博 士 （ 工 学 ） 呉 恆 良
学 位 論 文 題 名
Structure and Reactivity of Bio ― interface Studied by Atomic Force IVIicroscopy (AFIVI)
（バイ オインターフェースの構造と反応性―原子間力顕微鏡(AFM) による研究一）
学位論文内容の要旨
The bio‑membrane plays important roles in the living systems. A variety of biological and chemical reactions take place on the bio‑membrane interface and their reactivity is consid‑
erably affected by the surface structures of the membranes. A comprehensive elucidation on the relationship between the structure and reactivity on the bio‑interface at a molecular level is extremely important to understand and further control these life processes. In my Ph.D.
study, with respect to the issues mentioned above, the surface structures of various biologi‑
cal interfaces including the supported monolayers and bilayers which are used as models for the bio‑membranes have been investigated by atomic force microscope (AFM) together with other surface science techniques under various environments.
An outline of my Ph.D. thesis is given below:
Chapter l gives a brief introduction on the previous studies on the bio‑membranes and bio‑interfaces. After a general description of the structures and functions for the cells, our interests are focused on the bio‑membranes which play crucial roles in the life process of the cell. Several modem techniques used for in‑situ investigation on the bio‑membranes such as rr‑A isotherms, Brewster angle microscope, differential scanning calorimetry, fluo‑
rescence microscope, vibrational spectroscopy, sum frequency generation (SFG), and AFM, are shortly described with some application examples. Then, previous researches on the structures and reactivity on the bio‑membranes using these techniques, especially AFM, are concisely reviewed. Finally, the objectives and an outline of the present thesis are given.
Chapter 2 briefly describes the experimental instruments used in the Ph.D study in‑
cluding the Langmuir Blodgett (LB) techniques, AFM as well as infrared spectroscopy. The operation fundamentals and the experimental conditions for each technique in the study are given in details.
Chapter 3 presents in‑situ AFM study on the hydrolysis reaction of the phospholipids bilayers catalyzed by a phospholipase A2 (PLA2) enzyme. Based on the high catalytic se‑
lectivity of PLA2 toward L‑enantiomer phospholipids, five kinds of supported bilayers made of L‑ and D‑dipalmitoylphosphatidylcholines (DPPC), including L/L, L/D, D/L, D/D, and racemic LD/LD, were prepared on a mica surface with the gel‑phase, to explicate the ki‑
netics and mechanism of the enzyme‑induced hydrolysis reaction in detail. By introducing enzyme‑inactive D‑DPPC into the upper or bottom leaflets of the lipid bilayer, we are able to independently determine the dynamic structural changes in two leaflets during hydrolysis re‑
action. The present results demonstrate that the hydrolysis catalyzed by PLA2 preferentially
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occurs at the edges of pits or defects in the bilayer surface. The present kinetics analyses reveal that the lipid molecules in bottom leaflet flip up to top leafiet as soon as the L‑DPPC molecules in the upper leaflet hydrolyzed (induced flip‑flop process), much faster than the spontaneous flip‑flop process known for the lipid bilayer. Based on these AFM observation results on the lipid bilayers made of different combination of enantiomers, a novel kinetics model is therefore proposed to quantitatively account for the PLA2‑catalyzed hydrolysis of the supported phospholipid bilayers.
Chapter 4 shows the studies on Lhe temperature‑dependent phase transition processes of Lhe supported phospholipid bilayers by using AFM and SFG measurements. The mechanisms for the phase transition process of the supported lipid bilayer have been diseussed in a com‑
parison with free lipid vesicles in solution. The phase transition of the supported lipid bilayer takes place in a layer by layer fashion, i.e., the top layer melts frst before the bottom layer starts to melt. The interaction between lipids in the bottom leaflet and solid support surface significantly affect the phase transition behaviors. The full width at half maximum (FWHM) of the melted fraction determined by AFM and SFG for the phase transition region in the sup‑
ported lipid bilayer is much wider（〜lOoC) than that of the endothermic peak determined by differential scanning calorimetry (DSC) for the free lipid vesicles (0.20C) due to the same reason. Finally, the influences of the membrane proteins on the phase transition processes of the supported lipid bilayers are also investigated. The adsorption of a protein (PLA2) induces the different phase transition. Only the gel and liquid phases are present after the adsorption of the membrane protein, suggesting the instability of crack phase after protein adsorption.
Chapter 5 describes the structural studies on a cationic surfactant molecule, dioctade‑
cyldimethyl ammonium chloride (DOAC), which has been used as a synthetic model lipid molecule, due to its similar amphiphilic structures to phospholipids. The AFM observations are used to evaluate the morphologies of DOAC monolayers. The present results reveal that the surface morphologies of DOAC monolayers are substantially improved by mixing with a neutral lipid of stearyl alcohol in the monolayer or halide ions in the subphase. It sug‑
gests that the stearyl alcohol and halide ions have strong condensation effects on the DOAC molecules in the monolayer by shielding the repulsive interaction between their head‑groups and increasing the van der Waals interaction between the long hydrocarbon chains.
Chapter 6 summarizes the observed results and gives a general conclusion for the on the present Ph.D. study. Finally, a prospect for the future study is given.
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学位論文審査の要旨
主査 教授 幅崎浩樹 副査 教授 安住和久 副査 教授 長谷川靖哉
副査 教授 大澤雅俊（触媒化学研究センター）
副査 准教授 叶 深（触媒化学研究センター）
学 位 論 文 題 名
Structure and Reactivity of Bio‑interface Studied by Atomic Force IVIicroscopy AFIVI)
（バイオインターフェースの構造と反応性―原子間力顕微鏡(AFM) による研究一）
生 体 膜 の 表 面 で は ， 様 々 を 化学 ・ 生 化 学 反 応や 物 理 変 化 が起 こ り ， そ の反 応 活 性 や 物性 は 膜 の 表 面 構 造 と 組 成 に強 く 影 響 さ れて い る ， こ れら の プ ロ セ スを 理 解 し ． さ らに 有 効 に 制 御 ま た は 利 用 す る た め に は ， 分 子 レ ベ ル で 生 体 膜 界 面 に お け る 分 子 構 造 を 解 明す る こ と は 不 可 欠 であ る ． 申 請 者は 博 士 後 期 課程 に お い て ， ′ヾ イ オ イ ン ター フ ェー スにお ける構 造と反 応 性 の 関 係 の 総 合 的 な 理 解 を 目 指 し ， 高 い 空 間 分 解 能 を も つ 原 子 間 力 顕 微 鏡(AFM)を 用 い て ， 種 々 の 脂 質 分 子 やタ ン パ ク 質 から を る 疑 似 生体 膜 の 界 面 構造 を 分 子 レ ベ ルで 調 ベ ． 特 に 疑 似 生 体 膜 表 面 に お け る 酵 素 反 応 や 相 転 移 過 程 に つ い て 詳 細 に 研 究 し た ． 申 請 者 は ラ ン グ ミ ュ ア ・ ブ ロ ジ ェ ッ ト(LB)法 を 用 い ， 生 体 膜 の モ デ ル と し て 基 板 表 面 に 種 々 の 組 成 の 支 持 脂 質 二 分 子 膜 ま た は 単 分 子 膜 を 構 築 し た ． 特 に 酵 素 反 応の 立 体 選 択 性 を 利 用 し ， 脂 質 二 分 子膜 の 構 造 を 設計 し ， 異 を った キ ラ ル 構 造を も つ 疑 似 生 体膜 を 構 築 し ， よ り 厳 密 に 酵 素 反 応 の活 性 と 反 応 機構 を 議 論 す るこ と が で き た． ま た ， セ ッ トア ッ プ と 溶 液 セ ル 設 計 の 改 良 を 繰 り 返 し ， 温 度 可 変 の 条 件 下 で の そ の 場AFM観 測 を 実 現 し た ， こ の 手 法 は ， 今 後 の バ イ オ イ ンタ ー フ ェ ー スで の 反 応 性 の解 明 に 向 け て。 さ ら を る 応 用が 期 待 さ れ る も の であ る （ 第2章） ．
申 請 者 は 生 体 膜 の 骨 格 分 子 と を る り ン 脂 質 分 子 の 不 斉 炭 素 に 接 す る エス テ ル 結 合 の加 水 分 解 反 応 を 触 媒 で き る 酵 素 で あ る ホ ス ホ リ パ ー ゼA2 (PLA2)に 着 目 し ， 脂 質 二 分 子 膜 表 面 で の 酵 素 反 応 に つ い て詳 細 に 調 べ た， 対 称 構 造 をも つ 脂 質 二 分子 膜 は 本 来 。 膜の 上 下 層 の 反 応 を 区 別 す る こ と が 困 難 で あ る が ， 申 請 者 は ， 立 体 配 置 がL型 脂 質 分 子 の み と 触 媒 作 用 す る 該 酵 素 の 立 体 選 択 の 特 性 を 利 用 し ，I丿L型 二分 子 膜 の ほ かに ， 触 媒 活 性が を いD型 分子 と の 組 み 合 わ せ でL/D，D/L，D/D及 び ラ セ ミ 型LD/LD等 の 支 持 脂 質 二 分 子 膜 を 構 築 し ， 加 水 分 子 反 応 に 伴 う 膜 表 面 の 分 子 構 造 の 変 化 に つ い てAFMに よ り そ の 場 で 観 察 し 、 膜 の 上 下 層 の 反 応 活 性 に つ い て定 量 的 に 議 論で き る よ う にを っ た ． こ の加 水 分 解 反 応 は， 膜 の 欠 陥 サ イ ト の エ ッ ジ サ イ ト で 進 行 し ， 加 水 分 解 生 成 物 が 基 板 か ら 脱 離 す る こ と がAFM観 察 で 明
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ら か に し た ． こ れ ら のAFM測 定 結 果 に 基 づ き ， 酵 素 反 応 の 反 応 速 度 論 的 解 析 を 試 み ， 酵 素 に よ る 加 水 分 解 反 応 の ほ か に っ り ン 脂 質 分 子 の 自 発 的 フ リ ッ プ ・ フロ ッ プ 運 動 と表 面 層 分 子 の 加 水 分 解 に 伴 う 誘 導 フ リ ッ プ 運 動 を 考 慮 し た 上 ， 酵 素 反 応 の 各反 応 過 程 の 速度 定 数 を 決 定 し た （ 第3章 ） ．
申 請 者 は こ れ ら の 支 持 脂 質 二 分 子 膜 の 相 転 移 過 程 に つ い て 調 ベ ， 融 点 近 く で鋭 い 相 転 移 過 程 を 示 す 脂 質 ベ シ ク ル 系 と 比 ベ ， 相 転 移 が 広 い 温 度 範 囲 に 及 ぶ こと を 観 測 し た． 温 度 上 昇 と と も に ， 支 持 脂 質 二 分 子 膜 の 表 面 層 か ら 一 層 ず つ 溶 け ， バ ル ク脂 質 の 融 点 近く に お い て 二 層 目 の 溶 け 始 め る こ と がAFM測 定 に よ っ て 観 測 さ れ た ． 完 全 を 固 相 ， 液 相 状 態 の ほ か に ， 固 相 と 液 相 が 共 存 す る ク ラ ッ ク 相 が 支 持 脂 質 二 分 子 膜 の 相 転 移過 程 に 確 認 され た ． さ ら に ，AFM測 定 に よ っ て 得 ら れ た 各 層 の 融 解 割 合 から ， 上 下 各 層 の融 解 熱 を 見 積も っ た ， 一 方 ， 膜 タ ン パ ク 質 を 導 入 する こ と に よ り ，ク ラ ッ ク 相 が観 測 で き な くを っ た ． 支 持脂 質 二 分 子 膜 の 相 転 移 過 程 は 基 板 や 膜 タ ン パ ク 質 と の 相 互 作 用 に よ っ て 大 きく 影 響 さ れ るこ と を 明 ら か に し た （ 第4章 ） ．
申 請 者 は 人 工 脂 質 分 子 で あ る 四 級 ア ン モ ニ ウ ム 表 面 活 性 剤 の 単 分 子 膜 の 表 面 形 状 を AFM測 定 に よ り 検 討 し た ． サ ブ フ ェ ー ス に ハ ロ ゲ ン 化 物 イ オ ン が 存 在 す る 場 合 ， 単 分 子 膜 の 密 度 増 加 と 平 坦 さ の 改 善 が 得 ら れ た ． 一 方 、 中 性 脂 質 分 子 で あ る1‑オ ク タ デカ ノ ー ル と の 混 合 に お い て ， 単 分 子 膜の 表 面 に 相 分 離が 見 ら れ た が， 全 体 と し て膜 表 面 が 非 常に 平 坦 に を る こ と がAFM測 定 か ら 観 測 さ れ た ． こ れ ら の 結 果 に よ り ． 単 分 子 膜 内 に お け る 四 級 ア ン モ ニ ウ ム 表 面 活 性 剤 分 子 同 士 の 末 端 官 能 基 の 静 電 的 反 発 相 互 作 用 と疎 水 鎖 間 の フア ン デ ル ワ ー ル ス 相 互 作 用 が 単 分 子 膜 の 表 面 構 造 に 大 き を 影 響 を 及 ば す こ と を 明 ら か に し た （ 第5 章 ） ．
こ れ を 要 す る に ， 著 者 は 界 面 敏 感 毅AFM測 定 を バ イ オ イ ン タ ー フ ェ ー ス の 界 面 分 子 構 造 の 解 析 に 応 用 し ， 生 体 膜 表 面 に お け る 酵 素 反 応 や 相 転 移 反 応 を 分子 レ ベ ル で 捉え る こ と に 成 功 し た ． 本 研 究 は ， この 分 野 の 基 礎 科学 の 進 展 の みを ら ず ， 応 用研 究 で も 重 要な イ ン パ ク ト を 与 え る も の で あ り ，界 面 化 学 及 び 界面 制 御 工 学 分野 の 進 展 に 資す る と こ ろ 大で あ る ． よ っ て ， 著 者 は ， 北 海 道 大 学 博 士 （ 工 学 ） の 学 位 を 授 与 さ れ る 資 格 あ る も のと 認 め る ．
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