環状過酸化物の抗マラリア作用機序の解析

(1)

博士論文

環状過酸化物の抗マラリア作用機序の解析

平成 25 年 3 月森田将之

岡山大学大学院医歯薬学総合研究科

博士後期課程創薬生命科学専攻

(2)

１

5

略語表

7

1

章序論

9

1.1.

マラリアとは

10

1.2.

マラリア原虫の種類

10

1.3.

赤血球内でのマラリア原虫のライフサイクル

10

1.4.

抗マラリア薬

11

1.5.

抗マラリア作用機序

13

1.6.

環状過酸化物

13 1.6.1. Artemisinin 13

1.6.2. N-89

及び

N-251 14

1.7. N-89

誘導体と親和性を有するマラリア原虫タンパク質

15

1.8.

本研究の目的及び意義

16

2

章方法

17

2.1.

材料

18

2.2.

細胞株

18

2.3.

熱帯熱マラリア原虫の in vitro培養

18 2.3.1. RPMI1640 (-)

培地の調製

18

2.3.2.

ヒト赤血球と血清

18

2.3.3.

熱帯熱マラリア原虫の継代培養

18

2.4.

熱帯熱マラリア原虫の薬剤感受性試験

19

(3)

２

2.5.

熱帯熱マラリア原虫の同調培養法

19 2.6. N-89

及び

N-251

の熱帯熱マラリア原虫に対するステージ特異的阻害の解析

20

2.7.

プロテオーム解析

21

2.7.1.

熱帯熱マラリア原虫タンパク質

lysate

の調製

21

2.7.2.

タンパク質定量

22

2.7.3.

二次元電気泳動

22

2.7.4.

イメージの検出と解析

23

2.7.5

タンパク質スポットの切り出し

24

2.7.6.

タンパク質のゲル内消化

24

2.7.7.

タンパク質の同定

24 2.8. Western blotting 25

2.8.1. SDS-PAGE 25

2.8.2 Semi-dry blotting 25

2.8.3.

ブロッキング及び抗体反応

25 2.8.4. Chemiluminescent detection (化学発光による検出) 26

2.8.5.

ストリッピング

26 2.9. PfERC

と相互作用するマラリア原虫タンパク質の探索

26

2.9.1

マラリア原虫タンパク質

Lysate

の調製

26

2.9.2.

免疫沈降

27 2.9.3. MBP (Maltose binding protein)-ΔPfERC 27

2.9.4. Pull down assay 28

2.10.

表面プラズモン共鳴法

(Surface Plasmon Resonance; SPR) 28

2.11.

電子スピン共鳴法

(Electron Spin Resonance; ESR)

を用いたラジカルの検出

29

(4)

３ 2.12. PfERC

を過剰発現する遺伝子組換え原虫の作製

29

2.13.

長崎大学熱帯医学研究所原虫学分野研究室でのマラリア原虫培養

29

2.14.

長崎大学熱帯医学研究所原虫学分野研究室でのマラリア原虫タンパク質

Lysate

の調製

30 2.15. Real-time PCR 30

2.15.1.

プライマー

30 2.15.2. RNase-free

処理

31 2.15.3. Total RNA

抽出

31 2.15.4. RNA

の定量

32 2.15.5. First-Strand cDNA

合成

32 2.15.6. Real-time PCR 32

2.16.

免疫蛍光染色による局在観察

34 2.16.1. PEI-coated cover glass

の作製

35

2.16.2.

免疫蛍光染色法

35

2.17.

遺伝子組換え原虫の薬剤感受性試験

36

3

章結果

37 3.1. N-89

及び

N-251

38 3.2. N-89

又は

N-251

作用時のプロテオーム解析

40 3.2.1. N-89

作用時に変動するタンパク質

41 3.2.2 N-251

作用時に変動するタンパク質

57

3.2.3.

標的候補タンパク質の選抜

76 3.3. PfERC

78

3.3.1.

免疫沈降法による PfERCと相互作用するタンパク質の探索

78

(5)

４ 3.3.2. Pull down assay

による PfERCと相互作用するタンパク質の探索

79

3.4.

表面プラズモン共鳴を用いたΔPfERCと

N-89

、

N-251

との親和性測定

80

3.5.

電子スピン共鳴法を用いた

N-89

及び

N-251

のラジカル産生の解析

81 3.6. PfERC

過剰発現原虫の作製と薬効評価

83 3.6.1. PfERC

の

mRNA

発現量の解析

83 3.6.2. PfERC

のタンパク質レベルの解析

83

3.6.3.

免疫蛍光染色法を用いた PfERCと PfERC-3Tyの局在観察

84

3.6.4.

薬効評価

87

4

章考察

88

引用文献

98

謝辞

102

(6)

５ 要約

マラリアは

2010

年における年間感染者数が

2

億

1600

万人、死亡者数は

65

万

5000

人の世界最大の寄生原虫感染症である。従来治療に用いられてきた

Chloroquine、Mefloquine

に対する耐性原虫に加え、現在、

WHO

が推奨する

ACTs (Artemisinin

を基本とした多剤併用療法

: Artemisinin-based combination therapies)

に耐性を示す

Artemisinin

耐性マラリア原虫がタイ・カンボジア国境付近で出現したことが報告されており、マラリア制圧において深刻な問題となっている。また、昨今、イギリスの製薬会社をはじめとしてマラリアワクチンの開発が行われているが、未だ実用に耐えうるワクチンの開発は達成されておらず、したがって、新たな抗マラリア薬の開発は国際的な緊急課題である。これまでに抗マラリア薬の開発研究から、環状過酸化物

N-89

及び

N-251

が優れた抗マラリア活性を有することが見出されている。これらの化合物は不斉炭素を持たない簡単な構造であり、安価に大量合成できる利点を有している。

N-89

及び

N-251

の臨床応用へ向けた安全性研究、製剤研究、及び抗マラリア作用機序の解析研究が行われている。現在、臨床で使用されている抗マラリア薬には作用機序が明らかなものは非常に少ないが、併用薬の選択、副作用の回避、薬剤耐性化の克服のためには作用機序を明確にすることが重要である。そのため、本研究は

N-89

及び

N-251

の抗マラリア作用機序を明らかにすることを目的として行った。

熱帯熱マラリア原虫は赤血球内で様々に形態を変えるライフサイクルを有し、各ステージで種々の遺伝子及びタンパク質の発現量が変動していることが知られている。そこで、環状過酸

化物

N-89

及び

N-251

の作用機序解析のため、マラリア原虫生育ステージ特異的な阻害効果の

検討を行った。その結果、

N-89

及び

N-251

は

Trophozoite

期の原虫に特異的な増殖阻害作用を有することが分かった。

N-89

及び

N-251

と同様の環状過酸化物である

Artemisinin

系薬剤では全てのステージのマラリア原虫に増殖阻害作用を示すことが報告されていることから、

N-89

及び

N-251

は

Artemisinin

系薬剤とは作用機序が異なることが示唆された。

N-89

及び

N-251

は

Trophozoite

期のマラリア原虫の増殖を特異的に阻害することから、

Trophozoite

期に発現しているマラリア原虫タンパク質の機能を阻害していることが考えられ

た。

N-89

又は

N-251

を

Trophozoite

期のマラリア原虫に作用させた時にどのようなタンパク質

が変動するかをプロテオーム解析によって網羅的に解析した。その結果、約

70

種類のマラリア原虫タンパク質が薬剤作用によって増減した。これまでに

N-89

誘導体と親和性を有するマラリア原虫タンパク質が同定されている。その中でも、本プロテオーム解析で

N-89

作用時及

び

N-251

作用時両方の場合に共通して変動していたマラリア原虫タンパク質 PfERCを

N-89

及

び

N-251

の標的候補タンパク質として選抜した。PfERCは

N-89

又は

N-251

の作用によって減

少し、

N-89

誘導体と親和性を有するため、

N-89

及び

N-251

と PfERC の結合がPfERCの減少に関与している可能性が考えられた。

PfERCの機能解析のため、PfERCと相互作用するマラリア原虫タンパク質の探索を行ったが、

相互作用するタンパク質は本研究では見出せなかった。このことから、Pf

ERC

は他のタンパク

(7)

６

質と非常に弱い相互作用をしている可能性が考えられた。表面プラズモン共鳴法を用いた解析

より、

N-89

及び

N-251

は弱いながらも PfERCと特異的な親和性を有することが示された。

N-89

及び

N-251

は鉄の存在下で自身の環状過酸化構造よりラジカルを産生することから、産生され

たラジカルが直接 PfERC と反応し、PfERC を減少させて抗マラリア作用を示す可能性が考えられた。そのため、原虫内で PfERC を過剰発現させることによって薬剤の作用にどのような影響が出るかを検討した。PfERC を

2

倍多く発現する遺伝子組換え原虫を作製し、

N-89

の感受性を測定した結果、その感受性は

1/2

に低下した。この結果は、PfERCが標的タンパク質である可能性を支持するものである。

本研究により、抗マラリア薬候補として有望な化合物

N-89、N-251

の標的候補タンパク質 PfERC が見出され、そのタンパク質が薬剤の感受性に寄与していることが明らかにされた。PfERC 過剰発現原虫作製においては、PfERCを

10

倍以上過剰発現させることを期待して研究を行ったが、実際の発現量は約

2

倍が限度であった。これは、PfERC が多過ぎるとマラリア原虫の生育に悪影響を与えるために、発現抑制が起こった可能性があると考えられる。PfERCはその構造内に

EF hand motif (Ca

²⁺

結合モチーフ) を有する

CREC (Cab45、Reticulocalbin、ERC-55、Calumenin)

タンパク質ファミリーに属している。PfERCの機能はまだ明らかになっていないが、

CREC

タンパク質ファミリーのタンパク質は小胞体内での

Ca

²⁺制御への関与、細胞の生存に必須であることが複数の研究グループから報告されている。PfERC も他の

CREC

タンパク質ファミリーと同様の機能を有している、すなわち、

PfERCは原虫の生存に必須でありなおかつ

Ca

²⁺制御へも関与していることが考えられる。そのため、

N-89

又は

N-251

を作用させるとPfERCが減少し、原虫小胞体内で

Ca

²⁺制御異常が起こり、原虫が死

に至る可能性が考えられる。

N-89

と

N-251

は環状過酸化抗マラリア薬である

Artemisinin

系薬剤と異なり、熱帯熱マラリア原

虫の

Trophozoite

期に特異的に作用する。また、

N-89

と

N-251

の標的候補タンパク質である

PfERC は

Artemisinin

とは親和性を示さなかった。このことは

N-89

及び

N-251

は

Artemisinin

系薬剤とは抗マラリア作用機序が異なることを示している。近年、Artemisinin系薬剤に対する耐性原虫が出現し問題となっているが、N-89 及び

N-251

は

Artemisinin

耐性原虫に対しても有効であり、マラリア制圧に貢献できる有望な抗マラリア薬であると考える。

本研究によって新規抗マラリア薬として有望な環状過酸化物

N-89

及び

N-251

の作用機序の一端が提示でき、臨床における併用薬の選択、副作用の回避、耐性の克服に大きく寄与できると考えられる。

(8)

７ 略語表

論文中で以下の略語を用いた

ACTs Artemisinin-based combination therapies

ATP adenosine triphosphate

BPB bromo phenol blue

bp base pair

BSD Blasticidin S

cDNA complementary DNA

CHAPS 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate

CM Complete medium

DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole

DBNBS 3,5-dibromonitrosobenzenesulfonate sodium salt

DEPC diethyl pyrocarbonate

DFO deferoxamine

DMSO dimethylsulfoxide

DNA deoxyribonucleic acid

DNase deoxyribonuclease

dNTP Deoxynucleotide triphosphate

DTT Dithiothreitol

EC

₅₀

Effective concentration of 50% inhibition

EDTA ethylenediaminetetraacetic acid

ER Endoplasmic reticulum

ESR electron spin resonance

HEPES HC

2-hydroxyethylpiperazine-N’-2- ethanesulfonic Acid hematocrit

HPLC high performance liquid chromatography

HRP Horseradish peroxidase

HSP Heat shock protein

IEF isoelectric focusing

i.p.

intraperitoneal

IPG immobilized pH gradient

i.v.

intravenous

kDa kilodalton

LC Liquid Chromatography

MALDI Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization

MBP Maltose binding protein

MS Mass Spectrometry

mAb Monoclonal antibody

(9)

８ mRNA messenger RNA

PAGE polyacrylamide gel electrophoresis

PBS phosphate-buffered saline

PCR Polymerase chain reaction

PEI polyethyleneimine

pI Isoelectric point

PIPES Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)

P. f. Plasmodium falciparum

PMF Peptide mass fingerprinting

p.o.

per os

RBC red blood cell

RNA ribonucleic acid

RNase Ribonuclease

RT-PCR reverse transcriptase-PCR

siRNA small interfering RNA

s.c.

subcutaneous injection

SDS sodium dodecyl sulfate

SPR surface plasmon resonance

TBS Tris buffered saline

TEMPO 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxy

TOF Time of flight

Tris tris (hydroxymethyl) aminomethane

UV Ultraviolet

WHO World Health Organization

(10)

９ １章序論

(11)

１０ 1.1.

マラリアとは

マラリアは、Plasmodium 属の原虫がハマダラカ

(Genus Anopheles)

の吸血によりヒトに感染することで引き起こされる寄生原虫感染症であり、熱帯地域全体のみならず、亜熱帯、温帯の多くの地域まで広く蔓延している。マラリアの典型的な症状は

6~8

時間続く

40°C

を超える激しい発熱であり、重度になると錯乱、痙攣、昏睡にまで発展し死亡の危険もある。世界保健機構

(World Health Organization; WHO)

の報告では、世界

107

カ国で

30

億人以上がその脅威に曝されており、

2010

年のマラリア感染は

2

億

1600

万件にのぼり、死亡者数は

65

万

5000

人

(

うち約

86%

が

5

歳未満の子供

)

といわれている ¹⁾。世界でのマラリアの分布を

Figure 1

²⁾に示す。

WHO: Programmes and projects, international travel and health, Chapter 7 Malaria.

Figure 1.

マラリア伝搬地域

1.2.

マラリア原虫の種類

ヒトに寄生するマラリア原虫は、熱帯熱マラリア原虫 (Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア原虫

(P. vivax )

、四日熱マラリア原虫

(P. malariae)

、卵形マラリア原虫

(P. ovale)

である。

さらに

2004

年にはこれまでサルに寄生するマラリア原虫であったP. knowlesiがヒトにも寄生することが報告されている ³⁾。これらの中でも熱帯熱マラリア原虫は感染すると重篤になりやすく、最も致死率の高いマラリア原虫である。

1.3.

赤血球内でのマラリア原虫のライフサイクルを

Figure 2

に示す。マラリア原虫はヒトの体内で赤血球へ侵入後、Merozoiteから

Ring、栄養体とも呼ばれる Trophozoite、核と細胞質が分裂

した

Schizont

へと成熟し、赤血球を破壊し、放出された

Merozoite

が新しい赤血球に侵入する。

(12)

１１

マラリア原虫は

Trophozoite

期においても形態、遺伝子及びタンパク質の発現が大きく変化する。しかし、その変化を区別する客観的な指標はないため、当研究室ではマラリア原虫の細胞質の大きさ、原虫内に占めるヘモゾイン^＊量の割合から主観的に

Trophozoite

期を

Early、

Middle、 Late trophozoite

期の

3

種類に分類している。

＊ヘモゾインはマラリア原虫内で遊離したヘムが重合化されたものである。マラリア原虫は栄養源として赤血球内のヘモグロビンを取り込み、分解してアミノ酸を得る際に遊離する鉄を含んだ有害なヘムを無毒化するためにヘムを重合化したヘモゾインを生成する。

Figure 2.

1.4.

抗マラリア薬

既存の抗マラリア薬には

quinoline

骨格を基本とした

Chloroquine

や

Mefloquine

などがあるがこれら抗マラリア薬に対する薬剤耐性マラリア原虫が世界に拡散する傾向にある。既存の抗マラリア薬の構造式を

Figure 3

に示す。

(13)

１２ Quinine Chloroquine Mefloquine Primaquine

Lumefantrine Pyrimethamine

Figure 3.

既存の抗マラリア薬の構造式

Figure 3

に示す抗マラリア薬とは異なり、分子内に

peroxide

構造というユニークな構造を有

する

Artemisinin

という化合物が中国古来の生薬青蒿 (Artemisia) から単離され、優れた抗マラ

リア作用を有することが分かっている。体内動態の改善を目指して

Artemisinin

の半合成化合

物である

Artemisinin

系薬剤が開発され、臨床で使用されている。

Artemisinin

の活性代謝物で

ある

Dihydroartemisinin

から脂溶性向上を目的に

Artemether

、水溶性向上を目的に

Artesunate

が合成された。

Artemisinin

系薬剤の構造式を

Figure 4

に示す。

Artemisinin

Dihydroartemisinin

Artemether

Artesunate Figure 4. Artemisinin

系薬剤の構造式

これら

Artmisinin

系薬剤は半減期が短く

(Artemisinin

が

2~3

時間、

Dihydroartemisinin

が

40~60

分、

Artemether

が

3~7

時間

(Dihydroartemisinin

への変換

)

、

Artesunate

が

2~5

分

(Dihydroartemisinin

への変換))、再燃が起こりやすいという問題点がある。そのため

2001

年から

WHO

より、半減期の長い既存の抗マラリア薬と

Artemisinin

系薬剤を組み合わせた多剤併用療法 (Artemisinin

(14)

１３ based-combination therapies; ACTs)

がマラリア治療に推奨されている^{4), 5)}。今日まで

ACTs

はマラリア治療の第一選択として用いられてきたが、近年タイ・カンボジア国境付近で

Artemisinin

系薬剤耐性熱帯熱マラリア原虫の出現が報告されている ^{6), 7)}。

1.5.

抗マラリア作用機序

既存の抗マラリア薬の中で作用機序が解明されているものはほとんどない。現在、唯一作用機序が解明されている抗マラリア薬は

Pyrimethamine

のみである⁸⁾。

2003

年に

Artemisinin

の標的タンパク質として

SERCA (Sarco/endoplasmic reticulum Ca

²⁺

ATPase)

が発見されたという報告 ⁹⁾があるが、まだ決定的なエビデンスは得られていない。

1.6.

環状過酸化物

1.6.1. Artemisinin

前項でも述べた既存の抗マラリア薬である

Artemisinin

は既存抗マラリア薬とは異なり、分子内に

peroxide

構造というユニークな構造を有することから

Chloroquine

耐性原虫にも有効である ¹⁰⁾。ま

た、Artemisininはその

peroxide

構造がマラリア原虫内の

Fe

²⁺と反応し、ラジカルを産生することが報告されている¹¹⁾。さらに、

Artemisinin

の

peroxide

構造より酸素原子が一つ少ない

nonperoxidic analog

である

Deoxyartemisinin (Figure 5)

はその抗マラリア活性が

Artemisinin

に比べて

1/1000

以下に低下する¹²⁾。

Figure 5. Deoxyaretmisinin

の構造式

ラジカルのスピントラップ剤である

TEMPO (2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxy)

又は鉄のキレート剤である

DFO (deferoxamine)

を

Artemisinin

と併用した場合、

Artemisinin

の抗マラリア作用が低下する¹²⁾。これらは

Artemisinin

の抗マラリア作用には、ラジカルを産生することと鉄の存在が関与していることを示している。以上より、環状過酸化物の抗マラリア活性には

peroxide

構造が重要な役割を果たしていると考えられる。

(15)

１４ 1.6.2. N-89

及び

N-251

当研究室では

peroxide

構造に注目し、大阪大学工学部野島教授との共同研究により約

500

種の

peroxide

構造を持つ化合物を合成し、その抗マラリア活性の検討を行ってきた¹³⁾。現在までに種々の

化合物が抗マラリア活性を有することが確認されており、その中でも

tetraoxan

の環が

8

員環であり、

cyclododecane

を有する

N-89 (1,2,6,7-tetraoxaspiro[7.11]nonadecane)

が in vitro及び in vivoで優れた抗マラリア活性を示すことを見出した ¹⁴⁾。また、

N-89

に

-OH

基を導入した誘導体

N-251 (6-(1,2,6,7-tetraoxaspiro[7.11]nonadec-4-yl)hexan-1-ol)

をさらに合成し、この化合物は

N-89

と同等の抗マラリア活性を維持していることが分かっている ¹⁵⁾。このことより、

N-251

の

-OH

基を用いてプロドラッグを合成するなどの誘導体化が可能となる。

Figure 6

に

N-89

と

N-251

の構造式を、

Table 1、 2

に in vitroと in vivoにおける抗マラリア活性を示す。これらの結果より、

N-89、

N-251

は共に高い抗マラリア活性を有しており、選択毒性も高く、さらに、in vivoでもその有

用性が証明されている。現在、これら化合物を有望な抗マラリア薬候補化合物として開発研究及び作用機序の解析を行っている。

Figure 6. N-89

及び

N-251

の構造式

Table 1. N-89

及び

N-251

の in vitroにおける抗マラリア活性と細胞毒性

FCR-3

^a)

FM3A cell

^b)

Compound

EC

₅₀

(M) EC

₅₀

(M) Selectivity

N-89 2.5×10

^-8

8.2×10

^-6

328 N-251 2.3×10

^-8

8.0×10

^-6

324 a) Plasmodium falciparum b) Mouse mammary carcinoma cell

Table 2. N-89

及び

N-251

の in vivoにおける抗マラリア活性

i.v. p.o. i.p. s.c.

Compound ED

50

(mg/kg)

ED

90

(mg/kg)

ED

50

(mg/kg)

ED

90

(mg/kg)

ED

50

(mg/kg)

ED

90

(mg/kg)

ED

50

(mg/kg)

ED

90

(mg/kg)

N-89 12 20 20 40 12 20 2.5 3.8

N-251 22 45 15 40 15 26 7 10

(16)

１５ 1.7. N-89

誘導体と親和性を有するマラリア原虫タンパク質¹⁶⁾

これまでに平成

17

年度修了生佐内仁美氏により

N-89

誘導体と親和性を有するマラリア原虫タンパク質が同定されている。

2003

年の

Artemisinin

の標的タンパク質が発見されたという報告 ⁹⁾から、同様の環状過酸化

物である

N-89

及び

N-251

においても標的タンパク質があるのではないかと考えられた。この

標的タンパク質を同定する目的で

N-89

及び

N-251

をカラムに固定しマラリア原虫タンパク質

Lysate

中から親和性を有するタンパク質を単離するアフィニティーカラムを用いた解析を行っ

た。しかし、

N-89

及び

N-251

には自身をカラムに固定するための側鎖がない。そのため、側鎖にリジン残基を有する

N-89

誘導体 (N-346) を合成し、それをアズラクトンカラムに固定した

(Figure 7)。

Figure 7. N-89

誘導体

(N-346)

のアズラクトンカラムへの固定

N-346

を固定したカラムを用いて親和性を有するタンパク質を溶出し、同定した。その結果、

6

種類のマラリア原虫タンパク質

(Merozoite surface protein 7、 Rhoptry-associated membrane antigen、 14-3-3 protein、 Heat shock protein 70、 Endoplasmic reticulum-resident calcium binding protein (PfERC)

、

Glideosome-associated protein 45)

が

N-89

誘導体と親和性を有するマラリア原虫タンパク質として同定している。

上記

6

種類のマラリア原虫タンパク質の中でも、当研究室では PfERC に注目しており、これまでに就実大学薬学部平岡修准教授との共同研究のもと、PfERC の組換え体

(ΔPfERC)

及びモノクローナル抗体

(anti PfERC mAb)

を作製している。

(17)

１６

1.8.

本研究の目的及び意義

WHO

より

Roll Back Malaria Initiative

と呼ばれるマラリア対策が宣言されてから

10

年以上が経過するが、未だにマラリアによる死亡者は

65

万人近くにのぼっている。近年においても実用に耐え得るマラリアワクチンの開発は成されておらず、

ACT

療法に対する薬剤耐性マラリア原虫も出現し始めた。このような現況において、マラリア制圧へ向けた新たな抗マラリア薬の開発は世界的な急務となっている。

当研究室では in vitro、in vivo共に優れた抗マラリア活性を有する

N-89

及び

N-251

を新規抗マラリア薬候補化合物として開発研究を行っている。現在は臨床試験へ向けた安全性研究と製剤研究が行われているが、これらと並行して抗マラリア作用機序の解析研究も行われている。

作用機序を解明することによって併用薬の選択が可能となり、薬剤耐性の克服に大きく貢献する。また、未だ臨床試験が行われていない薬剤の作用機序が分かれば副作用の予測が可能となり、臨床試験における被験者のリスク回避へとつながる。そのため、私は本研究において

N-89

及び

N-251

の抗マラリア作用機序を解明することを目的として研究を行った。

本研究では、

N-89

及び

N-251

の熱帯熱マラリア原虫に対するステージ特異的阻害を解析し、

化合物作用時のプロテオーム解析によって

N-89

及び

N-251

の標的候補タンパク質として

PfERC を選抜した。さらに、PfERC の機能解析及び PfERC を過剰発現する遺伝子組換え原虫

の作製と薬効評価を行った。

本研究で得られた知見は、有望な新規抗マラリア薬候補化合物である

N-89

及び

N-251

がどのようにしてマラリア原虫に作用して抗マラリア活性を示すかを知る一助となる。さらに今後、

PfERC がどのような機能を有しているかを知ることによって、より詳細に作用機序を解明でき、

N-89

及び

N-251

の臨床での使用に向けて大きく貢献できるようになると期待できる。

(18)

１７ 2 章方法

(19)

１８ 2.1.

材料

N-89

及び

N-251

は株式会社ナード研究所に合成を依頼した。

Artemisinin

は

Sigma

より購入

した。各化合物は

DMSO (WAKO)

に溶解して使用した。

2.2.

細胞株

熱帯熱マラリア原虫

FCR-3

株

(ATCC 30932)

は

American Type Culture Collection

より入手し、

岡山大学薬学部分子医薬品情報学研究室及び国際感染症制御学研究室にて取り扱った。熱帯熱マラリア原虫

Dd2-attB

株及び遺伝子組換え原虫株は長崎大学熱帯医学研究所原虫学分野研究室にて取り扱った。遺伝子組換え原虫の扱いに関しては、長崎大学の規定に従い遺伝子組換え実験講習を受け、実験許可を得た。

2.3.

熱帯熱マラリア原虫の in vitro培養 ^{13), 17)}

2.3.1. RPMI1640 (-)

培地の調製

10.4 g

の

RPMI1640、 5.95 g

の

HEPES

を約

800 mL

の

milliQ

水に添加し、約

20

分撹拌した。

2.0 g

の

NaHCO

₃を加え、さらに

5

分撹拌した後、

1 M NaOH

を用いて

pH 7.2

に調製した。

Gentamicin sulfate (50 mg/mL)

を

0.5 mL

添加し (終濃度

25 µg/mL)、 1 L

にメスアップした。安全キャビネット内で

0.22

µm ボトルトップフィルターを用いて濾過滅菌を行い、これを

RPMI1640 (-)

培地とし、4°Cで保存し、1ヶ月以内に使用した。実際の培養には終濃度

10％と

なるようにヒト血清を添加した

RPMI1640 (+)

培地として使用した。

2.3.2.

ヒト赤血球と血清

血液は、マラリア原虫培養に血液を提供することに同意したボランティア

(A

型

)

より岡山大学保健管理センターにて得たもの、及び感染症検査が陰性かつ血液製剤の規格に適合しないものを日本赤十字社より得て使用した。

2.3.3.

熱帯熱マラリア原虫の継代培養

継代培養は、

24

穴培養プレートを用いて

Hematocrit

値

(HC

値

;

全容量に対する赤血球容量の割合

)

が

5%

、全量

1111 µL/well

になるようにして行った。培養条件は

O

2濃度

5.0%

、

CO

2濃

度

5.0%、 N

₂濃度

90%、温度は 37°C

とした。24穴培養プレートから感染赤血球を

1.5 mL

チュ

ーブに回収し、2500 rpm (TOMY MRX-150)、5分間、25°Cで遠心後、上清を除いた。感染赤血

球、

RPMI1640 (+)

培地、新鮮赤血球を用いて、感染率が

0.3％となるように、HC

値

50％の原

虫培養液を調製した。

24

穴培養プレート

1well

に

RPMI1640 (+)

培地を

1 mL

加え、さらに

HC

値

50％の原虫培養液を 111 µL

加え、HC値

5％として培養した。

液替え^注¹⁾は毎日行い、感染率^注²⁾が

3％を超えた際は 0.3％になるように継代培養を行った。

(20)

１９

この感染率は、スライドガラスに薄層塗抹標本を作製し、Diff-Quik染色^注³⁾

(シスメックス)

を行い、油浸光学顕微鏡

(×1000)

で計測した。

注

1)

原虫や赤血球に消費された培地の含有成分を補い、培地中に蓄積された代謝産物や赤血球の分解物を除くための操作である。プレートの各

well

の

RPMI1640 (+)

培地を

800

µL 除去後、新しい

RPMI1640 (+)

培地を

800 µL

加えた。

注

2)

全赤血球に対する熱帯熱マラリア原虫が感染した赤血球の割合である。複数の原虫が感染していても感染赤血球は

1

個として計測した。油浸光学顕微鏡

(× 1000)

で

20

視野観察し、

以下の計算式で算出した。

観測した視野の全感染赤血球数感染率 (%) ＝

観測視野数

1

視野内全赤血球数 × 100

注

3)

固定液、染色液

I、染色液 II

から成る。薄層塗抹標本を乾燥させた後、固定液に

1

秒間に

1

回の割合で

10

回程度浸し、染色液

I

では

3-4

回、染色液

II

では

10

回以上、染色を行い、

その後、水で洗い流し乾燥させた。染色は約

1-2

分で完了するため、これまで用いられてきたギムザ染色と比較すると染色に要する時間を大幅に短縮できる。

2.4.

熱帯熱マラリア原虫の薬剤感受性試験 ¹⁸⁾

培養した原虫を回収し、2500 rpm (TOMY MRX-150)、5分間、20°C で遠心し、上清を除去し

た。

RPMI1640 (+)

培地、新鮮赤血球、感染赤血球より

HC

値

3%

、初期感染率

0.3%

となるよう

に原虫培養液を調製した。目的の終濃度より

200

倍濃く調製した化合物をそれぞれの濃度について、

24 1well

あたり

5

µLずつ

duplicate

で加えた。Negative controlとして化合物の希釈に用いた溶媒を

5 µL、 Positive control

として

EC

₆₀濃度に相当する

Quinine

溶液を

5 µL

添加した

well

も

duplicate

で用意した。化合物を加えた

well

に、上記の通り調製した原虫培養

液を

995

µL ずつ加え、培養を開始した。初期感染率はこの原虫培養液から作製した薄層塗抹標本より算出した。

72

時間の培養後に

1well

あたり

1

枚の薄層塗抹標本を作製し、それぞれ感染率を測定し、以下の計算式に従い増殖率

(%)

を求めた。

72

時間後のサンプル作用時の感染率-初期感染率増殖率 (%) ＝

72

時間後のコントロールの感染率-初期感染率 × 100

片対数グラフの

x

軸に各サンプルの終濃度を、y軸に求めた増殖率をプロットし、EC₅₀値を算出した。

2.5.

熱帯熱マラリア原虫の同調培養法 ^{19), 20)}

これまでに報告されている赤内期熱帯熱マラリア原虫のステージを同調させる方法の中で、

最も正確かつ汎用されているものの一つに、

D-sorbitol

処理による同調法がある。この方法は、

Trophozoite

期、

Shizont

期のような

Ring

期以外のステージのマラリア原虫感染赤血球が

(21)

２０ D-sorbitol

処理により選択的に破壊されるという現象を利用し、マラリア原虫を

Ring

期に同調

させるものである。

D-sorbitol

で処理すると感染赤血球のうち、赤血球膜が弱っている

Trophozoite

期、

Shizont

期の熱帯熱マラリア原虫に感染した赤血球膜が壊れ、これら原虫は放

出されてしまい原虫自体も

D-sorbitol

による膜障害を受け増殖しなくなる。しかし、赤血球膜が強いままである

Ring

期の原虫が感染している赤血球膜は壊れず、そのまま増殖が可能である。また、

Schizont

期のマラリア原虫より放出された

Merozoite

期のマラリア原虫も、

D-sorbitol

障害を受けない。この

D-sorbitol

の作用を利用することにより

Ring

期の原虫を集めることができる。

培養したマラリア原虫感染赤血球を回収し、

2500 rpm (TOMY MRX-150)、10

分間、

25°C

で遠心し、上清を除去した。

5% D-sorbitol

水溶液 (37°C) を赤血球の

4-5

倍量添加し、5 分毎に転倒混和しながら

15

分間、室温で静置した。

2500 rpm (TOMY MRX-150)

、

10

分間、

25°C

で遠心し、上清を除去した。

RPMI1640 (+)

培地を加え、転倒混和後、

2500 rpm (TOMY MRX-150)

、

10

分間、

25°C

で遠心し、上清を除去する赤血球の洗浄操作を

3

回行った。初期感染率を約

1%

、

HC

値

5%になるように調製し、培養を開始した。 40-44

時間後の

Ring

期原虫が最も多い時点で

再度

5% D-sorbitol

処理を行った。１時間毎に原虫発育段階をモニターして

2

回目の処理時間を

決めると同調率の高い培養が行える。また、別のステージのマラリア原虫を実験に用いる時は同調後のマラリア原虫を数時間毎にモニターして観察すれば得られる。

Figure 8

に熱帯熱マラリア原虫の赤内期形態変化に関する時間を示す。

Figure 8.

熱帯熱マラリア原虫の赤内期形態変化に要する時間

2.6. N-89

及び

N-251

マラリア原虫は各ステージにおいて発現する遺伝子とタンパク質が異なることが知られて

いる ^{21), 22)}。例えばあるステージにのみ特異的に発現するものや、ステージの移行に従って増

減するものである。作用機序を解析する上で薬剤がどのようなステージに作用するかを調べることは重要であるため、

N-89

及び

N-251

の熱帯熱マラリア原虫に対するステージ特異的阻害の解析をした。Ring、Early trophozoite、Middle trophozoite、Late trophozoite、Schizont期へ同調したそれぞれのマラリア原虫に

3 µM

の

N-89

又は

N-251

を作用させた。薬剤を作用させた後、

0、6、12、24、48、72

時間後にスメアを作製し、各時間におけるマラリア原虫のステージの割

合を観察した。

(22)

２１

2.7.

プロテオーム解析

マラリア原虫は生物学的にあまり研究が進んでおらず、タンパク質研究で用いる抗体で市販されているものはほとんどない。そのため、1.7.で同定された

N-89

誘導体と親和性を有するマラリア原虫タンパク質を個々に解析することが難しい。本項目では

N-89

及び

N-251

の標的候補タンパク質を選抜するため、化合物作用時のプロテオーム解析を行った。

N-89

及び

N-251

は相互作用するタンパク質に対して作用していることが考えられるため、化合物を作用させた場合に、化合物とタンパク質の相互作用に起因してどのようなタンパク質が増減及び翻訳後修飾などの変化を示すかを網羅的に解析した。

2.7.1.

熱帯熱マラリア原虫タンパク質

lysate

の調製

6

12

枚分

(HC

値

5%)

の原虫を感染率が約

3

％になるまで

GIT

培地

(WAKO)

で培養した。感染赤血球浮遊液を

50 mL

遠心管

4

本に回収し、

2500 rpm (HITACHI CF 7D2)

、

10

分間、

4°C

で遠心した。遠心後、ヘモゾインを除去し、

pellet

へ

PBS (-)

と

0.3

％

Saponin

溶液

(in PBS (-))

を加え、転倒混和し (Saponin終濃度

0.15％ )、20

分間、37°Cでインキュベートした（

5

分毎に転倒混和した）。この過程で

Saponin

は赤血球膜及び

Parasitophorous vacuolar (PV)

膜は透過するが、Parasite plasma membraneを損傷せず、膜透過イオン勾配は維持できるので原虫を損傷することなく、赤血球膜を特異的に破壊し、溶血させる。溶血後、

3300 rpm (HITACHI CF 7D2)、 10

分間、4°Cで遠心した。さらに、

0.15％ Saponin

溶液で

3500 rpm、 10

分間、4°C で遠心し、上清を除去した。再び

0.15% Saponin

溶液で

3700 rpm、10

分間、

4°C

で遠心する。

次に

Saponin

溶液を除去するために

ice-cold PBS (-)

を用いて

4000 rpm (HITACHI CF 7D2)、 10

分間、

4°C

で遠心し、洗浄した。この洗浄操作を

2

回行った。この洗浄操作の過程で

50 mL

遠心管

4

本の

pellet

を

1

本にまとめた。上清を除き、

pellet

を

15 mL

遠心管に

1.5 mL

の

Rehydration/Sample buffer (Bio-Rad; 8 M urea, 2% CHAPS, 50 mM DTT, 0.2% (w/v) Bio-Lyte 3/10, 0.001% BPB)

で洗い出した。

Rehydration/Sample buffer

には

urea

が含まれているので

4°C

以下では

urea

が析出し、30°C以上では

urea

がカルバミル化する恐れがある。よって、その後の操作は室温で行った。全過程において用いる溶液には

Protease Inhibitor Cocktail for Plant Cell and Tissue Extracts (Sigma)

を

1:100

となるように添加した。

30

分間室温で静置し、続いて超音波破砕を

Branson Sonifire-250

を用いて行った

(

条件

; Duty cycle 40

％、

Output Control 3.0×5 cycle

、

1 cycle

は

5

回のシグナルで、

1 cycle

毎に

30

秒間氷上静置した

)。1.7 mL

タンパク質 Low binding チューブに移し、液体窒素中で

5

回凍結融解を行った。再度超音波破砕を同条件で

3 cycle

行い、15000 g、10分間、25°Cで遠心し、上清を

0.6 mL

タンパク質 Low bindingチューブに分注

し、

-80°C

で保存した。二次元電気泳動の直前に

100000 g

、

1

時間、

25°C

で超遠心し、不純物

を完全に取り除いた。

(23)

２２ 2.7.2.

タンパク質定量

2.7.1.

で調製したマラリア原虫タンパク質

Lysate

を

RC DC Protein Assay (Bio-Rad)

を用いて定量した。RC DC protein assayは

Lowry

法に基づき、界面活性剤だけでなく還元剤を含むサンプルにも適用可能に改良されており、

Urea

等を含むタンパク質サンプルにも応用可能となっている。検量線は、Albumin Standard (PIERCE) を用いて

0.2 mg/mL

から

1.5 mg/mL

のタンパク質濃度で作成した。

スタンダード、サンプルそれぞれ

25 µL

を

1.7 mL

タンパク質

Low binding

チューブに入れた。

RC1 reagent

、

RC2 reagent

それぞれ

125 µL

を加え

vortex

し、

1

分間室温でインキュベーションした。15000 g、

5

分間、

25°C

で遠心し、上清を除去した。RC1 reagentを

125 µL、 RC2 reagent

を

40 µL

加え

vortex

し、1分間室温でインキュベーションした。15000 g、5分間、25°Cで遠心

し、上清を除去し、

overnight

で

pellet

を乾燥させた。

A’

試薬

127 µL

を加え

vortex

し、

5

分間室温でインキュベーションした

(A’

試薬

; A

試薬

:S

試薬＝

50:1)

。

DC protein assay B

試薬

1 mL

を

加え

vortex

し、

15

分間室温でインキュベーションした。分光光度計

DU7400 (BECKMAN)

を

用いて

750 nm

の吸光度を測定した。

2.7.3.

二次元電気泳動

i) IPG

ストリップの膨潤

Lysate

をタンパク質濃度

80 µg/300 µL

となるように希釈し、フォーカシングトレイ

(Bio-Rad)

の各レーンに

300 µL

加えた。室温に戻した

IPG ReadyStrip pH 3-10

Linear 17 cm (Bio-Rad)

からゲルを保護しているカバーフィルムを剥がし、タンパク質

Lysate

を加えたフォーカシングトレイの各レーンにゲル面を下向きにし、気泡が入らないようにセットし、ミネラルオイルを

1.5 mL

重層した。ミネラルオイルは膨潤及びフォーカシング中にゲルの乾燥と二酸化炭素の吸収による

pH

のシフトを防ぐ役割がある。乾燥した場合、尿素が濃縮され析出する恐れがある。蓋をしたフォーカシングトレイを

PROTEAN IEF Cell (Bio-Rad)

にセットした。IEF Cellの

Rehydration Program

を

Active

に設定し、Active mode 50 V、20°C で

12

時間

IPG strip

を膨潤させた。

ii)

一次元目の泳動

;

等電点電気泳動

(Isoelectric focusing; IEF)

膨潤終了後、ウイック^＊

(Bio-Rad)

を滅菌

milliQ

水で湿らせ、フォーカシングトレイの白金線とゲル間に挿入した。フォーカシングトレイに蓋をして

IEF Cell

にセットし、次に記す条件で等電点電気泳動を行った。

＊

IPG strip

を用いた等電点電気泳動ではサンプル中に含まれる塩、イオン性の成分が多いと

電気泳動中に電圧が上がらない場合があり、ウイック

(ろ紙 )

を電極とゲルの間に挟み込むことでイオン成分の除去が可能となる。

(24)

２３

○フォーカシング条件

step 1: 250 V 15 min ; slow

step 2: 10000 V 2 hr ; linear

step 3: 10000 V 50000 V-hr ; rapid

step 4: 500 V 24 hr ; rapid iii)

平衡化

フォーカシング終了後、フォーカシングトレイから

IPG strip

を取り出しゲル面を傷付けないように余分なミネラルオイルをキムタオルで吸い取った。

Equilibration buffer I (Bio-Rad; 6 M urea, 2% SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 20% Glycerol, 2% (w/v) DTT)

を

4 mL/lane

加えたディスポーザブルトレイ (Bio-Rad) にゲル面を上にして

IPG strip

を入れ、室温で

20

分間震盪した。

震盪後、

Equilibration bufferⅡ (Bio-Rad; 6 M Urea, 2% SDS, 0.375 M Tris-HCl pH 8.8, 20%

Glycerol, 2.5% (w/v) Iodoacetamide) 4 mL

で、同様に室温で

10

分間震盪した。

iv)

二次元目電気泳動

; SDS-PAGE

二次元目のゲルは

PROTEAN II Ready Gels 12% Tris-HCl (Bio-Rad;

ゲルサイズ 160×158 mm) を用いた。ゲルは室温に戻した後、開封しコームを抜いて

milliQ

水で洗いゲルスタンド

Any Gel

スタンド (BioRad) に立てかけ固定した。

Equilibration buffer II

から取り出した

IPG

ストリップ

を泳動

buffer

で軽く洗浄し、キムタオルで余分な

Buffer

を吸い取った後、

IPG strip

用のウェル

にローメルトアガロース

ReadyPrep

^TM

Overlay Agarose (Bio-Rad; 0.5% (w/v) low melting point agarose, 1×Tris/Glycine/SDS buffer, 0.001％ BPB)

を加えたゲルのウェルにアプライした。マーカー用ウェルにタンパク質マーカー

Precision Plus Protein

^TM

Standard Plugs, Unstained (Bio-Rad)

をアプライし、再度ローメルトアガロースを流し込み、ゲルの封入及び固定をした。ゲルを泳動装置

PROTEAN II xi 2-D Cell (Bio-Rad)

にセットし、

20°C

の冷却水を泳動装置のセントラルクーリングコア

(

冷却水循環タンク

)

に循環させて

POWER PAC

^TM

1000 Power Supply (Bio-Rad)

を用いて

Tris/Glycine/SDS running buffer (Bio-Rad; 25 mM Tris/192 mM Glycine/0.1% SDS)

中、

16 mA/gel、30

分間、

24 mA/gel、 5

時間の条件で SDS-PAGEを行った。

2.7.4.

イメージの検出と解析

ゲルの染色は検出感度が銀染色と同等の

1-10 ng

で高い定量性を有する蛍光染色試薬

SYPRO

Ruby Protein Gel Stain (Bio-Rad)

を用いて行った。二次元電気泳動終了後のゲルを染色トレイに

入れ、固定液

(10% methanol, 7% acetic acid) 200 mL

を加え室温で

30

分間震盪した。固定液を捨て、

SYPRO Ruby Protein Gel Stain

を

200 mL

加え、室温で

16

時間震盪した。染色液を捨て、

脱色液

(10% methanol, 7% acetic acid) 200 mL

を加え、室温で

1

時間震盪した。脱色後のゲルは

milliQ

水で

30

分以上震盪し、

Molecular Imager FX Pro (Bio-Rad)

でゲルイメージを検出した。

薬剤非作用時と

N-89

作用時又は

N-251

作用時のプロテオーム比較解析には二次元電気泳動解

(25)

２４

析ソフトウェア

PDQuest version 8.0 (Bio-Rad)

を用いた。

2.7.5

タンパク質スポットの切り出し

ゲルイメージ上の目的タンパク質スポットに存在するタンパク質を同定するため、目的のスポットを

EXQuest

^TM

Spot Cutter (Bio-Rad)

で切り出し、

0.2 mL PCR tube

へ入れた。

2.7.6.

タンパク質のゲル内消化

切り出したゲルの入った

0.2 mL PCR tube

からピペットマンで水を除き、脱水液

(50% (v/v) CH

₃

CN, 25 mM NH

₄

HCO

₃

) 200

µLを加え、

37°C

で

30

分間震盪した。脱水液を取り除き、再度

脱水液

200 µL

を加え、37°Cで

30

分間震盪した。脱水液をほぼ完全に取り除き、穴をあけた蓋

をつけ、

15

分間遠心

evaporation

した。遠心

evaporation

後、蓋を注意して開け、

Trypsin solution (10 µg/mL Trypsin (Promega), 45 mM NH

₄

HCO

₃

) 50 µL

加え、

30

分間氷上静置した。余分な

Trypsin solution

を除き、

50 mM NH

4

HCO

3を

10

µL加え、

37°C

で

4

時間静置した。ゲルの入った

tube

から液を取り、新しい

0.2 mL PCR tube

へ移した。ゲルの入った

tube

に抽出液 (50% (v/v) CH₃

CN, 1% (v/v) trifluoroacetic acid (TFA)) 50 µL

加え、37°C で

30

分間震盪した。液を先程の新しい

0.2 mL PCR tube

へ移した。ゲルの入った

tube

へ再度抽出液

20 µL

加え、37°Cで

30

分間震盪し、

液を先程の新しい

0.2 mL PCR tube

へ移した。液のみが入った

0.2 mL PCR tube

に穴のあいた蓋をして

3

時間遠心

evaporation

し、完全に液体を蒸発させた。遠心

evaporation

後、蓋を閉め-20°C で保存した。

2.7.7.

タンパク質の同定 ¹⁶⁾

タンパク質の

Trypsin

消化物

(

ペプチド混合物

)

の

MS

、

MS/MS

解析のピークリスト

(

質量分析データ

)

と、データベースに登録されているアミノ酸配列解析データから計算して得られた仮想の質量分析データとのマッチングによりタンパク質を同定する

Peptide Mass Fingerprinting (PMF)

及び

MS/MS ion search

を行った。

NCBInr database

を用いて検索を行った場合、

PMF

及び

MS/MS ion search

において

MASCOT score

がそれぞれ

55

及び

28

よりも大きいとき、有意

(p<0.05)

に同定されたと判断した。

Swiss-Prot database

を用いて検索を行った場合、

PMF

及び

MS/MS ion search

において

MASCOT score

がそれぞれ

56

及び

28

よりも大きいとき、有意

(p<0.05)

MASCOT score

は以下の式に基づいて算出された。

Score=-10×logP

^＊

＊

P

は与えられたヒットが無作為事象である絶対確率

HPLC-Chip/MS

を用いてタンパク質同定を行った場合、Peptide scoreが

11

よりも大きいとき

有意

(p<0.05)

(26)

２５

用いた質量分析装置、検索エンジン及びデータベースを以下に記す。

MALDI-TOF/TOF/MS

システム

; Autoflex III (Bruker Daltonics) LC-MS/MS

システム; HPLC-Chip/MS (Agilent Technologies) 検索エンジン

; MASCOT

データベース

; NCBInr (version 2012_04_15, 17848406 sequences, 6126535335 residues;

P.falciparumタンパク質の検索

)

又は

Swiss-Prot (version 2012_03, 535248 sequences, 189901164 residues;

ヒトタンパク質の検索

)

2.8. Western blotting 2.8.1. SDS-PAGE

Polyacrylamide gel

はゲル濃度が

12.5%

、

12

ウェル又は

18

ウェルの

E-R12.5L (ATTO;

ゲルサイズ

90×83 mm)

を用いた。ゲルプレートからコームを抜き取り

Tris/Glycine/SDS running buffer

でウェルを洗浄した。ゲルをラピダス・ミニスラブ電気泳動槽

AE-6500 (ATTO)

泳動槽にセットし、

Tris/Glycine/SDS running buffer

を泳動槽に加え、sampleを各ウェルに

20

µLアプライした。タンパク質スタンダードは

Chemiluminescent detection

用に

ECL DualValue Western Blotting Markers (Amersham Biosciences)

を、SYPRO Ruby Protein Gel Stain用に

Protein Marker Broad Range (BioLabs)

を用いた。電気泳動は定電流

20 mA/Gel

、最高電圧

250 V

、

70

分間の条件で行った。

2.8.2 Semi-dry blotting

電気泳動終了後の

Polyacrylamide gel

を

Cathode buffer (25 mM Tris, pH 9.4, 40 mM Glycine, 10% methanol) 100 mL

に

15

分間浸しゲルの平衡化を行った。

Immobilon

^TM

transfer membrane

を

15

秒間、

100% methanol

に浸し、その後

2

分間

milliQ

水に浸し

Anode buffer II (25 mM Tris, pH 10.4, 10% methanol)

に

5

分間浸し平衡化を行った。Anode buffer I (0.3 M Tris, pH 10.4, 10% methanol) にろ紙

2

枚、Anode buffer IIにろ紙

1

枚、Cathode bufferにろ紙

3

枚を浸し、Blotting paperを調製した。平衡化終了後、トランスファーユニット

Hoefer

^TM

TE77 semi-dry transfer units (Amersham Biosciences)

の

Base (Anode)

側に

Blotting paper 3

枚

(Anode buffer I

に浸したろ紙

2

枚、

Anode buffer II

に浸したろ紙

1

枚

)

、メンブレン、ゲルの順に置き、さらに

Blotting paper 3

枚

(Cathode buffer

に浸したろ紙

3

枚

)

を重ねて

Cover (Cathode)

をセットして

0.8 mA/cm

²、60分の条件でトランスファーを行った。

2.8.3.

ブロッキング及び抗体反応

メンブレンを

5% BSA in TBS-T (20 mM Tris, pH7.4, 68 mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween 20)

で

25°C、

1

時間インキュベ−ションして抗体の非特異的な結合をブロッキングし、TBS-T でメンブレン

(27)

２６

を

2

回リンスした。一次抗体を

5% BSA in TBS-T

で最適抗体濃度に希釈後、メンブレンに添加

して

4°C

、

overnight

でインキュベーションした。

TBS-T

でメンブレンを

2

回リンス後、十分量

の

TBS-T

で洗浄した。（15分間×1回、

5

分間×3回）

HRP (Horseradish peroxidase)

標識されている二次抗体を

TBS-T

で最適抗体濃度に希釈後、メンブレンに添加して

25°C、 1

時間インキュベーションし、

TBS-T

でメンブレンを

2

回リンス後、

十分量の

TBS-T

で洗浄した。（

15

分間×1回、

5

分間×3回）

本実験で用いた一次抗体

;

・

Mouse anti-PfERC mAb

・

Anti-BiP antibody sc-33757 (SANTA CRUZ)

・

Monoclonal anti-heat shock protein 90 antibody clone AC-16 (Sigma-Aldrich)

本実験で用いた二次抗体

;

・

Anti-Mouse IgG HRP linked whole antibody (from sheep) (Amersham Biosciences)

・

Anti-Rabbit IgG HRP linked whole antibody (from donkey) (Amersham Biosciences)

2.8.4. Chemiluminescent detection (化学発光による検出)

メンブレンをラップ上に置き、調製しておいた検出試薬 (ECL plus Western blotting detection

reagents kit (GE Healthcare)

の

Solution A:Solution B=40:1

で混合) を添加し、

5

分間静置後

Versa Doc Imaging System Model 5000 (Bio-Rad)

により撮影し、

Quantity One 1-D Analysis Software (Bio-Rad)

を用いて解析した。

2.8.5.

ストリッピング

検出後のメンブレンを

milliQ

水で

wash

後、

2 M Glycine buffer (pH2.8)

で

10

分間×

3

回浸透させ、抗体と抗原を遊離させた後、

milliQ

水でメンブレンを

wash

し、

TBS-T

で

2

回リンスした

後、

2.8.3.

ブロッキング及び抗体反応以降の操作を行った。

2.9. PfERC

2.9.1. Lysate

の調製

6

4

枚分の原虫を感染率が約

2-3%

になるまで

GIT

培地で培養し、

50 mL

遠心管を用いて感染赤血球を

3600 rpm

、

5

分間、

4°C

で遠心して回収した。遠心後、上清を除去し、

PBS (-)

と

0.3% Saponin

溶液

(in PBS (-))

を加え総量を

14 mL

とし、転倒混和した(Saponin 終濃度

0.15％ )。転倒混和して溶血後、3600 rpm、 5

分間、4°Cで遠心した。再び

0.15% Saponin

溶液を加え、

3600 rpm、 5

分間、

4°C

遠心し、上清を除去した後

ice-cold PBS (-)を用いて 3600 rpm、

5

分間、

4°C

で遠心し、洗浄した。この後、

pellet

を

1.7 mL

タンパク質

Low binding

チューブに移し、ice-cold PBS (-) で

15000 rpm、5

分間、4°C で遠心し再度洗浄した。この操作を

2

回行った。全過程において用いる溶液には

Protease Inhibitor Cocktail for Plant Cell and Tissue Extracts

(28)

２７

を

1/100

容量となるように添加した。上清を除き、pellet に適量の

PBS-T (PBS with 0.1% Tween 20

²³⁾

)

又は

Tris buffer-Tween 20 (20 mM Tris, pH 8.0, 0.15 M NaCl, 0.1% Tween 20

²³⁾

)

を加えマラリア原虫を可溶化した後、15000 rpm、5分間、4°Cで遠心し、上清を相互作用解析用

sample

とした。

Ca

²⁺存在の有無による影響を検討するため、タンパク質の抽出は

1 mM Ca

²⁺の非存在下と存在下の場合で行った。

2.9.2.

免疫沈降

Dynabeads Protein-G (Invitrogen) 50 µL

を

1.7 mL

タンパク質

Low binding

チューブへ加え、遠心後、上清を除去した。200 µL の

anti PfERC mAb in PBS-T

を加え、10分間、rotationした。遠心し、上清除去後、200 µL PBS-Tで

wash

した。上清除去後にマラリア原虫タンパク質

Lysate 200-1000 µL

加え、室温で

10-60

分間

rotation

した。上清

(=unbound sample)

を回収し、

200 µL

の

PBS (-)

での

Beads

の

wash

を

3

回行った。

60 µL

の

1× Sample buffer (62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 10% Glycerol, 5% 2-Mercaptoethanol, 0.001% BPB)

を加え、

5

分間

boiling

し、上清を免疫沈降サンプル

(=IP sample)

として得た。

上記の実験を

1 mM Ca

²⁺の非存在下と存在下の場合で行い、各

sample

を

20 µL

ずつ泳動した。

Ca

²⁺非存在下の場合のサンプルはタンパク質バンドの分離能向上を目的として、レディーゲル

J PII 12.5% (Bio-Rad;

ゲルサイズ

160×158 mm)

を用いて

16 mA/gel

、

30

分間、

24 mA/gel

、

5

時間の条件で

SDS-PAGE

を行った。

Ca

²⁺存在下の場合は

2.8.1.と同様の条件で SDS-PAGE

を行った。

2.9.3. MBP (Maltose binding protein)-ΔPfERC

当研究室ではこれまでに PfERC の組換え体

(Δ

PfERC) を作製している。熱帯熱マラリア原

虫

FCR-3

株のゲノム

DNA

から

PCR

によって、PfERCの遺伝子配列からシグナル配列を除いた

部分

(Δ

PfERC) を

pMAL-p

プラスミドに組み込んだ。ΔPfERC を組み込んだ

pMAL-p

プラス

ミドを大腸菌に導入し、大腸菌内で

MBP-Δ

PfERCとして大量発現させた。

MBP-ΔPfERC

にプロテアーゼ

Factor Χa (New England Biolabs)

を作用させ、ΔPfERC を得た

(Figure 9)

。

(29)

２８ Figure 9.

ΔPfERC の作製

ΔPfERCを作製する際、大腸菌内では

MBP

タグがΔPfERCに結合した状態

(MBP-ΔPfERC)

で大量発現させており、次項

2.9.4. Pull down assay

はこの

MBP-ΔPfERC

を用いて行った。

2.9.4. Pull down assay

Amylose magnetic beads (New England Biolabs) 100

µL を

1.7 mL

タンパク質

Low binding

チューブへ加えた。

Magnetic Particle Separator (Invitrogen)

にセットし、上清を除去した。

MBP column binding buffer (20 mM Tris-HCl, pH7.4, 0.2 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) 500 µL

を加え

vortex

し、Magnetic Particle Separatorにセットし、上清を除去した。この

wash

を再度行った。Sample

300

µL を加え、

1

時間、

4°C

で

rotation

した

(Pre-clear)

。

Pre-clear

後の

sample

を新しい

1.7 mL

タンパク質

Low binding

チューブに移した。

wash

した新しい

Amylose magnetic beads 50

µL へ

MBP-

ΔPfERC (または

control

として

MBP) 300 µL

を加え

4°C

、

1

時間で

rotation

した。

Magnetic Particle Separator

にセットし、上清を除去した。Tris buffer (20 mM Tris, pH 8.0, 0.15 M NaCl) によって

3

回

wash

した。

Pre-clear

後の

sample 300 µL

を加え、

4°C、 1

時間で

rotation

した。

Magnetic Particle Separator

にセットし、上清を

sample

として得た

(

上清

=Pull down

後

sample)

。

Beads

を

Tris buffer

によって

3

回

wash

した。

Beads

に

1×Sample buffer 60 µL

を加え、

5

分間

boiling

した。

Magnetic Particle Separator

にセットし、上清を

sample

として得た

(=Pull down sample)

。上記の実験を

1 mM Ca

²⁺の非存在下と存在下の場合で行い、各

sample

を

20 µL

ずつ

2.8.1.と

同様の条件で

SDS-PAGE

を行った。

2.10.

表面プラズモン共鳴法

(Surface Plasmon Resonance; SPR)

解析は

ProteOn XPR36

システム (Bio-Rad) によって行った。GLH Sensor Chipへアミンカップリング法によってΔPfERC 又はコントロールとして

MBP

を結合させた。ランニング緩衝液に

環状過酸化物の抗マラリア作用機序の解析

博士論文