Inst. Compr. Agr. Sci. Kinki Univ. 9 : 147-151 (2001)
キ ノ ア 種 子 の トリ プ シ ン イ ン ヒ ビ タ ー の 単 離 お よ び そ の 性 質
陳 恰 君*、 安 藤 ひ と み**、 浅 井 利 憲***、 渡 辺 克 美*、 光 永 俊 郎*
Isolation and Some Properties of Trypsin Inhibitors in Quinoa Seeds.
Yi-chun Chen*, Hitomi Andou* * ,Toshinori Asai* * *, Katsumi Watanabe * and Toshio Mitsunaga*
Synopsis
Three trypsin inhibitors were isolated and purified from quinoa seeds (Chenopodium quinoa) by extraction with 0.1M sodium chloride, heat treatment, ammonium sulfate precipitation, and chromatographies on SP-Sepharose Fast Flow, Sephadex G-75 and DEAE-Sepharose Fast Flow columns.
The final preparations, QTI- I , - II and - III ,were homogeneous on electrophoretic anaylsis. The molecular weights of QTI- I , - II and -III were about 3,700, 3,600 and 3,550 by SDS-polyacrylamide gel electropholesis, and about 7,500, 7,400 and 7,300 by gel-chromatography, respectively. These inhibitors inhibited bovine trypsin at an inhibitor-enzyme ratio of 1:1.
1緒 言
キ ノ ア(Chenopodiumguinoa)は 現 在 南 ア メ リ カ の ア ン デ ス 山 脈(海 抜2,500‑4,500) の 高 地 で 栽 培 さ れ て い る ア カ ザ 科 の 植 物 で あ る 。 そ の 種 子 は イ ネ 科 の 穀 類 の 種 子 に 比 較 し て タ ン パ ク 質 、 脂 質 、 ビ タ ミ ン 、 無 機 質 、 食 物 繊 維 が 豊 富 に バ ラ ン ス よ く含 ま れ て い る 。 特 に タ ン パ ク 質 は リ ジ ン な ど の 必 須 ア ミ ノ酸
の 含 量 が 高 く、 ア ミ ノ 酸 価 は86でD、 植 物 タ ン パ ク 質 と し て は 極 め て 高 い 値 を 示 し て い る 。
し か し植 物 種 子 に は 哺 乳 動 物 の 消 化 酵 素 で あ る ト リ プ シ ン な ど の プ ロ テ ア ー ゼ の 働 き を 阻 害 す る タ ン パ ク 性 イ ン ヒ ビ タ ー が 存 在 す る 。 こ の 植 物 の プ ロ テ ア ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー の 研 究 は1947年Kunitz2)に よ る ダ イ ズ ト リ フ゜シ ン イ ン ヒ ビ タ ー の 発 見 に 始 ま る 。 そ れ 以 来 コ ム
*近 畿 大 学 農学 部 食 品栄 養学 科
**京 都 文 教 短期 大 学
***株 式 会 社 浅 井
ギ3)、 コ メ4)、 オ オ ム ギ5)、 ト ウ モ ロ コ シ6)な ど の 穀 類 、 大 豆 、 小 豆 、 落 花 生 、 イ ンゲ ン 豆 、 エ ン ド ウ な ど の 豆 類7・8・9)より プ ロ テ ア ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー が 見 い だ さ れ 、 そ れ ら の 性 質 が 明 ら か に さ れ て い る 。 こ れ ら の イ ン ヒ ビ タ ー は わ れ わ れ に と っ て 天 然 毒 で あ る が 、 な ぜ 植 物 体 に 存 在 す る の か 、 そ の 生 理 的 役 割 、 機 能 に つ い て は 現 在 も 不 明 で あ る 。 し か し食 品 を 評 価 す る 上 で は そ の 食 品 に 含 ま れ て い る イ ン ヒ
ビ タ ー の 性 質 を 明 ら か に す る 必 要 が あ る 。 キ ノ ア を 新 しい 食 品 素 材 と し て 評 価 す る た め 、 キ ノ ア 種 子 中 の トリ プ シ ン イ ン ヒ ビ タ ー を 単 離 し、 そ の 性 質 を 検 討 し た 。
2実 験
2.1.実 験 材 料
試 料 と し て1997年 産 キ ノ ア(Chenopodium
(Department of Food and Nutrition, Faculty of Agriculture, Kinki University,Nara 631-8505, Japan) (Kyoto Bunkyo Junior College, Uji 611)
(Asai CO.LTD)
塑)の 精 白 粒 を 用 い た 。 酵 素 活 性 お よ び 阻 害 活 性 測 定 に ト リ プ シ ン(ウ シ 膵 臓 、typeH、
Sigma社)を 、 基 質 と し て α 一N‑benzyl‑D,L‑
argh妊ne‑p‑nitroanilidehydrochl(加de(BAPA,ナ カ ラ イ テ ス ク(株))を 使 用 し た 。SP‑SepharoseFast Flow,SephadexG‑75,DEAE‑SepharoseFastFlow
はLKBBiotec㎞ology製 を 用 い た 。 そ の 他 の 試 薬 は 市 販 特 級 品 を 使 用 し た 。
2.2実 験 方 法
2.2.1タ ンパ ク 質 の 定 量Fig・1
タ ンパ ク 質 の 定 量 はLowryら の 方 法1°)で 行 っ た 。 標 準 タ ン パ ク 質 と し て ウ シ 血 清 ア ル ブ ミ ン(Sigma社)を 用 い た 。
2.2。2ト リ プ シ ン活 性 お よ び ト リ プ シ ン イ ン ヒ ビ タ ー 活 性 の 測 定 は 合 成 基 質BAPAを 用 い る 。 Erlangerら11)の 改 良 法 で 行 っ た 。 ト リ プ シ ン イ
ン ヒ ビ タ ー 活 性 は ト リ プ シ ン1μ9を 完 全 に 阻 害 す る イ ン ヒ ビ タ ー 量 を1単 位(㎜it)と し た 。
2.2.3SDS一 ポ リ ア ク リ ル ア ミ ドゲ ル 電 気 泳 動 タ ン パ ク 質 の 純 度 の 確 認 お よ び 分 子 量 の 推 定 に はLaemmliら の 方 法12)に よ る0,1%SDS1%
メ ル カ プ トエ タ ノ ー ル を 含 む175%ポ リ ア ク リ ル ア ミ ドゲ ル を 用 い た 電 気 泳 動 法 を 行 っ た 。
3結 果
3.1ト リ プ シ ン イ ン ヒ ビ タ ー の 分 離 と精 製 粉 砕 し た キ ノ ア100gに2倍 量 の0.1MNaCl 溶 液(pH7.0)を 加 え ポ リ トロ ン で 混 合 磨 砕 し 、
4℃ で3時 間 放 置 し た 。 こ の 処 理 液 を 遠 心 分 離(15,000rpm、10分 、4℃)で 沈 澱 を 除 去 し 、 上 清 を60℃ で10分 間 熱 処 理 し た 後 、 遠 心 分 離 (15,000rpm、10分 、4℃)し て 、 得 ら れ た 上 清 を 抽 出 液 と し た 。 抽 出 液 は150mlで 、 総 ト リ プ シ ン イ ン ヒ ビ タ ー 活 性 は5,000unitで あ っ た 。
抽 出 液 に90%飽 和 液 の 硫 酸 ア ン モ ニ ウ ム を 加 え て 塩 析 し 、 沈 澱 を 遠 心 分 離 で 集 め た 。 こ の 沈 澱 を0.1M酢 酸 緩 衝 液(pH3.8)に 溶 解 し、 こ の 溶 液 を 同 じ緩 衝 液 に 対 し て 透 析 し た 。
こ の 透 析 液 を0.1M酢 酸 緩 衝 液(pH3.8)で 平 衡 化 し たSP‑SepharoseFastFlowカ ラ ム(2.5×
FraσtionNumber
ElutionpromeofSP‑SepharoseFastFlowcolu㎜
chromatographyof90%ammoniumsulfate pr㏄ipitate.
乃e囲bitorsolution欄ppli磁toacol㎜(25×
10.5cm)ofSP‑SΦhamseFastFlowequilibraめdwi血 0.1Macetatebuf免r,pH3.8.Thepro的inwaseluted firstwiththesamebuf艶rand廿1e皿withalhlearsalt concentrationgradient(OtoO.5MNaClinsame buf驚r)ataflowof30m1/h.
凸e㎞biめrso1血onwas即pliω ねacol㎜(1.7×
90.Ocm)ofSephadexG‑75equilibratedwithO,1M acetatebuf驚r,pH3。8,fbllowedbyelutionwiththe samesolutionataflowrateof15nil/h,
Fig.3 ElutionprofileofF‑20nSephadexG‑75column chromato9卑phy
職e㎞b㎞rso㎞donwas即plied的aco1㎜(1.7×
90.Ocm)ofSephadexG‑75equilibratedwithOユM
acetatebu描er,ph3.8,負)lIowedelutionwith仕 ￡same solutionataflowrateof15ml!h.
Fig.4 ElutionprofileofF‑10nDEAE‑SepharoseFast Howcol㎜c㎞omato即aphy
Theinhibitorsolu廿onw認appliedtoacolu㎜
(1。6×4.Ocm)ofDEAE‑SepharoseFastFlow equilibratedwithα05Mboratebuffer,ph9.0.
Theproteinwaseluledf廿stwiththesamebu価er andthenwithalinearsaltconcentrationgradient (OtoO.25MNaClins㎜ebuf艶r)at囲owof 15ml/h.
105cm)に よ る イ オ ン交 換 ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー に よ り活 性 画 分(F‑1,‑2)を 分 画 し た(Fig1)。
各 活 性 画 分 に90%飽 和 量 の 硫 酸 ア ン モ ニ ウ ム を 加 え 、 沈 澱 を 遠 心 分 離 に よ り集 め た 。
得 ら れ た 沈 澱 は そ れ ぞ れ α1M酢 酸 緩 衝 液 (pH3.8)に 溶 解 し た 。2つ の 活 性 画 分 は そ れ ぞ れ0.1M酢 酸 緩 衝 液(pH3.8)で 平 衡 化 し た
SephadexG‑75カ ラ ム(1.5×90.Ocm)で ゲ ル 濾 過 し た 。 そ の 結 果Fig2、3に 示 す ご と く そ れ ぞ れ1つ ず つ 活 性 画 分 が 得 ら れ た 。 得 ら れ た 各 活 性 画 分 に そ れ ぞ れ90%飽 和 量 の 硫 酸 ア ン モ ニ ウ ム を加 え 、 生 じ た 沈 澱 を 遠 心 分 離 で 集 め 、 0.05Mホ ウ 酸 緩 衝 液 に 溶 解 後 、 同 緩 衝 液 で 透 析 し た 。
各 透 析 液 は そ れ ぞ れ0.05Mホ ウ 酸 緩 衝 液 で 平 衡 化 し たDEAE‑SephroseFastFlowカ ラ ム (1.6×4.Ocm)に 添 加 、 吸 着 さ せ た 。 同 緩 衝 液 で 洗 浄 し た 後 、NaCl濃 度0‑0.25Mの 濃 度 勾 配 で 溶 出 し た 。 そ の 結 果F‑1に つ い て はFig4に 示 す ご と く2つ の 活 性 画 分 を 、F‑2に つ い て はFig5 に 示 す ご と く1つ の 活 性 画 分 を 得 た 。 こ れ ら の 活 性 画 分 は そ れ ぞ れ 電 気 泳 動 で 単 一 の バ ン ドを 示 し た の で 、 キ ノ ア ト リ プ シ ン イ ン ヒ ビ タ ー 工(QuinoaTrypsin1豆hibitorI、QTI‑1)、‑
H(QTI』)、 一皿(QTI‑ln)と し た 。 そ れ ぞ れ は 抽 出 液 に 対 し て226倍 、191倍 、220倍 に 精 製 さ れ た(TableD。
3。2SDS一 ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 電 気 泳 動 に よ る 分 子 量 の 推 定
QTI‑1、‑1工 、‑mに つ い て0.1%SDS、1%
メ ル カ プ トエ タ ノ ー ル を 含 むTris一 グ リ シ ン
Table1.S㎜ 田yofthep血HcationofQTI‑LH,㎝dm仔omChenopo蜘uinoawlLLD.
Step Total
protein
〈mg)
Total actMty (units)
Specific activity (units!mg)
Yield
(%)
Extract Ammonium sulfate Sp‑Sepharose
F‑1 F‑2
1404
525
96.9 262
50QO
4574
1979 1126
3.56
8.71
490ハU324
100.0
91.5
39.6 22.5 SephadexG‑75
F一て F‑2
18.7 1.04
1951 511
85.0 492
31.8 10.2 DEAE‑Sepharose
F‑1QTI‑1 QTトII FIQ丁1‑lll
0.51 0.75 0.33
410 511 258
804 681 782
8.2 10.2 5.2
Fig.5ElutionprofileofF‑20nDEAE‑SepharoseFlow columnchromatography
Theinhibitorsolutionwasappliedtoacolumn (1.6×4.Ocm)ofDEAE‑SepharoseFastFlow equilibratedwithO.05Mboratebuf飴r,pH9.0.The proteinwaselutedfh闘stwiththesalnebufferandthen withalinear謝tconcentradongradient(OtoO.25M NaCl血thesamebuffer)ataflowofl5mVh.
kDa
:蕪欝華難窪覇
丘27灘 響 灘 養・ ・
1:1桑 響 灘 糠 灘
1234
Fig.6SDS‑polyacrylamidegelel㏄trophoresis Lanel
Lane2 Lane3 Lane4
Marker QTI‑I QTI‑H QTI』1
緩 衝 液 を 用 い て17.5%ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 電 気 泳 動 に よ る 分 子 量 の 推 定 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、QTI‑1、‑H、‑IIの 分 子 量 は そ れ ぞ れ3,700、3,600、3,550と 推 定 さ れ た(Fig6)。
3.3ゲ ル 濾 過 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ に よ る 分 子 量 の 推 定
SephadexG‑75カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ るQTI‑1、‑H、 一皿 の 分 子 量 の 推 定 を 行
Kav
Fig.7Est㎞ationofmol㏄ularmassofQTI‑1, H,㎝d皿onaSeph記exG‑75col㎜
●,QTI‑1,H,and皿;○,Protein markers:1,0voalbumin(45,000);
2,chymotrypsinogenA(25,000);
3ゴbonucleaseA(13,700);4,cyt㏄hrome C(12,500);5,trypsininhibitor(bovine lung)(6,500)
っ た 結 果 そ れ ぞ れ7,500、7,400、7,300で あ っ た 。 標 準 タ ン パ ク 質 と し て オ ボ ア ル ブ ミ ン (分 子 量45,000)、 キ モ ト リ プ シ ノ ー ゲ ン (25,000)、 リ ボ ヌ ク レ ア ー ゼ(13,500)、 チ ト ク ロ ムC(12,500)、 ウ シ ト リ プ シ ン イ ン ヒ ビ
タ ー を 用 い た 。(Fig7)
3.4ト リプ シ ン に 対 す る 阻 害 活 性
QTI‑1、‑H、 』 の ト リ プ シ ン に 対 す る 阻 害 活 性 は ト リ プ シ ン の 分 子 量23,000と して 計 算 す る と、 そ れ ぞ れ の イ ン ヒ ビ タ ー1モ ル が
トリ プ シ ン1モ ル 阻 害 した 。
4考 察
キ ノ ア種 子 よ り0.1MNaCl溶 液 で ト リ プ シ ン イ ン ヒ ビ タ ー 活 性 画 分 を抽 出 し た 。 通 常 は 試 料 粉 末 に 対 し て10倍 量 の 抽 出 溶 媒 を 加 え る が 、 キ ノ ア の イ ン ヒ ビ タ ー 活 性 が 低 い た め 、 総 阻 害 活 性 を 測 定 す る こ と が で き な か っ た 。 す で に 報 告1)し て い る ご と く精 白 米 の60%、
小 麦 粉 の40%、 エ ン ドウ の0.8%の 阻 害 活 性 で あ っ た 。 そ の た め2倍 量 の 抽 出 溶 媒 を 加 え て 活 性 画 分 を 抽 出 し た 。 さ ら に 塩 析 、 透 析 、 イ オ ン 交 換 ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー 、 ゲ ル 濾 過 ク ロ
マ トグ ラ フ ィ ー に よ り精 製 し た 。 精 製 イ ン ヒ ビ タ ー3種 類QTI一 工、 』 、 』 の 分 子 量 は そ れ ぞ れ 、7,500、7,400、7,300と 推 定 さ れ た 。
さ ら に 、 こ の3種 類 の イ ン ヒ ビ タ ー は そ れ ぞ れ 分 子 量3,700、3,600、3,550の サ ブ ユ ニ ッ ト
2個 か ら な る2量 体 で あ っ た 。 こ れ ら の 分 子 量 か ら は 大 豆 のBBI系 イ ン ヒ ビ タ ー と 考 え ら れ る が 、 活 性 中 心 が1個 のSingle‑headedイ ン ヒ ビ タ ー よ り ダ イ コ ン種 子 の ト リ プ シ ン イ ン ヒ ビ タ ー13)に 類 似 し て い る 。 そ の 性 質 に は さ ら に検 討 す る 必 要 が あ る 。
植 物 性 イ ン ヒ ビ タ ー の 生 理 的 役 割 に つ い て は 、 現 在 ま で 明 確 に は 何 も わ か っ て い な い 。 Mansfeldら14)は 植 物 性 イ ン ヒ ビ タ ー の 存 在 は 植 物 体 自 体 の 自 己 消 化 を 抑 制 す る こ と に よ り 生 命 の 維 持 の 役 割 を し て い る と 推 察 し て い る 。 こ の 見 解 を 支 持 す る 事 実 は い くつ か あ る が 、 矛 盾 す る 事 実 も 多 い 。 ま た 植 物 「生 イ ン ヒ ビ タ ー は 高 等 動 物 、 昆 虫 、 微 生 物 の セ リ ン プ ロ テ ア ー ゼ の い くつ か を 強 く 阻 害 す る 。 こ れ 他 の イ ン ヒ ビ タ ー は 植 物 体 に す で に 存 在 し て い る 場 合is‑17)と 昆 虫 な ど に よ り植 物 体 が 傷 つ け ら れ る と イ ン ヒ ビ タ ー の 精 製 が 誘 導 さ れ る 場 合is‑za)が あ る 。 こ れ ら の 結 果 は イ ン ヒ ビ タ ー は 植 物 の 生 体 防 御 の 機 能 を 有 す る と推 察 さ れ て い る 。 イ ン ヒ ビ タ ー の 生 理 的 役 割 に 関 し て は 推 測 の 域 を 出 て い な い が 、 種 々 の 植 物 種 子 で 種 類 、 含 量 特 性 が 異 な り、 キ ノ ア で は 含 有 量 が 極 め て 少 な い こ と な ど 、 興 味 が あ り 、
さ ら に 検 討 の 必 要 が あ る 。
︑,(δ 9
78,935(1975).
1Vl.i3eiewand‑‑.Eaicer:Eur.J.Biochem.62,4ya (1976).
山 路 直 貴 、 稲 田 祐 義 、 吉 田 豊 和 、 稲 葉 和 功 、 光 永 俊 郎:近 畿 大 学 農 総 研 報4、15
(1996)
iO)O.H.Lowry,N.J.Rosebough,A.L.Farrand R.J.Randall:J.Biol.Chem.193,265
(1951).
11)B.F.Erlanger,N.KokwskyandW.Cohen Arch.Biochem.Biophys,95,271(1961) 12)J.KINGandU.K.LAEMMI̲1:J.Mo1.Bi11.,62,465
(1971).
13)T.Hate,T.Ogawa,andR.Hayachi二Bull.Res, Inst.FoodSci.,KyotoUniv.30,51{1967}
14)V.MANSFELDandZ.ZIEGELHOFFER NATURWISSENSCHAFTEN46,172(1.959) 15)S.Bo肥N:Acta.Agric.Scand.37,369(1983) 16)A.M.GA丁EHOusE,J.A.GATEHousE,P.D
OBIE,A.M.KILMINSTERandD.Boulter:J.Sci.
FoodAgric.30,948(i979) 1.7)A.K.BHATTACHARVAandN.C.PANT:Indian
J.Entomol.32,58(].970) 18)C.A。RYAN,andT.R.GREEN:SCIENCE175,
776(1978!
19)P..BISHOP,G.PEARCE,J.E.BRYANandC.A̲
RYANJ.Biol.Chem.259,13172(1984}
20)C.A.RYAN:TrendsinBiochemicalSci.
5,148(1978)
2].)W.E.BROwN,K.TaKIO,K.TITAtviandC.A.
RYAN:Biochemistry24,2105(1985)
引用文献
1)光 永 俊 郎:食 品 と 科 学42、77(2000).
2)M.Kunitz:J.Gen.Physiol.,30,311(1947).
3)EM.LearmonthandJ.C.Wood二Chem.and lndust.51,1569(1960).
4)光 永 俊 郎 、 世 古 口 裕 二 、 谷 口 由 美 子:近
畿 大 学 環 境 科 学 研 究 所 報 告20.33(1992).
5)M.Yoshikawa,T.lwasakiandM.Fujii:
J.Biochem.79,765(1976).
6)M.J.Swartz,H.L.MitcheilandG.R.Reeck J.Biol.Chem.252,8105(1997}.
7}C.Yoshida,andM.Yoshikawa:J.Biochem.,
