ア ル ツ ハ イ マ ー 病 関 連 遺 伝 子 T R E M 2 の 発 現 を 制 御 す る ス プ ラ イ シ ン グ 因 子 の 同 定
I d e n t i f i c a t i o n o f S p l i c i n g F a c t o r s t h a t R e g u l a t e t h e E x p r e s s i o n o f t h e A l z h e i m e r ’ s D i s e a s e- A s s o c i a t e d G e n e T R E M 2
平 成 3 0 年 度 入 学 柳 津 茂 慧 （Y a n a i z u , M o t o a k i） 指 導 教 員 紀 嘉 浩
認 知 症 の 原 因 疾 患 と し て 頻 度 が 最 も 高 い ア ル ツ ハ イ マ ー 病
（ A l z h e i m e r ’ s d i s e a s e : A D ） は 、 ア ミ ロ イ ドペ プ チ ド の 凝 集 で 形 成 さ れ た 老 人 斑 と 、過 剰 リ ン 酸 化 タ ウ タ ン パ ク 質 の 凝 集 で あ る 神 経 原 線 維 変 化 に よ っ て 特 徴 づ け ら れ る 。A D は 、 家 族 性 A D と 孤 発 性 A D に 分 け ら れ る が 、 殆 ど の A D 患 者 は 孤 発 性 で あ る 。 近 年 、 孤 発 性 A D の 発 症 リ ス ク 因 子 と し て 注 目 さ れ て い る の が A D 感 受 性 遺 伝 子 で あ る 。 そ の 例 と し て 、A P O E 遺 伝 子 の4 対 立 遺 伝 子 は 孤 発 性 A D の 発 症 リ ス ク を 最 も 増 大 さ せ る 。 ま た 、2 0 1 3 年 に は T R E M 2 遺 伝 子 の 一 塩 基 多 型 が A P O E に 次 ぐ 孤 発 性 A D の 発 症 リ ス ク 増 大 因 子 で あ る こ と が 報 告 さ れ 、 注 目 を 集 め て い る 。
T R E M 2 は ミ ク ロ グ リ ア や マ ク ロ フ ァ ー ジ に 受 容 体 タ ン パ ク 質 と
し て 発 現 し 、こ れ ら の 細 胞 の 機 能 調 節 因 子 と し て 中 心 的 な 役 割 を 果 た す 。T R E M 2 は 脂 質 、A P O E、 ア ミ ロ イ ドな ど と 結 合 し 、A D に 加 え て 肥 満 や が ん と の 関 連 も 報 告 さ れ て い る 。従 来 の T R E M 2 に 関 す る 研 究 は T R E M 2 自 体 の 機 能 解 析 を 中 心 に 展 開 さ れ て お り 、
T R E M 2 の 発 現 制 御 因 子 や 制 御 機 構 に 関 す る 知 見 は 乏 し い 。
私 は 、 修 士 課 程 時 に T R E M 2 e x o n 3 が ス キ ッ プ し た m R N A を 発 見 し 、 こ の m R N A が ナ ン セ ン ス 変 異 依 存 m R N A 分 解 機 構 （N M D） に よ っ て 分 解 さ れ て い る こ と 、e x o n 3 の 選 択 的 ス プ ラ イ シ ン グ が
T R E M 2 タ ン パ ク 質 の 発 現 レ ベ ル を 調 節 す る こ と を 見 出 し た 1 )。 一
般 的 に 、 選 択 的 ス プ ラ イ シ ン グ は R N A 結 合 タ ン パ ク 質 （R B P） に よ っ て 調 節 さ れ て い る 。T R E M 2 e x o n 3 の 選 択 的 ス プ ラ イ シ ン グ を 制 御 す る R B P は T R E M 2 タ ン パ ク 質 発 現 量 の 調 節 を 通 じ て ミ ク ロ グ リ ア や マ ク ロ フ ァ ー ジ の 機 能 制 御 お よ び A D の 病 態 に 関 わ る 可 能 性 が あ る 。そ こ で 本 研 究 で は T R E M 2 e x o n 3 の 選 択 的 ス プ ラ イ シ ン グ 制 御 因 子 の 同 定 と そ の 制 御 機 構 の 解 明 を 目 的 と し た 。
1 . T R E M 2 e x o n 3 の ス プ ラ イ シ ン グ 因 子 の 探 索
T R E M 2 ス プ ラ イ シ ン グ 制 御 の 候 補 因 子 と し て ミ ク ロ グ リ ア に 発
現 す る も の 、 各 種 神 経 変 性 疾 患 と 関 連 が あ る も の を 含 む 3 4 の R B P を 選 定 し た 。全 長 T R E M 2 タ ン パ ク 質 の コ ー ド 領 域 お よ び i n t r o n を 含 む T R E M 2 m i n i g e n e と R B P 発 現 ベ ク タ ー を H E K 細 胞 に 共 発 現 さ せ 、e x o n 3 の ス プ ラ イ ス パ タ ー ン を 検 出 し た 。複 数 の R B P が e x o n 3 の ス プ ラ イ シ ン グ を 変 化 さ せ た が 、そ の 中 で も 最 も 顕 著 に e x o n 3 の ス キ ッ プ を 促 進 し た C E L F 1 と C E L F 2 に 注 目 し た （ 図 1）。
2 . C E L F 2 は T R E M 2 e x o n 3 の ス キ ッ プ を 介 し て T R E M 2 タ ン パ ク 質 の 発 現 量 を 減 少 さ せ る
T R E M 2 タ ン パ ク 質 の 発 現 量 が e x o n 3 の 選 択 的 ス プ ラ イ シ ン グ に よ っ て 調 節 さ れ る こ と か ら 、C E L F 1
と C E L F 2 に よ る e x o n 3 の ス キ ッ プ は T R E M 2 タ ン パ ク 質 の 発 現 量 を 減 少 さ せ る こ と が 考 え ら れ た 。 実 際 に 、T R E M 2 タ ン パ ク 質 は C E L F 1 と の 共 発 現 に よ っ て 減 少 す る 傾 向 に あ り 、C E L F 2 で は 有 意 な 減 少 を 示 し た （ 図 2 A）。
次 に 、s i R N A に よ る C E L F 1、C E L F 2 の 発 現 抑 制 時 に お け る T H P - 1 内 在 性 T R E M 2 e x o n 3 の ス プ ラ イ ス パ タ ー ン を 検 討 し た 。N M D に よ る 分 解 の た め 、 T H P - 1 で は e x o n 3 が ス キ ッ プ し た
m R N A の 検 出 が 特 に 困 難 で あ る 。そ こ
で s i R N A に 加 え て N M D の 阻 害 剤 で
あ る c y c l o h e x i m i d e で 処 理 し た 。 そ の 結 果 、C E L F 1 と C E L F 2 を 同 時 に 発 現 抑 制 し た 際 に e x o n 3 の ス キ ッ プ が 減 少 し た （ 図 2 B）。 こ れ ら の 結 果 か ら 、 C E L F 1、C E L F 2 は e x o n 3 の ス プ ラ イ シ ン グ を 制 御 し 、T R E M 2 タ ン パ ク 質
の 発 現 量 を 減 少 さ せ る こ と が 考 え ら れ た 。 し か し 、C E L F タ ン パ ク 質 は ス プ ラ イ シ ン グ 以 外 に も 翻 訳 や m R N A 分 解 な ど 種 々 の R N A 代 謝 の 過 程 を 制 御 す る 。そ こ で 、C E L F 1、C E L F 2 に よ る T R E M 2 タ ン
パ ク 質 の 発 現 量 変 化 が 実 際 に e x o n 3 の ス プ ラ イ シ ン グ を 介 し て い る か を 検 討 し た 。 ま ず 、i n t r o n を 含 ま な い T R E M 2 発 現 ベ ク タ ー
（C D S T R E M 2） を 作 製 し 、C E L F に よ る 影 響 を 検 証 し た 。 そ の 結
果 、T R E M 2 タ ン パ ク 質 の 発 現 量 に 変 化 は 見 ら れ ず 、C E L F に よ る
制 御 に は i n t r o n が 必 要 で あ る こ と が 判 っ た（ 図 3 A）。さ ら に 、i n t r o n 2 と i n t r o n 3 を 含 み 、e x o n 3 の み が ス プ ラ イ シ ン グ さ れ る m i n i g e n e ( T R E M 2 e x 3 - s p m i n i g e n e） に お け る e x o n 3 の ス キ ッ プ は 、C E L F 2 で の み 有 意 に 促 進 さ れ 、T R E M 2 タ ン パ ク 質 の 発 現 量 は こ れ に 伴 い 減 少 し た（ 図 3 B、C）。従 っ て 、C E L F 2 は e x o n 3 の ス キ ッ プ を 促 進
さ せ T R E M 2 タ ン パ ク 質 の 発 現 量 を 減 少 さ せ る こ と が 示 唆 さ れ た 。
3 . T R E M 2 e x o n 3 の 選 択 的 ス プ ラ イ シ ン グ に は 種 差 が あ る E x o n 3 の 選 択 的 ス プ ラ イ
シ ン グ の 保 存 性 を 検 討 す る た め に 、マ ウ ス 、ア フ リ カ ミ ド リ ザ ル の T r e m 2 e x o n 2 か ら e x o n 4 の m i n i g e n e を 作 製 し 、ヒ ト と 比 較 し た 。ア フ
リ カ ミ ド リ ザ ル T r e m 2 e x o n 3 は ス キ ッ プ し 、 こ れ は C E L F に よ っ て 促 進 さ れ た （ 図 4 A）。 興 味 深 い こ と に 、 マ ウ ス T r e m 2 で は e x o n 3 の 選 択 的 ス プ ラ イ シ ン グ が 生 じ ず 、C E L F に よ っ て 促 進 さ れ な か っ た （ 図 4 A）。 こ れ ら の 動 物 種 に 加 え て 、 チ ン パ ン ジ ー 、 マ ー モ セ ッ ト 、 ウ シ 、 ブ タ の T r e m 2 で も 検 討 し た 。 そ の 結 果 、 ブ タ 以 外 の 動 物 種 で は e x o n 3 の 選 択 的 ス プ ラ イ シ ン グ が 保 存 さ れ て お り 、 e x o n 3 の ス キ ッ プ は C E L F 2 で 促 進 さ れ た （ 図 4 B）。 従 っ て 、e x o n 3 の 選 択 的 ス プ ラ イ シ ン グ に は 種 特 異 性 が あ り 、そ の 制 御 機 構 は 動
物 種 間 で 異 な る こ と が 示 唆 さ れ た 。
4 . C E L F 2 は T R E M 2 i n t r o n 3 を 介 し て ス プ ラ イ シ ン グ を 制 御 す る E x o n 3 の ス プ ラ イ
ス パ タ ー ン が ヒ ト と マ ウ ス で 異 な る こ と か ら 、 両 種 の キ メ ラ m i n i g e n e を 作 製 す る こ と で C E L F に よ る T R E M 2 e x o n 3 の 選
択 的 ス プ ラ イ シ ン グ 制 御 機 構 を 推 測 で き る と 考 え た 。複 数 の キ メ ラ m i n i g e n e を 作 製 し 比 較 し た 結 果 、 ヒ ト i n t r o n 3 を 有 す る キ メ ラ m i n i g e n e は 、 僅 か で は あ る が C E L F に よ る e x o n 3 の ス キ ッ プ を 示 し た （ 図 5 A , B）。 さ ら に 、i n t r o n 3 の 後 半 部 に C E L F の 応 答 領 域 が 存 在 す る こ と が 示 唆 さ れ た （ 図 5 C）。 次 に 、R N A 免 疫 沈 降 を 行 い T H P - 1 細 胞 内 在 性 の C E L F 2と T R E M 2の 結 合 を 検 討 し た 。抗 C E L F 2 抗 体 を 用 い た 免 疫 沈 降 産 物 か ら 抽 出 し た R N A を 逆 転 写 し た c D N A を 鋳 型 と し て T R E M 2 e x o n 3 か ら e x o n 4 の 領 域 を P C R で 増 幅 し た 。そ の 結 果 、免 疫 沈 降 画 分 で バ ン ド が 検 出 さ れ た こ と か ら 、C E L F 2 と T R E M 2 p r e - m R N A の 結 合 が 示 唆 さ れ た （ 図 5 D）。
5 .E x o n 3 欠 損 型 T R E M 2 は 分 泌 型 タ ン パ ク 質 と し て 発 現 す る
E x o n 3 が ス キ ッ プ し た m R N A は e x o n 4 の 途 中 に 終 止 コ ド ン が 生 じ る 。 こ れ は 未 成 熟 終 止 コ ド ン と し て 認 識 さ れ て N M D に よ っ て 分 解 さ れ 易 く な る 1 )。 一 方 、 こ の m R N A は 膜 貫 通 ド メ イ ン を 欠 く た め 、N M D を 逃 れ た e x o n 3 欠 損 型 m R N A か ら は 分 泌 型 タ ン パ ク 質 と し て 新 規 の T R E M 2 ア イ ソ フ ォ ー ム が 発 現 す る 可 能 性 が 考
え ら れ る 。 そ こ で 、e x o n 3 の 欠 失 変 異 体 を 作 製 し 、 培 養 上 清 中 に お け る 発 現 の 有 無 を 検 討 し た と こ ろ 、3 0～4 0 k D a 付 近 に タ ン パ ク 質 発 現 が 認 め ら れ た 。
総 括
本 研 究 で は T R E M 2 の 発 現 を 制 御 す る ス プ ラ イ シ ン グ 因 子 と し て C E L F 2 を 同 定 し た 2 )（ 図 6）。近 年 、A D
の 分 子 病 態 に お け る R N A プ ロ セ シ ン グ 制 御 の 異 常 が 示 唆 さ れ て い る 。 本 研 究 の 知 見 は 、T R E M 2 の 発 現 制 御 や ミ ク ロ グ リ ア ・ マ ク ロ フ ァ ー ジ の 機 能 制 御 の 観 点 か ら R N A プ ロ セ シ ン グ 制 御 の 意 義 を 解 明 す る 端 緒 と な る 可 能 性 が あ る 。 ま た 、 A D の 病 態 生 理 に 対 す る
T R E M 2 の 関 与 が ヒ ト と マ ウ ス の 間 で 異 な る こ と が 示 唆 さ れ て お り 、
T R E M 2 の ス プ ラ イ シ ン グ 制 御 に お け る 動 物 種 間 の 差 は そ の 一 端 を
説 明 す る 可 能 性 が あ る 。さ ら に 、e x o n 3 の ス キ ッ プ が 新 規 分 泌 型 タ ン パ ク 質 を 産 生 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。こ の タ ン パ ク 質 の 生 体 内 で の 発 現 状 況 お よ び 機 能 の 検 討 が 必 要 で あ る 。e x o n 3 の 選 択 的 ス プ ラ イ シ ン グ が 各 種 の T R E M 2 関 連 疾 患 の 病 態 生 理 に 及 ぼ す 影 響 の 解 明 は 、 今 後 の 検 討 課 題 で あ る 。
参 考 文 献
1 ) Y a n a i z u M . , S a k a i K . , T o s a k i Y . , K i n o Y . , S a t o h J . , S c i . R e p . , 8 , e 6 9 3 7 ( 2 0 1 8 )
2 ) Y a n a i z u M . , W a s h i z u C . , N u k i n a N . , S a t o h J . , K i n o Y . , S c i . R e p . , 1 0 , e 1 7 9 9 5 ( 2 0 2 0 )
