博 士 （ 農 学 ） 石 本 学 位 論 文 題 名
アブラナ科植物と微生物の相互作用に関する研究 学位論文内容の要旨
洋
近年、 植物防 疫にお いて環 境への 負荷の軽減を目指した微生物利用技術が脚光を浴びているが、植物病原 菌を抑制する目的で市販の微生物資材を利用しても、期待した効果が現れないことが少なくない。これらは、
資材中 の微生 物の植 物根圏へ の定着 や根圏での生態に関する、微生物を利用するために必要な基礎的知識の 不足に よるも のと判 断され、 このよ うな知識の蓄積が、より効果的な微生物利用技術の開発に極めて重要で あると考えられる。
そこで 本研究 では、 アブラ ナ科植 物を例にとり、根圏微生物が植物の二次代謝産物によって受ける影響、
根圏徽 生物が 植物の 生体防御 に対し て与える効果、宿主植物の特徴的な二次代謝産物を代謝する能カが根圏 微生物に与える影響に関する基礎的な知見を得ることを目的とした。
1．アプラナ科植物の二次代謝産物による根圏微生物の選抜
セイヨ ウアブ ラナ、 カラシ ナ、キ レハイ ヌガラ シ、コシ ョウソ ウの4種のアブラナ科植物の根面および根 内に高 頻度に 生息し ている 糸状菌 として、 根面からは、植物の分泌物に依存して生育する微生物を分離する ためのSurvival Methodを新しく考案し、Rhizopus属糸状菌を分離した。また、根内からはFusarium属糸状菌 を分離 した。 これら の分離 糸状菌 株と、非 アブラナ科植物からの分離糸状菌株を用いて、アブラナ科植物由 来の抗 菌物質 に対す る耐性 を比較 検討した 。その結果、Rhizopus属糸状菌は分離源にかかわらずアブラナ科 植物の 抗菌物 質に対 して耐 性を示 したが、Fusarium属糸状菌ではアブラナ科植物由来の分離菌株の方が非ア ブラナ 科植物 由来の 分離菌 株より も高い酎 性を示した。Rhizopus属、Fusarium屑ともにアブラナ科植物由来 の抗菌 物質に 対して 耐性を もった 菌株がア ブラナ科植物の根圏から高頻度で分離されたことから、アブラナ 科植物 の根圏 では宿 主植物 の二次 代謝産物 （抗菌物質）による根圏微生物の選抜が起こっているものと結論 した。
次に、 アブラ ナ科植 物の抗 菌物質 に対す る耐性を調ぺた菌株について、アブラナ科植物の特徴的な二次代 謝産物であるglucosinolate（抗菌物質の前駆体）をisothiocyanate（抗菌物質）に加水分解するmyrosinase活性 の有無 の検討 したと ころ、Rhizopus属糸 状菌ではセイヨウアプラナ根面から分離したBn‑R‑l‑I株、Fusarium 属糸状 菌では コショ ウソウ根内から分離したLs‑F‑in‑4‑1株にそれぞれ活性が見られた。これらの菌株はアブ ラナ科 植物の 抗菌物 質に対 して高 い耐性を もつことから、アプラナ科植物の根圏において宿主植物から放出 されるglucosinolateを積極的にisothiocyanateに加水分解し、自身はあまり阻害を受けずに周りの他の微生物 の生育を抑える「武器」として利用しているものと考えられた。
2．根圏定着性Fusarium属糸状菌による宿主植物の病原抵抗性の上昇
アブ ラナ科 植物の 根圏に おいて 優占的に生息していると考えられたRhizopus属およびFusarium属の糸状菌 が 植 物にど のよう な影響 を与えて いるか を調べ るため に、コ ショウ ソウに 立枯れ を起こす 病原菌Pythium H Uimumとの共接種試験を行った。この結果、キレハイヌガラシ根内から分離したFusarium属糸状菌Rs‑F‑in‑II
‑ 82 ‑
株とP． ultimumを 共接種した区ではコショウソウの病原抵抗性が上昇したが、キレハイヌガラシ根面から分離 したRhizopus属糸状 菌Rs‑Rー11株にはこのよう な効果は見られなかった。次 に、接種するFusarium属糸状菌 のmyrosinase活性の 有無によって宿主植物に対 する病原抵抗性の誘導に差が あるかどうかを検討した。その 結果、myrosinase活性のあるLs‑F‑in‑4‑I株共接種区およびmyrosinase活性のないRs‑F‑inー11株共接種区の双方 でコショウソウの生 存率が上昇し、両共接種区 間に効果の大きな差は見られ なかった。このFusarium属糸状 菌の接種による病原 抵抗性の上昇がどのような メカニズムによるものかを調 べるために、コショウソウ地下 部に含まれる主要な抗菌物質であるbenzyl isothiocyanate (1)とその前駆体であるglucotropaeolln（2）の定量を行 ったところ、無接種 区では約0．10pg/mg新鮮重 であったben別isothiocy卸aleの量が、myrosinaSe活性菌Ls‐ F‐in4ー1株接種区では0．25pg′mg、mymsinase不活性菌Rs‐F‐in−tl株接種区では0．20pg/mgと増加しているこ とが分かった。また 、無接種区では地下部にお けるglucotropaeoIinの量は 約3．0pg/mg新鮮重であったが、
h‐F‐in4‐1株接種区では4．7pg′mg、Rs一F−in＾11株接種区では3，6ug/mgと増加していた。Glucotmpaeolin量の 上昇がさほど大きく なかったRsーF‐in‐11株接種区でも有意にコショウソウの生存率が上昇することから、抵 抗性の上昇にはんJロHHm属糸状菌の接種による コショウソウ地下部でのbenzyliS0thiocyanate量の上昇がより 大きく関与しているものと考えられた。
3． Myrosinase活性微生物のアプラナ科植物根圏への定着
植物 根圏 におけるmyrosinase活性菌の分布を調べるた めに、水中分画法によって採 集した4種のアブラナ 科植物およ び5種の非アブラナ科植物の 根圏土壌希釈水を接種源とし て根圏微生物を混合培養し、myrosinase 活性を検討 したが、全ての植物の根圏土 壌微生物の混合培養区に活性が確認されたことから、myrosinase活性 をもつ微生 物は広く植物の根圏に存在し ていると考えられた。ー方、myrosinaseによる加水分解を受けること により黄色 の呈色を示す試薬DNPT(2，4‑dinitrophenyl―1―thio‑ p‑D‑glucopyranoside)を用いた一次スクリ ーニングを 行い、DNPT代謝能の見られた 菌株についてmyrosinase活 性の有無を検討した結果、アブラナ科植 物 由来 の菌 株で はDNPT代謝 能の 見 られ た10菌株 のう ち 、6菌 株にmyrosinase活性が 確認されたが、非アブ ラ ナ科 植物 植物 由 来の 菌株 では 、DNPT代謝 能の 見ら れ た15菌株のうち、3菌株しかmyrosiaase活性が確認 さ れず 、myrosinase活 性菌 はア ブ ラナ 科植 物の 根圏 に より 高い 頻度 で分 布 して いる ものと考えられた。
最後に、myrosinase活性をもつ微生物 が実際にアブラナ科植物の根圏に定着し、優位に生育できるかどうか を検討する ために、農場で採取した土壌にmyroslnase活性菌Ls‑F‑in‑4‑．1株を接種し、この土壌を入れたプラ ン タ ー で30日 間 生 育 さ せ た コ ショ ウソ ウと レ タス の根 面微 生物 を 可能 な限 り分 離 し、 全分 離菌 株中 の myrosinase活性菌の出現率を比較した。その結果、myrosinase活性菌Ls‑F‑in‑4‑1株無接種ではコショウソウ根 面で13%、レ タス根面で149'oと、ともに 同じくらいの出現率であっ たが、Ls‑F‑in‑4‑1株接種区ではコショウ ソウ根面で23010、レタス根面で17%と、コショウソウ根面の方が出現率が高くなった。Glucosinolateを添加し た寒天平板上での対峙培養試験では、glucosinolateの存在下においてのみmyrosinase活性菌Ls‑F‑in‑4‑1株によ るP． ultimumの生育の抑制が観察されたこととあわせて考えると、アブラナ科植物根圏におぃてはmyrosinase 活性菌が宿主植物の根に由来するglucosinolateを加水分解し、P．uLtimumのようなisoLhiocyanate感受性の微生 物の生育を抑え、優占的に生育しているものと考えられた。
―83 ‑
以上のように、ア ブラナ科植物の根圏では、＠植物の二次代謝産物による根圏微生物の選抜が起きている、
◎優占的に生育する 微生物の中には、植物の生体 防御に関与するものが存在 する、◎植物の二次代謝産物を 利用し、根圏におい て優位に生息する微生物が存 在する、ことが分かった。 これらの知見を基礎として、よ り効果的な微生物資 材の開発が可能になるものと 期待される。
glucotropaeolin (2) benzyl isothiocyanate (1)
‑ 84―
HO D OH + S042‑
HO glucose
学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
アブラナ科植物と微生物の相互作用に関する研究
本 論 文 は 、 和 文
96
頁 、 図32
、 表31
、6
章 か ら な り 、 他 に 参 考 論 文1
編 が 付 さ れ て い る 。近 年 、 植 物 防 疫 に お い て 環 境 へ の 負 荷 の 軽 減 を 目 指 し た 微 生 物 利 用 技 術 が 脚 光 を 浴 び て い る が 、 植 物 病 原 菌 を 抑 制 す る 目 的 で 微 生 物 資 材 を 用 い て も 、 期 待 し た 効 果 が 現 れ な い こ と が 少 な く ぬ い 。 こ れ ら は 、 当 該 微 生 物 を 利 用 す る た め に 必 要 な 植 物 根 圏 へ の 定 着 性 や 根 圏 で の 生 態 に 関 す る 基 礎 的 知 識 の 不 足 に よ る も の と 判 断 さ れ 、 こ の 種 の 知 識 の 蓄 積 が 、 よ り 効 果 的 な 微 生 物 利 用 技 術 の 開 発 に 極 め て 重 要 と 考 え ら れ る 。
著 者 は 、 ア プ ラ ナ 科 植 物 を 例 に 、 根 の 分 泌 物 に 依 存 し て 生 育 す る 微 生 物 の 分 離 法 や 、 ア プ ラ ナ 科 植 物 の 特 徴 的 代 謝 産 物 カ ラ シ 油 配 糖 体 の 加 水 分 解 酵 素 で あ る
myrosinase
活 性 発 現 微 生 物 の ス ク リ ー ニ ン グ 法 を 考 案 、 応 用 し て 根 圏 微 生 物 が 植 物 の 二 次 代 謝 産 物 に よ っ て 受 け る 影 響 、 根 圏 微 生 物 が 植 物 の 生 体 防 御 に 対 し て 与 え る 効 果 、 宿 主 植 物 の 特 徴 的 な 二 次 代 謝 産 物 を 代 謝 す る 能 カ が 根 圏 微 生 物 に 与 え る 影 響 を 解 析 し 、 以 下 の 結 果 を 得 て い る 。1
． ア プ ラ ナ 科 植 物 の 二 次 代 謝 産 物 に よ る 根 圏 微 生 物 相 の 制 御ア プ ラ ナ 科 植 物 セ イ ヨ ウ ア プ ラ ナ 、 カ 云 シ ナ 、 キ レ ハ イ ヌ ガ ラ シ 、 コ シ ョ ウ ソ ウ の 根 面 お よ び 根 内 に 高 頻 度 に 生 息 し て い る 糸 状 菌 と し て 、 根 面 か ら は
Rhizopus
属 菌 を 、 根 内 か ら はFusarium
属 菌 を 分 離 し た 。 こ れ ら の 分 離 菌 株 と 、 非 ア プ ラ ナ 科 植 物 か ら の 分 離 糸 状 菌 株 を 用 い て 、 ア プ ラ ナ 科 植 物 由 来 抗 菌 物 質 の カ ラ シ 油 類 に 対 す る 耐 性 を 比 較 し た 結 果 、Rhizopus
属 糸 状 菌 は 分 離 源 に か か わ ら ず 耐 性 を 示 し た が 、Fusarium
属 糸 状 菌 で は ア プ ラ ナ 科 植 物 由 来 の 分 離 株 が 他 科 植 物 由 来 の 菌 株 よ り 高 い 耐 性 を 示 し た 。Rhizopus
属 、Fusarium
属 と も に ア プ ラ ナ 科 植 物 の 抗 菌 物 質 に 対 し て 耐 性 の 高 い 菌 株 が ア ブ ラ ナ 科 植 物 の 根 圏 か ら 高 頻 度 で 分 離 さ れ た こ と か ら 、 ア ブ ラ ナ 科 植 物 の 根 圏 で は 宿 主 植 物 の 二 次 代 謝 産 物 （ 抗 菌 物 質 ） に よ る 根 圏 微 生 物 の 選 抜 が 起 こ っ て い る も の と 結 論 し た 。 次 に 、 分 離 菌 のmyrosinase
活 性 の 有 無 を 調 べ た と こ ろ 、Rhizopus
属 糸 状 菌 で は セ イ ヨ ウ ア プ ラ ナ 根 面 か ら 分 離 し たBn‑R‑l‑l
株 、Fusarium
属 糸 状 菌 で は コ シ ョ ウ ソ ウ 根 内 か ら 分 離 し たFusarium oxysporum
に そ れ ぞ れ 活 性 が 見 ら れ た 。 こ れ ら は ア プ ラ ナ 科 植 物 の 抗 菌 物 質 に 対 し て 高 い 耐 性 を も つ こ と か ら 、 ア プ ラ ナ 科 宿 主 植 物 か ら 放 出 さ れ る カ ラ シ 油 配 糖 体 を 積 極 的 に カ ラ シ 油 に 加 水 分 解 し 、 自 身 は あ ま り 阻 害 を 受 け ず に 周 り の 他 の 微 生 物 の 生 育 を 抑 え る 「 武 器 」 と し て 利 用 し て い る も の と 考 え ら れ た 。士 彦
治
哲 照
幸
原 原
士
田 吉
福
授 授
師
教 教
講
査 査
査
主 副
副
2
．根圏定着性Fusarium属糸 状菌による宿主植物の病原抵抗性の上昇ア プ ラ ナ 科 植 物 の 根 圏 で 優 占 的 に 生 息 し て い る
Rhizopus
属 あ る い はFusarium
属 の 糸 状 菌 と 立 枯 れ 病 原菌Pythium ulti'mum
の相 互 関係 を調 ぺる ため 、コ ショ ウソ ウに 共接 種を 行っ た。キ レ ハイ ヌガ ラシ 根内 から分離したFusarium rruワ
niliforme
とP．ultimum
を共接種 した区ではコ シ ョ ウ ソ ウ の 病 原 抵 抗 性 が 上 昇 し た が 、 同 植 物 の 根 面 か ら 分 離 し たRhizopus oryzae
は 効 果 が 見 ら れ な か っ た 。 ま た 、 非 病 原 性Fusarium
属 菌 の 接 種 に よ る コ シ ョ ウ ソ ウ の 病 原 抵 抗 性 の 亢 進 にmyrosinase
活 性 の 有 無 が 直 接 に は 関 係 な い こ と を 、 上 記Fmoniliforme (myrosinase
活 性 な し ） とF oxysporum (myrosinase
活 性 有 り ） を 用 い た 比 較 実 験 で 明 ら か に し た 。 こ のFusarium
属 菌 の 接 種 に よ る 病 原 抵 抗 性 の 上 昇 の メ カ ニ ズ ム を 探 る た め コ シ ョ ウ ソ ウ 地 下 部 に 含まれる主要な抗菌物質であるbenzyl isothiocyanate (1)とその前駆体であるglucotropaeoli
む く2
） の 定 量 を 行 っ た と こ ろ 、 無 接 種 区 で は 約O
．10
雌 沺 培 新 鮮 重 で あ っ た 化 合 物1
が 、F D
づ 叩D
川m
接 種 区 で は0
．25
鵬 ′q
、Fm
弸fZ
め ′7孵接 種区 では0
．20噛′mg
と 有意 に増 加し てい た 。 ま た 、 配 糖 体 （2
） の 量 も 両 菌 の 接 種区 で増 加傾 向は 見ら れた が抵 抗性 亢進 との 相関 は明 ら か で は な く 、 抵 抗 性 の 上 昇 に はF
仏 ロn
黼 属 糸 状 菌 の 接 種 に よ る コ シ ョ ウ ソ ウ 地 下 部 で の カ ラ シ 油 （1
） の 量 の 上 昇 が よ り 大 き く 関 与 し て い る も の と 考 え ら れ た 。3
．Myms
血齢活性微生物のアプ ラナ科植物根圏における分布と定着性水 中 分 画 法 に よ っ て 採 集 し た
4
種 の ア プ ラ ナ 科 植 物 お よ び5
種 の 非 ア ブ ラ ナ 科 植 物 の 根 圏 土 壌 希 釈 水 を 接 種 源 と し て 混 合 培 養 し た 場 合 は 、 全 て の 区 分 で カ ラ シ 油 配 糖 体 の ひ と つsinj
餌n
が 加 水 分 解 さ れ た こ と よ り 、 卿 ′rosinase
活 性を 持つ 微生 物は 植物 の根 圏に 広く 分布 し て い る と 考 え ら れ た 。 一 方 、myrosmase
お よ び そ の 他 の 一 部 の 酵 素 で 加 水 分 解 さ れ て 黄 色 の 呈色 を示 す試 薬Dl們（214面mtrc叫le11yl11
心。サひ餌ucppy眦0
虹de
）を用いた 一次スクリー ニ ン グ を 行 い 、 瑚 岬T
分 解 能 の あ る 菌 株 に つ い てs
尚g
ぬ 分 解 活 性 の 有 無 を 調 ぺ た 結 果 、 ア ブ ラ ナ 科 植 物 由 来 の 菌 株 で はDM
叩 代 謝 能 の 見 ら れ た10
菌 株 の う ち 、6
菌 株 に 、 非 ア プ ラ ナ 科 植 物 植 物 由 来 の 菌 株 で は 、 同15
菌 株 の う ち 、3
菌 株 し かmyrosinase
活 性 が 確 認 さ れ ず 、q
闘sinaSe
活 性 菌 は ア プ ラ ナ 科 植 物 の 根 圏 に よ り 高 い 頻 度 で 分 布 し て い る こ と が 分 か っ たMyros
血 齢 活 性 を も つ 微 生 物 が 実 際 に ア プ ラ ナ 科 植 物 の 根 圏 に 定 着 し 、 優 位 に 生 育 で き る か ど う か を 検 討 す る た め に 、 農 場 で 採 取 し た 土 壌 に 恥 恥s
泣aSe
活 性 菌F
鍬 ッ 甲D
― を 接 種 し コ シ ョ ウ ソ ウ と レ タ ス を30
日 間 生 育 さ せ 根 面 ・ 根 内 微 生 物 を 可 能 な 限 り 分 離 し 、 全 分 離 菌 株 中 のq
伽sin
慾e
活 性 菌 の 出 現 率 を 比 較 し た 。 そ の 結 果 、 無 接 種 区 の コ シ ョ ウ ソ ウ 根 面 で は13
ワ 。 、 レ タ ス 根 面 で14
％ と 、 と も に 同 じ く ら い の 出 現 率 であ った が、 接種 区で はコ シ ョ ウ ソ ウ は23
％ 、 レ タ ス は17
％ と 、 ， コ シ ョ ウ ソ ウ の 方 が 高 い 傾 向 が 見 ら れ た 。ま た 、 対 峙 培 養 で は 、 カ ラ シ 油 配 糖 体 を 添 加 し た 寒 天 平 板 上 で の み
nlyrosmase
活 性 菌 に よ っ てP
． 心 洳Hm
の 生 育 抑 制 が 観 察 さ れ た 。 こ れ ら を 総 合 し て 考 え る と ア プ ラ ナ 科 植 物 根 圏 で はmyrosin
諮e
活 性 菌 が 宿 主 植 物 由 来 の カ ラ シ 油 配 糖 体 を 加 水 分解 し、P
．M
ぬ咒 黼の よう な カ ラ シ 油 感 受 性 の 微 生 物 の 生 育 を 抑 え 、 優 占 的 に 生 育 し て い る も の と 考 え ら れ た 。R =
