クロコブタケからの血管新生阻害活性物質の探索

(1)

クロコブタケからの血管新生阻害活性物質の探索

～血管内皮細胞増殖阻害活性を指標として～

S e a r c h f o r A n t i a n g i o g e n i c C o n s t i t u e n t s f r o m H y p o x y l o n t r u n c a t u m

～ E v a l u a t i o n o f A n t i p r o l i f e r a t i v e A c t i v i t i e s a g a i n s t Va s c u l a r E n d o t h e l i a l C e l l s ～

平成 2 3 年度入学

深井みゆき ( F u k a i , M i y u k i )

指導教員

小山清隆

(2)

P a g e 序論

第一章キノコ 1

第二章細胞増殖

第一節 C D K とサイクリン 5

第二節細胞周期 9

第三章血管新生とがん 1 5 第四章 V E G F と V E G F 受容体

第一節 V E G F 1 9

第二節 V E G F 受容体 2 1 第五章分子標的治療薬 2 5

本論

研究目的 2 9

第一章クロコブタケ（ H y p o x y l o n t r u n c a t u m ）子実体からの

H U V E C 増殖阻害化合物の探索 3 1

第一節 H U V E C 増殖阻害 3 5 第二節クロコブタケ子実体抽出エキスの

H U V E C 増殖阻害活性 3 6

第三節クロコブタケ子実体 C H C l

3

エキスからの

H U V E C 増殖阻害化合物の探索 3 7

第四節クロコブタケ子実体 M e O H エキスからの

構造類縁体の探索 4 3

第五節 H y p o x y l o n o l 類の構造解析 4 8

(3)

第二章血管新生阻害作用の検討 9 4

第一節細胞選択性 9 5

第二節細胞毒性試験 9 7

第三節 H U V E C 遊走阻害試験 9 8 第四節 H U V E C 管腔形成阻害試験 1 0 0 第三章標的分子の探索 1 0 2 第一節 K D R リン酸化阻害試験 1 0 3 第二節 c D N A マイクロアレイ解析を用いた

標的分子の探索 1 0 4

第三節リアルタイム R T- P C R 1 0 9

結語 111

実験の部 11 7

第一章クロコブタケ ( H y p o x y l o n t r u n c a t u m ) 子実体からの

H U V E C 増殖阻害化合物の探索

第一節 H U V E C 増殖阻害試験 1 2 2 第二節クロコブタケ子実体抽出エキスの

H U V E C 増殖阻害活性 1 2 4

第三節クロコブタケ子実体 C H C l

3

エキスからの

H U V E C 増殖阻害化合物の探索 1 2 5

第四節クロコブタケ子実体 M e O H エキスからの

構造類縁体の探索 1 3 2

第五節スペクトルデータ 1 3 9

(4)

第二章血管新生阻害作用の検討

第一節細胞選択性 1 4 6

第二節細胞毒性試験 1 5 0 第三節 H U V E C 遊走阻害試験 1 5 2 第四節 H U V E C 管腔形成阻害試験 1 5 4 第三章標的分子の探索

第一節 K D R リン酸化阻害試験 1 5 5 第二節 c D N A マイクロアレイ解析を用いた

標的分子の探索

1 5 7 第三節リアルタイム R T- P C R 1 6 0

参考文献 1 6 2

謝辞 1 6 4

付表

(5)

略語一覧

A L K a n a p l a s t i c l y m p h o m a k i n a s e A M L a c u t e m y e l o g e n o u s l e u k e m i a B A D B c l 2 a n t a g o n i s t o f c e l l d e a t h B c r - A b l b c r - a b l f u s i o n p r o t e i n

B R A F v - r a f m u r i n e s a r c o m a v i r a l o n c o g e n e h o m o l o g B 1 C C R 4 C - C c h e m o k i n e r e c e p t o r t y p e 4

C D c l u s t e r o f d i f f e r e n t i a t i o n C H C l

3

c h l o r o f o r m

C M L c h r o n i c m y e l o g e n o u s l e u k e m i a C O S Y c o r r e l a t e d s p e c t r o s c o p y

C O X c y c l o o x y g e n a s e

C T L A - 4 c y t o t o x i c T- l y m p h o c y t e a n t i g e n 4 D M S O d i m e t h y l s u l f o x i d e

D N M T D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e

E G F R e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r E I e l e c t r o n i o n i z a t i o n

E l k 1 e t s - l i k e g e n e p r o d u c t

E M L 4 e c h i n o d e r m m i c r o t u b u l e - a s s o c i a t e d p r o t e i n - l i k e 4 E R K e x t r a c e l l u l a r s i g n a l - r e g u l a t e d k i n a s e

e x t . e x t r a c t

F B S f e t a l b o v i n e s e r u m f . c . f i n a l c o n c e n t r a t i o n F l k - 1 f e t a l l e v e r k i n a s e 1

F l t - 1 f m s - l i k e t y r o s i n e k i n a s e 1

(6)

F l t - 4 f m s - l i k e t y r o s i n e k i n a s e 4

F r. F r a c t i o n

F y n p r o t o - o n c o g e n e t y r o s i n e - p r o t e i n k i n a s e F y n G I S T g a s t r o i n t e s t i n a l s t r o m a l t u m o r

G r b 2 g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r - b o u n d p r o t e i n 2 H C l h y d r o g e n c h l o r i d e

H E R 2 h u m a n E G F R - r e l a t e d 2 H D A C h i s t o n e d e a c e t y l a s e

H h h e d g e h o g

H M B C h e t e r o n u c l e a r m u l t i p l e b o n d c o n n e c t i v i t y H M Q C h e t e r o n u c l e a r m u l t i p l e q u a n t u m c o h e r e n c e H R h i g h r e s o l u t i o n

H U A E C h u m a n u m b i l i c a l a r t e r y e n d o t h e l i a l c e l l s H U V E C h u m a n u m b i l i c a l v e i n e n d o t h e l i a l c e l l s i n s o l . i n s o l u t i o n

J A K J a n u s k i n a s e

K D R k i n a s e d o m a i n r e c e p t o r

L c k l y m p h o c y t e c e l l - s p e c i f i c p r o t e i n - t y r o s i n e k i n a s e M A P m i t o g e n - a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e

M C L m a s t c e l l l e u k e m i a M E K M A P K / E R K k i n a s e

M E M m i n i m u m e s s e n t i a l m e d i u m M e O H m e t h a n o l

m p m e l t i n g p o i n t

m T O R m a m m a l i a n t a r g e t o f r a p a m y c i n

(7)

M T T m e t h y l t h i a z o l y l t e t r a z o r i u m N D n o t d e t e r m i n a t i o n

N E T n e u r o e p i t h e l i a l c e l l - t r a n s f o r m i n g g e n e p r o t e i n N H D F n o r m a l h u m a n d e r m a l f i b r o b l a s t

n - h e x a n e n o r m a l - h e x a n e O D o p t i c a l d e n s i t y O D S o c t a d e c y l s i l y l

P B S p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e

P D G F R p l a t l e t d e r i v e d g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r

P h + A L L P h i l a d e l p h i a - p o s i t i v e s u b t y p e o f a c u t e l y m p h o b l a s t i c l e u k e m i a

R a f r a f g e n e p r o d u c t

R A N K L r e c e p t o r a c t i v a t o r o f n u c l e a r f a c t o r - к B l i g a n d R a s r a s o n c o g e n e p r o d u c t

R B r e t i n o b l a s t o m a - a s s o c i a t e d p r o t e i n r p m r o t a t i o n p e r m i n u t e

R t r e t e n t i o n t i m e

S E G A s u b e p e n d y m a l g i a n t c e l l a s t r o c y t o m a S h b S H 2 d o m a i n - c o n t a i n i n g a d a p t e r p r o t e i n B S H 2 S r c h o m o l o g y 2 d o m a i n

s o l . s o l u t i o n

T S A D T c e l l - s p e c i f i c a d a p t e r p r o t e i n

W S T- 8 2 - ( 2 - m e t h o x y - 4 - n i t r o p h e n y l ) - 3 - ( 4 - n i t r o p h e n y l ) - 5 -

( 2 , 4 - d i s u l f o p h e n y l - 2 H - t e t r a z o l i u m , m o n o s o d i u m s a l t

5 - F U 5 - f l u o r o p y r i m i d i n e - 2 , 4 ( 1 H , 3 H ) - d i o n e ( f l u o r o u r a c i l )

(8)

Figure 一覧

Page

Fig． 1． Classification of Mycota 4

Fig． 2． The Mammalian CDK Family 6

Fig． 3． Mammalian Proteins with A Cyclin-box Domain 8

Fig． 4． Overview of Cell Cycle 9

Fig． 5． G1 Phase of Cell Cycle 11

Fig． 6． G1 and S Phases of Cell Cycle 13

Fig． 7． G2 and M Phases of Cell Cycle 14

Fig． 8． Anatomy of Blood Vessel 17

Fig． 9． Process of Vasculogenesis 17

Fig． 10 ． Process of Physiological and Pathological Angiogenesis 18

Fig． 11 ． Comparison of Structures of the VEGF Family 20

Fig． 12 ． Interactions of VEGF Family with Their Receptors 21

Fig． 13 ． VEGF-A/VEGFR-2 Signaling in Vascular Endothelial Cell Proliferation and Migration 23

Fig． 14 ． VEGF-A/VEGFR-2 Signaling in Vascular Endothelial Cell Survival 24

Fig． 15 ． Isolated Compounds from H . truncatum 33

Fig． 16 ． Benzo[ j ]fluoranthene Derivatives from Natural Resource 34

Fig． 17 ． Isolation Procedure of H. truncatum CHCl

3

ext. Fr. D 40

Fig． 18 ． Isolation Procedure of H. truncatum CHCl

3

ext. Fr. B 41

Fig． 19 ． Isolated Compounds from H. truncatum CHCl

3

ext. 42

Fig． 20 ． Isolation Procedure of H. truncatum MeOH ext. Fr. D 45

Fig． 21 ． Isolation Procedure of H. truncatum MeOH ext. Fr. E 46

(9)

Fig． 22 ． Isolated Compounds from H. truncatum MeOH ext. 47 Fig． 23 ．

¹

H-

¹

H COSY and HMBC Correlations of HT-1 in acetone- d

6

50 Fig． 24 ． ORTEP Drawing of HT-1 Obtained by X-ray Analysis 50

Fig． 25 ． Structure of Hypoxylonol C （ 23） 51

Fig． 26 ．

¹

H-

¹

H COSY and HMBC Correlations of HT-2 in acetone- d

6

54 Fig． 27 ． ORTEP Drawing of HT-2 Obtained by X-ray Analysis 54

Fig． 28 ． Structure of Hypoxylonol F （ 24） 55

Fig． 29 ． ORTEP Drawing of HT-3 Obtained by X-ray Analysis 57

Fig． 30 ． Structure of Hypoxylonol B （ 25） 58

Fig． 31 ． CD spectra of Hypoxylonol D（ 26 ）， E （ 27） and F （ 24） 60

Fig． 32 ． Structure of Hypoxylonol D（ 26 ） 61

Fig． 33 ． ORTEP Drawing of HT-5 Obtained by X-ray Analysis 63

Fig． 34 ． Structure of Hypoxylonol E （ 27） 64

Fig． 35 ． CD spectra of Hypoxylonol A （ 28）， B （ 25） and C （ 23） 66

Fig． 36 ． Structure of Hypoxylonol A （ 28） 67

Fig． 37 ．

¹

H-

¹

H COSY, HMBC and NOESY Correlations of HT-7

in acetone- d

6

69 Fig． 38 ． CD spectra of Hypoxylonol E （ 27）， F（ 24） and G （ 29） 69

Fig． 39 ． NOESY Correlations of HT-7 in acetone- d

6

70 Fig． 40 ． Structure of Hypoxylonol G（ 29 ） 71

Fig． 41 ．

¹

H-

¹

H COSY and HMBC Correlations of HT-8 in CDCl

3

73 Fig ． 42． ORTEP Drawing of HT-8 Obtained by X-ray Analysis 73

Fig． 43 ． Structure of Truncatone（ 7 ） 74

Fig． 44 ．

¹

H-

¹

H COSY and HMBC Correlations of HT-9 in CD

3

OD 76

Fig． 45 ．

¹

H-NMR Spectra of HT-9 and Methylated HT-9 in CD

3

OD 77

(10)

Fig． 46 ． CD spectra of Hypoxylonol B （ 25）， C （ 23） and H（ 30 ） 78

Fig． 47 ． Long-range HMBC and NOESY Correlations of HT-9

in CD

3

OD 78

Fig． 48 ． ORTEP Drawing of 4- O -Methyl hypoxylonol H

Obtained by X-ray Analysis 79

Fig． 49 ． Structure of Hypoxylonol H（ 30 ） 81

Fig． 50 ．

¹

H-

¹

H COSY, HMBC and Long-range HMBC Correlations

of HT-10 CD

3

OD 83

Fig． 51 ． CD spectra of Hypoxylonol E （ 27）， F（ 24） and I （ 31） 83

Fig． 52 ． ORTEP Drawing of Me-HT-10 Obtained by X-ray Analysis 84

Fig． 53 ． Structure of Hypoxylonol I（ 31） 86

Fig． 54 ．

¹

H-

¹

H COSY and HMBC Correlations of HT-11 in CD

3

OD 88 Fig． 55 ． CD spectra of Hypoxylonol B （ 25）， C （ 23） and J （ 32） 88

Fig． 56 ． Structure of Hypoxylonol J（ 32） 89

Fig． 57 ．

¹

H-

¹

H COSY and HMBC Correlations of HT-12 in CD

3

OD 91 Fig． 58 ． CD spectra of Hypoxylonol B （ 25）， C （ 23） and K （ 33） 91

Fig． 59 ． ORTEP Drawing of HT-12 Obtained by X-ray Analysis 92

Fig． 60 ． Structure of Hypoxylonol K（ 33 ） 93

Fig． 61 ． Cytotoxicity of Hypoxylonol C 97

Fig． 62 ． Inhibitory Effect of Hypoxylonol C for Migration

of HUVEC 99

Fig． 63 ． Inhibitory Effect of Hypoxylonol C for Tubule Formation

of HUVEC 101

Fig． 64 ． Pathway of Cell Cycle 106

Fig． 65 ． Pathway of Adherens Junction 107

(11)

Fig． 66 ． Pathway of Focal Adhesion 108

Fig． 67 ． Effect of Hypoxylonol C on mRNA Expression

of Cyclins and CDKs 110

Fig． 68 ． Effect of Hypoxylonol C on mRNA Expression

of Adhesion Molecules 110

Fig． 69 ． HUVEC Growth Inhibition Assay Method 122

Fig． 70 ． Isolation Procedure of the Compounds

from H. truncatum CHCl

3

ext. Fr. D 126

Fig． 71 ． Isolation Procedure of the Compounds

from H. truncatum CHCl

3

ext. Fr. B 127

Fig． 72 ． Isolation Procedure of the Compounds

from H. truncatum MeOH ext. Fr. D 133

Fig． 73 ． Isolation Procedure of the Compounds

from H. truncatum MeOH ext. Fr. E 134

Fig． 74 ． HUAEC Growth Inhibition Assay Method 146

Fig． 75 ． HeLa Growth Inhibition Assay Meth od 148

Fig． 76 ． NHDF Growth Inhibition Assay Method 149

Fig． 77 ． Cytotoxicity Assay Method 151

Fig． 78 ． HUVEC Migration Assay Method 152

Fig． 79 ． HUVEC Tubule Formation Assay Method 154

Fig． 80 ． KDR Kinase Inhibitory Assay Method 156

Fig． 81 ． Method of RNA Extraction 158

Fig． 82 ． Method of Real-time RT-PCR 161

(12)

Table 一覧

Page

Table 1 ． Molecular-targeted Drugs 27

Table 2． Effect of the Compounds from H. truncatum CHCl

3

ext.

on HUVEC Prolifelation Assay 42

Table 3． Effect of the Compounds from H. truncatum MeOH ext.

on HUVEC Prolifelation Assay 47

Table 4．

¹

H- and

¹³

C-NMR Spectral Data of Hypoxylonol C （ 23）

in acetone- d

6

51 Table 5．

¹

H- and

¹³

C-NMR Spectral Data of Hypoxylonol F （ 24）

in acetone- d

6

55 Table 6．

¹

H- and

¹³

C-NMR Spectral Data of Hypoxylonol B （ 25）

in acetone- d

6

58 Table 7．

¹

H- and

¹³

C-NMR Spectral Data of Hypoxylonol D （ 26）

in acetone- d

6

61 Table 8．

¹

H- and

¹³

C-NMR Spectral Data of Hypoxylonol E （ 27）

in acetone- d

6

64 Table 9．

¹

H- and

¹³

C-NMR Spectral Data of Hypoxylonol A （ 28）

in acetone- d

6

67 Table 10．

¹

H- and

¹³

C-NMR Spectral Data of Hypoxylonol G （ 29）

in acetone- d

6

71 Table 11．

¹

H- and

¹³

C-NMR Spectral Data of Truncatone （ 7）

in CDCl

3

74 Table 12．

¹

H- and

¹³

C-NMR Spectral Data of Hypoxylonol H （ 30）

in CD

3

OD 80

(13)

Table 13．

¹

H- and

¹³

C-NMR Spectral Data of Hypoxylonol I （ 31）

in CD

3

OD 85

Table 14．

¹

H- and

¹³

C-NMR Spectral Data of Hypoxylonol J （ 32）

in CD

3

OD 89

Table 15．

¹

H- and

¹³

C-NMR Spectral Data of Hypoxylonol K （ 33）

in CD

3

OD 93

Table 16． Effect of the Compounds from H. truncatum on HUAEC,

HeLa cells and NHDF Growth inhibitory Assay 96

Table 17．Inhibitory Effect of Hypoxylonol C for Migration of HUVEC 99 Table 18．Inhibitory Effect of Hypoxylonol C for KDR Phosphorylation 103

Table 19． The Pathways including up-regulated genes 105

Table 20． The Pathways including down-regulated genes 105

(14)

序論

(15)

第一章キノコ

現在，地球上には約 1 5 0 万種の生物が存在することが確認されており，生物界は細胞構造やエネルギーの摂取法により生産者，消費者，還元者に大別される．生産者である植物は，太陽エネルギーを光合成により二酸化炭素を固定して有機物を作り出し，消費者である動物は植物が生産した有機物や他の動物を食する．さらに，植物や動物は，還元者である菌類によって分解されて再び無機物へと還元され，これら三生物群が共同生活を営むことによって永遠の生命と生活が保証されている．菌類の生態系における役割として，生物の死骸を分解する分解者としての働きが強調される．しかし，実際に菌類の生態を観察すると，分解者としての働きはもちろんのこと，植物病原菌に代表される寄生者や線虫捕食菌のような捕食者，あるいは，樹木や藻類，昆虫類と相利共生する共生者といった多芸多才な生態を観察できる．陸生菌類の 2 大系統といえる担子菌類と子嚢菌類は様々な陸上生物の寄生者または共生者であり，強力な分解者でもある．担子菌亜門は約 3 万種からなり，菌類の 3 分の 1 を占める大きなグループである．担子菌類は海水や淡水中からも報告されるが，ほとんどが陸生であることから陸上で多様化した系統であると考えられている．子嚢菌亜門

は 5 6 7 4 属，約 6 万 4 千種からなる菌類で最も大きなグループで，真

核生物の中でも多様性に富む生物群の一つである．子嚢菌類は陸上お

よび水中のいずれにも広く分布している．地球上の極限的な場所，例

えば南極大陸の凍結した岩の内部，深海の木材や堆積物などから子嚢

菌類が分離された報告もある．また，子嚢菌の種の約 4 0 ％が藻類との

共生体である地衣を形成し，地球の陸上表面の約 8 ％を被覆している．

(16)

「キノコ」と呼ばれる大形の生殖器，つまりは子実体を形成する菌は一部であり，その大部分が担子菌亜門に，それ以外は子嚢菌亜門に属

する（ F i g ． 1 ）．この俗にキノコと呼ばれる菌類はシダ植物や種子植

物と時代を同じくして地球上に出現し，長い進化の歴史を背景に，生活体は単純であるが極めて複雑多彩な子実体をもつようになった．

^{1 , 2}^）

昔から一部のキノコ類は，食用だけでなく薬用としても利用されてきた．中国最古の薬物書『神農本草経』の上品には「赤芝」，「黒芝」，

「青芝」，「白芝」，「黄芝｣，｢紫芝｣の六芝および｢茯苓｣が，中品には「猪苓」および「桑耳」が，下品には「雷丸」が収載されている．六芝のうち主なものは紫芝と赤芝で，これらは霊芝と称するマンネンタケ G a n o d e r m a l u c i d u m （ L e y s s . e x . F r. ） K a r s t またはその近縁種の子実体である．茯苓と猪苓は「桂枝茯苓丸」，｢猪苓湯｣，｢五苓散｣などの漢方処方に使用される．桑耳は『薬性論』においては桑檽（そうじ ) ，桑黄（そうおう）とも呼ばれ，それぞれキクラゲの類，サルノコシカケの類をさす．梁の『本草経集注』には「鬼蓋（きがい）」と「馬勃（ばぼつ）」があげられている．鬼蓋はヒトヨタケ科のヒトヨタケ C o p r i n u s a t r a m e n t a r i u s （ B u l l . ） F r. の子実体で小児の諸癇などに用いられる．馬勃はホコリタケ科のオニフスベ L a s i o s p h a e r a f e n z l i i R e i c h . などの子実体で，止血，抗炎症薬として用いられる．唐代の『新修本草』には「槐耳」が収載されているが，これはエンジュ（中国名：槐） S o p h o r a j a p o n i c a L . につくキクラゲ A u r i c u l a r i a a u r i c u l a （ L . e x H o o k . ）

U n d e r w ．で，止血薬として用いられ，また食用にもしている．『酉陽

雑爼（ゆうようざっそ）』には「猢猻眼（こそんがん）」の名がみられ

るが，これは桑黄と同類とされている．日本でも「梅寄生」と称する

生薬に抗がん作用があるとして民間で用いられているが，これも同様

(17)

のものである．「雷丸」はサルノコシカケ科のライガンキン P o l y p o r u s m y l i t t a e C o o k . e t M a s s . の菌核で，条虫駆除薬とする．『本草拾遺』には，「土菌」と「鬼筆」が収載されている．土菌のうちの 1 種「仙人帽」は，スッポンタケ科のキヌガサタケ D i c t y o p h o r a i n d u s i a t a

F i s c h . で，血病に主効があるとされている．鬼筆はスッポンタケ科の

キツネノタイマツ P h a l l u s r u b i c u n d u s （ B o s c . ）F r. の子実体などで，できものに外用する．宋代の『図経本草』の「杉菌」は心痛を治すキノコで，おそらくモエギタケ科のスギタケ P h o l i o t a s q u a r r o s a （ F r. ）

Q u é l . の子実体であるという説もあるが確かではない．『証類本草』に

は「蟬花（現在では金蟬花）」と称する変わった真菌類が登場する．これはセミ科の幼虫に寄生したバッカクキン科のセミタケ C o r d y c e p s s o b o l i f e r a （ H i l l . ） B e r k . e t B r o o m e の菌核（寄生虫体）および子座で，小児の驚癇，夜啼きなどに用いている．元代の『日用本草』には

「香蕈」や「天花蕈」などが収載されている．香蕈はキシメジ科のシイタケ L e n t i n u s e d o d e s （ B e r k . ） S i n g . で，食用キノコとして最もよく使われるものであるが，薬としては胃腸障害，貧血症などに用いられている．天花蕈はキシメジ科のヒラタケ P l e u r o t u s o s t r e a t u s （ J a c q .

e x F r. ） Q u é l . で，これも食用キノコである．明代の『本草綱目』に

は食用キノコとして名高いキシメジ科のマツタケ Tr i c h o l o m a m a t s u t a k e （ S . I t o e t I m a i ） S i n g . も，「松蕈」の名で収載され，「小便が濁って禁ぜざるを治す」とその効を誌している．清代の『本草從新』には，「冬虫夏草」が収載されている．

^{3 , 4}^）

近年ではキノコ類が制がん剤として注目されている．現在，抗悪性

腫瘍剤としてクレスチン

^®

，レンチナン

^®

，シゾフィラン（ソニフィラ

ン

^®

）の 3 剤が臨床において使用されている．これらはそれぞれカワ

(18)

ラタケ C o r i o l u s v e r s i c o l o r （ L , : F r. ） Q u é l . の培養菌糸体，シイタケ L e n t i n u l a e d o d e s （ B e r k . ） S i n g . ，スエヒロタケ S c h i z o p h y l l u m c o m m u n e F r. : F r. から得られる多糖またはタンパク質 ‐ 多糖複合体との混合物であり，いずれも他の化学療法や放射線療法と組み合わせて使われている．

キノコが産生する二次代謝産物には他の菌類にはみられない特徴的な構造をもつものがある．担子菌は高等植物に似てシキミ酸経路が発達しており，しばしばテルフェニルキノンが得られる．その他，メバロン酸経路由来のテルペン類も多く，中でも酢酸－マロン酸経路のポリアセチレンは担子菌に特有である．アミノ酸由来の呈味性の強い殺蝿物質イボテン酸，幻覚性のあるインドール化合物，致死性毒のヘテロ環状ペプチドなどもキノコ由来の独特な二次代謝産物である．

⁴^）

しかし，キノコの二次代謝産物や，菌類の分類について，系統だった研究はまだまだ充分であるとは言い難い．自然環境の保護が叫ばれる昨今において，自然界の秩序を正しく理解するために菌類研究の展開は必要不可欠である．

F i g ． 1 ． C l a s s i f i c a t i o n o f M y c o t a

¹^）

(19)

第二章細胞増殖

細胞の成長とは，細胞の質量の大部分を占めるタンパク質や膜，細胞小器官やその他の構成要素を合成することにより細胞の大きさを増加させる過程である．細胞はある程度の大きさになると，成長を止めるか分裂をする．分裂から次の分裂までを細胞周期（ c e l l c y c l e ）と呼び，細胞分裂は，核が分裂する有糸分裂（ m i t o s i s ）と細胞質が二つに分かれる細胞質分裂（ c y t o k i n e s i s ）に分けられる．多細胞生物においては，細胞の成長と分裂がどのようにして連携しているのか，いまだ未知な部分が多い．細胞，組織そして生体の大きさを制御する分子機構は，生物学の中でも興味深く神秘的な課題の一つである．

第一節 C D K とサイクリン

細胞周期の制御機構を構成する中心的な因子は，サイクリン依存性キナーゼ（ c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e ； C D K ）である．細胞周期の進行に従い，このキナーゼ活性は急激に変化し，それに従って細胞周期の進行を制御するタンパク質のリン酸化状態とそれによる活性化状態に変化がもたらされる． C D K タンパク質の細胞内濃度は細胞周期を通じて一定であるので， C D K の活性の変動は，原則的にサイクリン（ c y c l i n ）として知られる制御サブユニットの量の変動に依存している．

C D K （ c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e ）

C D K はセリン／スレオニンキナーゼの一ファミリーで，定義上すべ

ての C D K はその酵素活性に調節サブユニットであるサイクリンの結

(20)

合を必要とする．C D K の機能は，細胞周期の各過程において細胞内の数多くのタンパク質の特異的なアミノ酸配列上のセリンもしくはスレオニン残基をリン酸化することである．

⁵^）

1 9 8 7 年に N u r s e らによりヒトの C D K 1 が， 1 9 9 1 年に Ts a i ・H a r l o w ・ M e y e r s o n ，あるいは E l l e d g e らにより C D K 2 がそれぞれ同定されてから，これまでに C D K 11 までが同定されている（ F i g ． 2 ）．このうちの

C D K 1 ， 2 ， 4 および 6 のわずか 4 種が細胞周期の制御に直接関わって

いる．細胞周期の各過程は， C D K 1 と 2 という 2 つの C D K によって制御されており，主に M 期と S 期にそれぞれ作用する．さらに，細胞外因子に応答して細胞周期への進行を調節する 2 つの重要な C D K 4 と 6 が存在する．その他に P C TA I R E や P F TA I R E ，C C R K ， C H E D ， C R K 7 といった高度に関連する分子も C D K ファミリーの一員と称されるが，それぞれの活性化調節サブユニットはいまだ同定されていない．

^{6 , 7}^）

CDK1 297 aa

CDK2 298 aa

CDK3 305 aa

CDK5 292 aa

PCTAIRE3 502 aa PCTAIRE1 496 aa PCTAIRE2 523 aa PFTAIRE1 451 aa PFTAIRE2 435 aa

CDK4 303 aa

CDK6 326 aa

CDK10 360 aa

PITSLRE 795 aa

CCRK 346 aa

CDK9 372 aa

CHED 1512 aa

CRK7 1490 aa

CDK7 346 aa

CDK8 464 aa

CDK11 502 aa

Ser/Thr protein kinase Nuclear localization Coiled-coil domains

F i g ． 2 ． T h e M a m m a l i a n C D K F a m i l y

⁷^）

(21)

サイクリン

サイクリンは C D K ファミリーに属する分子と結合し活性化させるという特徴を示す．ほとんどのサイクリンは細胞周期を通じてその細胞内濃度を劇的に変化させ，それによって C D K 活性が周期的に変化し，細胞周期制御の中心的役割を担っている．サイクリンの細胞内濃度は主にサイクリン遺伝子発現とサイクリンタンパク質の分解によって調節されている．

現在までに，「 c y c l i n - b o x 」と呼ばれる 1 5 0 のアミノ酸残基からなる保存されたストレッチをもつ 2 9 のサイクリン関連分子が同定されている（ F i g ． 3 ）．このドメインは 5 つのへリックス領域からなり，これによって C D K などのパートナータンパク質と結合する．

細胞周期に関わるサイクリンは，主に細胞周期における発現の時期とその機能によって G 1 期サイクリン（サイクリン D ）， G 1 ／ S 期サイクリン（サイクリン E ）， S 期サイクリン（サイクリン A ）および M 期サイクリン（サイクリン B ）の 4 つのクラスに分類される．

サイクリン A には，別々の遺伝子にコードされたサイクリン A 1 と

サイクリン A 2 が存在する．サイクリン A 1 は生殖細胞および初期胚の

細胞であり，サイクリン A 2 は発生初期および成体で発現するが，細

胞周期における機能に関して 2 つのサブタイプ間でほとんど差はない．

サイクリン B にはサイクリン B 1 とサイクリン B 2 ，サイクリン B 3 が

存在するものの，サイクリン B 3 は分裂に関して明確な機能をもって

いない．細胞周期において，サイクリン B 1 の方がより重要だと考え

られ，よく研究されている．

⁵^）

(22)

Cyclin F 786 aa Cyclin O 316 aa Cyclin A1 465 aa Cyclin A2 432 aa Cyclin B3 1395 aa Cyclin B1 433 aa Cyclin B2 398 aa Cyclin D3 292 aa Cyclin D1 295 aa Cyclin D2 289 aa Cyclin E1 410 aa Cyclin E2 404 aa Cyclin J 372 aa Cyclin C 302 aa Cyclin H 323 aa Cyclin K 355 aa Cyclin T1 726 aa Cyclin T2 730 aa Cyclin L1 526 aa Cyclin L2 424 aa Cyclin M3 707 aa Cyclin M1 586 aa Cyclin M2 854 aa Cyclin M4 727 aa Cables 1 633 aa Cables 2 478 aa Cyclin I 377 aa Cyclin G1 295 aa Cyclin G2 344 aa

N-terminal cyclin box C-terminal cyclin box F-box Nuclear localization signal Proline-rich

F i g ． 3 ． M a m m a l i a n P r o t e i n s w i t h A C y c l i n - b o x D o m a i n

⁷^）

(23)

第二節細胞周期

「細胞（ c e l l u l a ）」という名称が 1 7 世紀半ばに付与されて以来，約 2 0 0 年を経て「細胞は細胞に由来する（ O m n i s c e l l u l a e c e l l u l a ）」という概念が提唱された．さらに約 1 0 0 年を要してはじめて，この「細胞に由来する」過程が G 1 期（ G a p 1 p h a s e ）－ S 期（ S y n t h e s i s p h a s e ）

－ G 2 期（ G a p 2 p h a s e ）－ M 期（ M i t o t i c p h a s e ）という 4 つの位相として定義された．しかし細胞周期という用語がいつから使用されるようになったのかは定かではない．

細胞周期のうち，有糸分裂の時期を M 期といい， M 期と M 期の間の長い期間を間期（ i n t e r p h a s e ）という．間期はさらに G 1 ， S ， G 2 期に分けられる． S 期は核の D N A の複製がおこる時期であり， M 期から S 期の始まりまでの期間が G 1 期，つまり最初のギャップ期である． S 期を完了すると，細胞は二番目のギャップ期である G 2 期に入る．この時期に細胞分裂の最終段階に到達し，タンパク質の合成が増加する（ F i g ． 4 ）．

⁶^）

cyclin E

CDK2 cyclin A CDK2

cyclin A CDK1

cyclin B CDK1

S

G

₂

G

₁

G

₀

M

cyclin D CDK4/6

F i g ． 4 ． O v e r v i e w o f C e l l C y c l e

(24)

多細胞生物では新たな細胞は必要とされるときにのみ作り出されるよう，組織特異的な遺伝子のプログラミングと，他の細胞が分泌する分裂促進因子（ m i t o g e n ；マイトジェン）と呼ばれる細胞外タンパク質から受け取るシグナルによって，その増殖が制御されている．培養細胞から分裂促進因子を除去したときなどには，細胞は細胞周期から完全に脱出して G 0 期と呼ばれる特別な休止状態に入る．

細胞外からのシグナルである分裂促進因子によって，細胞周期の初期の現象を引き起こすサイクリン D － C D K 4 ／ 6 の活性化が起こる．分裂促進因子は， R a s － M A P キナーゼ経路の活性化を介してサイクリン D 遺伝子の発現を誘導する．休止期の細胞にわずかに残るサイクリン

D － C D K 4 ／ 6 は，グリコーゲンシンターゼキナーゼ 3  （ g l y c o g e n

s y n t h a s e k i n a s e 3；G S K 3  ）によって阻害的リン酸化を受けているが，分裂促進因子の刺激はサイクリン D の脱リン酸化を引き起こす．さらに，活性をもつサイクリン D － C D K 4 ／ 6 複合体の形成には補助因子が必要であり， p 2 7 や p 2 1 などの C i p ／ K i p ファミリータンパク質が両サブユニットと相互作用することでこれらの結合が強くなる．安定化したサイクリン D － C D K 4 ／ 6 複合体は標的である R B タンパク質が存在する核に蓄積する．

R B タンパク質には p R B ，p 1 0 7 ，p 1 3 0 の三つの関連タンパク質が存

在し，それぞれが E 2 F と呼ばれる特定のタンパク質複合体ファミリー

と結合する． E 2 F 複合体は， E 2 F ファミリータンパク質のサブユニッ

トと， D P ファミリータンパク質のサブユニット一つずつから成るヘ

テロ二量体であり， G 1 ／ S 期の標的遺伝子のプロモーターに存在する

特定の D N A 配列に結合する． E 2 F タンパク質は，その機能によって

活性化 E 2 F と抑制性 E 2 F の 2 種類に分けられる．休止期の細胞では，

(25)

活性化 E 2 F はリン酸化された R B タンパク質， p R B によって抑制されており，一方， G 1 ／ S 期遺伝子のプロモーターは抑制性 E 2 F と p 1 0 7 もしくは p 1 3 0 との複合体によって抑制されている．R B ファミリータンパク質は，活性化したサイクリン D － C D K 4 ／ 6 複合体依存的にリン酸化されて E 2 F から解離する． D N A 上の抑制性 E 2 F は， p R B と結合していない活性化 E 2 F に置き換わり， G 1 ／ S 期遺伝子の発現が活性化され，これによって細胞周期のスタートが切られる（ F i g ． 5 ）．

⁵^）

S

G ₂ G ₁

G ₀ M

DP E2F

p107

発現増殖刺激 DP

E2F

P

脱リン酸化 cyclin D

CDK4/6 p27

DP E2F

pRB

P P

DP E2F

P P

p107

E2F DP

抑制性

活性化

p27

F i g ． 5 ． G 1 P h a s e o f C e l l C y c l e

G 1 ／ S 期遺伝子産物の中で決定的に重要なのは，G 1 ／ S 期サイクリンのサイクリン E と S 期サイクリンのサイクリン A の二つである．サイクリン E は C D K 2 と複合体を形成するが，細胞周期に入る際の

C D K 2 の活性は p 2 7 によって部分的に抑制されている．サイクリン D

－ C D K 4 ／ 6 複合体の量が増加することで p 2 7 の流通量が減少し，さ

らに p 2 7 がタンパク質分解を受け不活性化されることでサイクリン E

－ C D K 2 の活性化が促進される．G 1 期後期になると，ホスファターゼ

(26)

C d c 2 5 A による C D K 2 の阻害的リン酸化の除去が起こり，サイクリン

E － C D K 2 複合体の活性はさらに上昇する．サイクリン D － C D K 4 ／ 6

は部分的な R B タンパク質のリン酸化と E 2 F の活性化しか行わない．

E 2 F の完全な活性化は，サイクリン E － C D K 2 複合体の活性が G 1 期

後期に上昇し， R B タンパク質が完全にリン酸化されたときに起こる

（正のフィードバック）．そして S 期初期になるとサイクリン E －

C D K 2 がサイクリン E の T h r 3 8 0 をリン酸化するなどして，ユビキチ

ン化を経てサイクリン E が分解される．

サイクリン A は C D K 2 と複合体を形成するが，サイクリン A － C D K 2 の活性化は D N A の複製を開始するために必要である．サイクリン E

－ C D K 2 と同様に，サイクリン A － C D K 2 複合体は p 2 7 によって部分

的に抑制されるので，完全な活性化には p 2 7 の除去が必要である．ま

た，サイクリン A － C D K 2 の活性化は C d c 2 5 A による脱リン酸化にも

依存している．サイクリン A － C D K 2 は活性化されると，複製開始点

の p r e - r e p l i c a t i o n c o m p l e x をリン酸化し， D N A 合成が開始される（ F i g ．

6 ）．

⁵^）

(27)

S

G ₂ G ₁

G ₀ M

DP E2F

p107 E2F DP

DP E2F

pRB

P P

E2F DP

P P

p107

DP E2F

抑制性

活性化 cyclin E

CDK2 p27

P p27

cyclin E CDK2 Cdc25A

CDK2 cyclin E

CDK2 ^P 自己

リン酸化 cyclin ACDK2 p27

P

p27 Cdc25A

Cdc6 Cdt1 Dbf4Cdc7

ORC

ORC DNApol

DNA合成 Cdc6

+P

F i g ． 6 ． G 1 a n d S P h a s e s o f C e l l C y c l e

サイクリン A はまた，サイクリン B とともに M 期開始における主要かつ必須な制御因子でもある．サイクリン A は M 期前期にはそのパートナーを C D K 1 に変え，活性化した状態で核内に存在する．染色体の凝縮などといった M 期最初の核内での事象は，おそらくサイクリ

ン A － C D K 1 複合体によって開始される．

サイクリン B は G 2 期に発現量が上昇し，細胞質に存在する．サイクリン B － C D K 1 複合体の活性化は M 期初期の初めに細胞質で始まり，とりわけ中心体で顕著である． M 期初期に蓄積した不活性化状態のサイクリン B － C D K 1 は， C d c 2 5 ファミリーホスファターゼによって

C D K 1 の阻害的リン酸化が除かれ活性化される．サイクリン A － C D K 1

は C d c 2 5 などをリン酸化し，サイクリン B － C D K 1 を活性化するフィ

ードバックを手助けする． M 期前期の後半には，ほとんどのサイクリ

(28)

ン B － C D K 1 は突然核内に移行し，核膜崩壊を誘導する．その後間もなく核膜は消失し，サイクリン B － C D K 1 は細胞全体に分布される．一部は細胞質に残り，中心体の分離やゴルジ体の再構築など M 期に起こる他の事象を推し進める．さらに，染色体凝縮の完了も誘導する

（ F i g ． 7 ）．

⁵^）

S

G ₂ G ₁

G ₀ M

cyclin B

P P P

P Cdc25 核膜崩壊

CDK1

中心体の分離ゴルジ体再構築

F i g ． 7 ． G 2 a n d M P h a s e s o f C e l l C y c l e

(29)

第三章血管新生とがん

血管は，全身に分布し血液の灌流を可能にする生体にとって基本的な組織の一つである．血管は，内腔を覆う一層の血管内皮細胞と血管基底膜，その周囲を取り囲む壁細胞（動静脈においては平滑筋細胞，毛細血管においては周皮細胞（ペリサイト））により構成されている

（ F i g ． 8 ）．

生体内で血管が形成される現象は，脈管形成（ v a s c u l o g e n e s i s ）と血管新生（ a n g i o g e n e s i s ）の二つに大別される．脈管形成は，胎生期において胎児外の卵黄嚢に血島と呼ばれる細胞集団が形成されることに始まる．血島の内側の細胞は血球に分化し，外側付近の細胞は内皮細胞に分化して原始血管叢を形成する（ F i g . 9 ）．一方，血管新生とは既存の血管から新たな血管ネットワークが形成される現象のことである．この血管新生の過程は，脈管形成の終了後，臓器中に血管が張り巡らされる際に観察されるが，成熟固体の生理的，病的血管新生でも同様の機序が観察される．

⁸^）

血管新生の生物学的な基礎研究は，固形腫瘍の発育が腫瘍血管新生に依存しているとの仮説がされ開始された．近年，血管の分子生物学のめざましい発展とともに，血管新生はがんの増殖と遠隔転移に深く関与していること，また，血管新生には多くの因子が関与することが明らかになった．

^{8 , 9}^）

血管新生は， ① ペリサイトの離解， ② 細胞外マトリックスの消化，

③ 内皮細胞の遊走と増殖， ④ 内皮細胞による管腔形成， ⑤ ペリサイト

による血管の成熟化のプロセスからなる．通常では，ペリサイトから

分泌される A n g - 1 （ a n g i o p o i e t i n - 1 ）が内皮細胞上の受容体 T I E 2

(30)

（ t y r o s i n e k i n a s e w i t h I g a n d E G F h o m o l o g y d o m a i n ）に結合し，内皮細胞から P D G F （ p l a t e l e t - d e r i v e d g r o w t h f a c t o r ；血小板由来増殖因子）が産生される．この P D G F の刺激により，ペリサイトが内皮細胞を取り囲むように集積するとともに , 細胞外マトリックスを介して血管構造を安定化している．しかし，低酸素や低栄養状態になると，内皮細胞や周囲の間葉系細胞から A n g - 1 のアンタゴニストの A n g - 2

（ a n g i o p i e t i n - 2 ）の産生が高まる． A n g - 2 が T I E 2 と結合し，一過性

に T I E 2 を不活性化させて下流のシグナル伝達を競合的に阻害すると ,

ペリサイトは内皮細胞との接着を失い，離解する．ペリサイトが離解した部分の内皮細胞は，血管新生促進因子の刺激を受けやすくなる．血管新生促進因子の中でも特に， V E G F （ v a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h

f a c t o r ；血管内皮増殖因子）が重要である．内皮細胞同士は V E - カド

ヘリンという細胞間接着因子により接着しているが， V E G F の刺激に

より V E - カドヘリンがリン酸化されることで内皮細胞同士の接着が弱

まる．さらに， V E G F の刺激を受けた内皮細胞は種々のプロテアーゼを産生し，基底膜や周囲の細胞外マトリックスを消化する．内皮細胞は接着因子であるインテグリンを介して細胞外マトリックスに接着し，接着方向に向かって遊走する．基底膜を破り，間質へと浸潤した内皮細胞は，遊走と増殖によってその細胞数を増加していく．この際，隣接した内皮細胞同士は V E - カドヘリンにより接着する．このようにして形成された未熟な血管は，ペリサイトが接着することで成熟化する．

A n g - 1 が T I E 2 に結合し，内皮細胞が刺激されて P D G F の産生を促進

することで，ペリサイトは内皮細胞に続いて遊走，増殖し，新生血管

の周囲を取り囲む．ペリサイトから産生された T G F - （ t r a n s f o r m i n g

g r o w t h f a c t o r  ）により内皮細胞の遊走と増殖は停止し，新たな基底

(31)

膜が形成され，成熟した血管が構築される（ F i g ． 1 0 - a ）．

腫瘍血管新生は正常な血管新生と異なる部分がある．がん細胞は，はじめは自身により 1 - 2 m m

³

まで成長するが，それ以上の大きさになるとがん細胞の周囲では低酸素状態となり，二酸化炭素，一酸化窒素，

C O X - 2 などの上昇が起こる．このうち特に低酸素状態を引き金として，

V E G F をはじめとする様々な血管新生促進因子が分泌され，がん細胞

へ向かって血管の新生が誘導される．腫瘍血管新生では， A n g - 2 の分泌が優勢であるためペリサイトが欠如あるいは減少していると考えられており，がん細胞から分泌される持続的な V E G F の刺激により，未成熟な新生血管が構築されるプロセスを繰り返す．その中で，脆弱，不規則，無秩序，透過性亢進などの特徴をもつ腫瘍血管が形成されていく．こうして新たな血管を形成したがん細胞は，栄養素や酸素を取り込み，二酸化炭素や乳酸などの老廃物を排泄して，加速度的に成長するとともに，新たな組織へと転移する（ F i g ． 4 - b ）．

^{8 )}

F i g ． 8 ． A n a t o m y o f B l o o d Ve s s e l

^{6 )}

F i g ． 9 ． P r o c e s s o f Va s c u l o g e n e s i s

^{4 )}

(32)

a ) P h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n b ) P a t h o l o g i c a l c o n d i t i o n

F i g ． 1 0 ． P r o c e s s o f P h y s i o l o g i c a l a n d P a t h o l o g i c a l A n g i o g e n e s i s

(33)

第四章 V E G F と V E G F 受容体

血管新生は一般に，促進因子と抑制因子のバランスによって制御される．実際に，様々な腫瘍において血管新生促進因子の発現亢進と抑制因子の発現低下が確認されている．促進因子の一つである V E G F はその受容体， V E G F R （ V E G F r e c e p t o r ； V E G F 受容体）を介して，血管新生において重要な役割を担っている．

^{1 0}^）

第一節 V E G F

V E G F は，血管内皮細胞特異的な増殖促進作用と血管透過性亢進作

用をもつ因子として単離された分子量 2 3 k D のサブユニットがジスルフィド結合によりホモダイマーを形成した糖タンパク質である． V E G F ファミリーとして V E G F - A ， P I G F （ p l a c e n t a g r o w t h f a c t o r ；胎盤由来増殖因子）， V E G F - B ， V E G F - C ， V E G F - D ，パラポックスウイルス由来の V E G F - E ，ヘビ毒由来の V E G F - F が知られている．アミノ酸配列の相同性は 3 0 - 5 0 ％程度であるが， 8 つのシステイン残基が保存されているという特徴をもつ．ヒトには 2 3 対の染色体があり，

ヒト V E G F 遺伝子は 7 番染色体上に存在する．遺伝子 D N A は 8 つの

エクソンからなり， D N A を鋳型として R N A が合成されるが，転写の際のスプライシングの違いにより大きさの異なる m R N A が産生され

る．

^{7 , 8}^）

V E G F - A は単に V E G F とも呼ばれ，血管新生に最も関わりが

深いといわれる． V E G F - A はスプライシングの違いにより，ヒトゲノ

ムにおいて 9 つのアイソフォームが確認されており，中でも

V E G F - A

1 6 5

は最も豊富に存在する（ F i g ． 11 ）．

^{1 1 , 1 2}^）

(34)

V E G F はほとんどの臓器をはじめ，上皮系細胞，繊維芽細胞，平滑筋細胞，心筋細胞など様々な細胞や，多くの固形腫瘍とそれに由来する細胞株において発現している．また，低酸素状態に反応して転写が誘導されるという大きな特徴があり， V E G F の転写開始点の上流には H I F - 1 （ h y p o x i a - i n d u c i b l e f a c t o r - 1 ；低酸素誘導因子）が結合する配列が存在する．

⁸^）

F i g ． 11 ． C o m p a r i s o n o f S t r u c t u r e s o f t h e V E G F F a m i l y

1 1 , 1 2 )

(35)

第二節 V E G F 受容体

V E G F R には， V E G F R - 1 （ F l t - 1 ）， V E G F R - 2 （ K D R / F l k - 1 ）， V E G F R - 3

（ F l t - 4 ）の 3 種が存在する．これらは，細胞外ドメイン，膜貫通ドメ

イン，チロシンキナーゼドメインをもつ典型的な受容体型チロシンキナーゼである． V E G F R - 1 および 2 は，細胞外ドメイン内に 7 つの I g 様構造をもち，キナーゼドメイン内には約 7 0 のアミノ酸のキナーゼ挿入領域をもつ． V E G F R - 3 も類似の構造をもつが， 5 番目の I g 様ドメインが開裂し，ジスルフィド結合で架橋されている．

^{9 , 1 1}^）

V E G F R はそのリガンドである V E G F および P I G F が結合すること

で活性化するが，V E G F - A は V E G F R - 1 および 2 と結合する．V E G F - C および D は V E G F R - 2 および 3 と結合するが，P I G F ，V E G F - B および V E G F - E はそれぞれ V E G F R - 1 ， 2 に特異的に結合する（ F i g ． 1 2 ）．

S SS S

VEGFR-1

(Flt-1) VEGFR-1

(Flt-1) VEGFR-2 (KDR/Flk-1)

VEGFR-2

(KDR/Flk-1) VEGFR-3 (Flt-4) VEGF-A

VEGF-B PIGF

VEGF-A VEGF-C VEGF-D VEGF-E VEGF-A

VEGF-B PIGF

VEGF-A VEGF-C VEGF-D VEGF-E

VEGF-C VEGF-D

Monocytes

Macropharges Vascular endothelium Lymphatic endothelium

F i g ． 1 2 ． I n t e r a c t i o n s o f V E G F F a m i l y w i t h T h e i r R e c e p t o r s

^{1 3 )}

(36)

このうち，血管新生に最も関わりが深いのは血管内皮細胞に発現している V E G F R - 2 であり， 2 番目と 3 番目の I g 様ドメインを介して

V E G F - A と結合し，受容体の二量体化が起こる．受容体が相互にリン

酸化しあえる距離まで近づき，キナーゼドメインが活性化されると，受容体の自己リン酸化が起こり細胞内へとシグナルが伝達される． V E G F R - 2 の主な自己リン酸化部位には 9 5 1 ，1 0 5 4 ，1 0 5 9 ，11 7 5 ，1 2 1 4 番目のチロシン残基（ Y 9 5 1 ， Y 1 0 5 4 ， Y 1 0 5 9 ， Y 11 7 5 ， Y 1 2 1 4 ）がある．リン酸化された Y 11 7 5（ p Y 11 7 5 ）は P L C （ p h o s p h o l i p a s e C -  ；ホスホリパーゼ C   ）経路により血管内皮細胞増殖のシグナル伝達を行う． P L C  はその S H 2 ドメインを介して Y 11 7 5 と結合し， P I P 2

（ p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l 4 , 5 - b i s p h o s p h a t e；ホスファチジルイノシトール 4 , 5 ‐ 二リン酸）を D A G （ d i a c y l g l y c e r o l ；ジアシルグリセロール）と I P 3 （ i n o s i t o l 1 , 4 , 5 - t r i s p h o s p h a t e ；イノシトール 1 , 4 , 5 ‐ 三リン酸）に加水分解する． D A G は P K C （ p h o s p h o k i n a s e C ；プロテインキナーゼ C ）を， P K C は R a s を介することなく R a f を活性化し， M A P K （ m i t o g e n - a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e ；分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ）カスケードである R a f - M E K - E R K 経路を介してシグナルを核内へと伝える．活性化された E R K は核内へ移行し，標的である転写因子 E l k 1 を活性化して遺伝子転写を行い，細胞増殖のシグナルを伝達する． p Y 11 7 5 はさらに，アダプター分子の S h b にも結合する． S h b を介して P I 3 K（ p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l - 3 k i n a s e；ホスファチジルイノシトール 3 －キナーゼ）がリン酸化されると，細胞の遊走を調節する接着斑の会合が誘導される． p Y 1 2 1 4 は G r b 2 の S H 2 ドメインを介して G r b 2 に結合する． Y 1 2 1 4 のリン酸化は C d c 4 2 や

p 3 8 M A P K の活性化に必要であり，アクチンの再構成を引き起こす．

(37)

p Y 9 5 1 は T S A d （ T- c e l l - s p e c i f i c a d a p t o r p r o t e i n ）と結合する． Y 9 5 1 を介した V E G F R - 2 と T S A d の結合もまた，アクチンの再構成や細胞の遊走に必要不可欠である（ F i g ． 1 3 ）．

PIP₂ DAG

1175 PLC-

P

+ IP₃

Ca²⁺

release

PKC

Raf

MEK

ERK Gene transcription Elk1

Cell proliferation

PIP₂

1175 TSAd 951

P

PIP₃ PI3K

Src

PShb FAK

Paxillin Rac

Rho

Focal adhesion turn over

Actin reorganization

Cell migration 1214

Grb2P

Cdc42 MAPKp38

FAK

Actin reorganization VEGFR-2

VEGF-A

VEGFR-2 VEGF-A

F i g ． 1 3 ． V E G F - A / V E G F R - 2 S i g n a l i n g i n Va s c u l a r E n d o t h e l i a l C e l l P r o l i f e r a t i o n a n d M i g r a t i o n

^{1 3 )}

V E G F R は V E - カドヘリン，  - カテニン， P I 3 K と複合体を形成する

ことで，内皮細胞の生存にも関与する． P I 3 K の活性化により P I P 3

（ p h o s p h a t i d y l - i n o s i t o l 3 , 4 , 5 - t r i s p h o s p h a t e ；ホスファチジルイノ

シトール 3 , 4 , 5 - 三リン酸）が増加すると A k t が活性化される． A k t の

活性化は B A D やカスパーゼ 9 に作用し，アポトーシス促進経路を阻

害することで細胞の生存を引き起こす（ F i g ． 1 4 ）．

^{1 3}^）

(38)

PIP₂ VE-cadherin PIP₃

PI3K

-catenin

Akt

Caspase 9

Cell survival BAD

VEGFR-2 VEGF-A

F i g ． 1 4 ． V E G F - A / V E G F R - 2 S i g n a l i n g i n Va s c u l a r E n d o t h e l i a l C e l l

S u r v i v a l

^{1 3}^）

ク ロ コ ブ タ ケ か ら の 血 管 新 生 阻 害 活 性 物 質 の 探 索