種 子 表 面 に はsphingomonadsを 高 頻 度 で 付 着 さ せ て い る こ と が 分 か り 、 植 物 と 共 存 す る 多 様 な 細 菌 を 検 索 す る 分 離 源 と し て 有 望 で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。
