Research of ceramicines from Chisocheton
ceramicus on anti‑lipid droplets accumulation activity
学位名 博士（薬学）
学位授与機関 星薬科大学
学位授与年度 2012年度
学位授与番号 32676甲第159号
URL http://id.nii.ac.jp/1240/00000288/
氏名（本籍）WONG， CHIN PIOW （マレーシア）
学位の種類博士（薬学）
学位記番号 甲第159号
学位授与年月日 平成25年3．月15日
学位授与の要件 学位規則第4条第1項該当者
学位論文の題名 Research of ceramicines廿omαIZ500掘o刀c醐励ω50n anti−lipid
droplets accumulation activity
論文審査委員 主査 教授 森田博史
副査 教授 小林恒雄
副査 教授 細江智夫
論文内容の要旨
The invaluable terrestrial plants as a source of drug candidates initiate us to explore deeper in the research on plant natural products． Countless species from the Meliaceae family have generated much interest due to their various significant biological activities． Activities such as insecticidal， insect anti−feedant， anti−bacterial， anti−fungal， anti−malarial， anti−cancer，
and anti−viral have so far been reported．
The biological activities shown by plant natural products made it an interesting source R）rvarious medical conditions including obesity． The cause of obesity morbidity is divided into two attributes， increase of lipid mass and increase of lipid cells numbers． Both of these attributes could be decreased by reducing lipid−droplets accumulation（LDA）and adipocyte differentiation．
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Figure 1．Stnlctures of previously reported ceramicines A−D and eight new limonoids，ceramicines E−L（1−8）
The objective of present study is to identify compo皿ds f＋omα〜50c乃θτoηcεrαm↓cμ∫
Miq（C．cεrα〃πcμ5）with anti−LDA activity on mouse pre−adipocyte cell line， MC3T3−
G2／PA6 cells． Investigation showed that previously isolated ceramicine B possessed anti一
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Concentration
of eight new limonoids，
Figure 2． Anti−LDA activity of C． cerαmjcμ∫bark methanol extract， hexane ceramicines E−L （1−8）and fraction， and ceramicine B on mouse pre−adipocyte ce田ine， MC3T3−
． ． G2／PA6 cells were compared to berberine used a contro1（bar）． Anti−LDA thelr relatlve structures were actMty was measured using nile red lipid droplets刊uorescent staining
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2D NMR data．
Structure Elucidation of Eight New Limonoids， Ceramicines E・L（1−8）from C．
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Ceramicine E（1）was isolated as a colorless amorphous solid and had molecular fo㎜ula， C27H3207 as dete㎜ined by high resolution−electrospray ionization−time of night−
mass spectra（HR−ESI−TOF−MS）． The planar structure of l was elucidated with I D and 2D
NMR data （Figure 3）． Thus，1 was established as a new limonoid with a
cyclopenta［α］phenanthren ring system with aβ一furyl ring at C−17，an acetate at C−6， and two epoxide rings．
The relative stereochemistry of l was elucidated by nuclear Overhauser effect spectroscopy（NOESY）correlations as shown in computer−generated 3D rendering（Figure 3）．
NOESY correlations suggested stereochemistry of two epoxides as shown in Figure 3． The 3J proton coupling constants（3JH−5／H−6＝ll．7 Hz and 3JH．6／H−7＝2．6 Hz）as well as NOESY correlations indicated that H−6，H−7，and H−17 adopted aβ一configurations， and H−5，H−9，and C−18adopted anα一configurations as shown in Figure 3． The planar structure and relative con丘gurations of 2−8 shown in Figure l were also dete㎜ined by lD and 2D NMR data．
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Figure 3．Selected 2D−NMR correlations for ceramicine E（1）
Absolute Configuration of Ceramicine B
The unknown absolute configuration of ceramicine B， a m司or limonoid from C．
cεro7ηjcμ5， was also studied． The CD spectrum ofρ一Br−benzoyl derivative of ceramicine B indicated that the mutual relationship of dipole moment of the benzoate andα，β一unsaturated ketone chromophores was oriented in a counter clockwise manner， indicating absolute configuration at C−7 as S con聴ured． Additional X−ray crystallography results confi㎜ed the total structure of ceramicine B including its absolute structure［Flack parameter，口二一〇．0（2）1．
TherefOre，the absolute configuration of ceramicine B was assigned as（4R，∬，6R，7S，8R，95，
10」R，135，and l7R）．
Ceramicines with Anti・Lipid Droplets Accumulation Activity
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found that， substitution pattem and stereochemistry of C−4， C−5，C−6， and C−28 appear to be critical for elicitation of anti−LDA activity． However， further studies are required to dete㎜ine the impo仕ance of the tetrahydro血ran ring Ib㎜between ring A and B through C−4，
C−5，C−6， and C−28． Summary on the preliminary structure activity relationship of ceramicines was shown in Figure 4．
Mechanism Studies of Ceramicine B on Anti・Lipids Droplets Accumulation Activity Evaluation by nile red lipid droplets fluorescent staining resulted that ceramicine B is most potent compound in inhibiting LDA activity in MC3T3−G2／PA6 cells． Subsequent RT−
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Additional western blot analysis demonstrated Day 3 6
Figure 5． A）RT−PCR analysis on MC3T3−G2／PA6 that PPARγprotein level was indeed inhibited by cells treated with ceramicine B． B）PPARY protein expression was investigated with ant▲−PPARγ
ceramicine B in MC3T3−G2／PA6 cells（Figure monoclonal antibody．
5B）．
Effect of ceramicine B was then examined on Forkhead Box O l（Foxol），arepressor of PPARγtranscription． Western blot analysis showed that presence of ceramicine B was found to inhibit phosphorylation of Foxol when compared to unphosphorylated Foxol（Figure 6）．
This suggested that ceramicine B
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viα inhibition of Foxol phosphorylation．
Inducer− 一 十 十 一 一 十 十 Considering that Akt acts on ceramicine B − 十 ＿ 十 一 十 ＿ 十
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Figure 6． Phosphorylation of Foxo l was investigated with antL signaling pathway implies， further studies Foxo l and antl−pFoxo l Thr24 monoclonal antibody．
on ceramicine B effect on Akt signaling is necessa「y・
Present studies have yielded eight new limonoids， ceramicines E−L（1−8）． Further investigation led to identification of previously isolated ceramicine B as a potent compound with anti−LDA activity． Studies also suggested that anti−LDA activity of ceramicine B was partly due to inhibition of Foxo l phosphorylation．
論文審査の結果の要旨
肥満は、糖尿病、高血圧、高脂血症などと関係して、心筋梗塞や脳梗塞など の動脈硬化性疾患の危険性を高めるほか、一部のがんの発症率を高める。肥満 における脂肪組織の増大は脂肪細胞の肥大化と脂肪細胞の新生によりもたらさ れる。重度の肥満症患者では脂肪細胞の肥大化とともに小型の脂肪細胞が出現 することも観察されており、肥満における脂肪細胞分化の重要性を示唆すると 考えられる。したがって、肥満を抑えるような生物活性を持つ新しい化合物の 発見は、これらの疾患の治療に貢献すると考えられる。
本論文では、脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化過程において、脂肪滴の蓄 積を抑制する植物由来の新しい機能性天然分子の探索研究を行った。熱帯未利 用植物資源から調製した抽出エキスライブラリーをスクリーニングした結果、
マレーシアに自生するセンダン科α砧o功θ乙o刀oθmm加sの樹皮より新しいリ モノド、ceramicine類を発見した。本論文によって得られた結果は、以下のよ
うである。
1）α施0訪θZO刀6θmm1ヒμSの活性成分の研究
α∫soo力巴o刀cθτ2m∫6〃sの樹皮のメタノールエキスを液液分配し、各画分 の脂肪滴蓄積抑制活性を検討した結果、活性はヘキサン可溶性画分に認めら れた。各種クロマトグラフィーにより分離を行い、新規ceramicine E〜Lを ceramicine A〜Dとともに単離した。 Ceramicine E〜Lの構造は、2次元 NMRを中心としたスペクトル解析と化学変換により決定した。 Ceramicine類
は、4環性のテトラノルトリテルベノイド骨格の17位にフラン環を有してお り、A環を含めて様々に酸化状態が異なる構造であると帰属した。相対立体構 造は、NOESY相関により明らかにした。また、 ceramicine Bの絶対構造を、
p−Brベンゾエート体のCDスペクトルの解析（励起子キラリティー法）とX 線結晶解析により決定した。
2）Ceramicine類の脂肪滴蓄積抑制作用
単離した12種類のceramicine A〜Lの脂肪蓄積抑制活性を検討した結果、
ceramicine AとBに強い活性が認められた。1にも僅かな活性があったが、そ の他には認められなかった。Ceramicine Bを脂肪前駆細胞株であるMC3T3−
G2PA6に添加するとコントロールの細胞の形態に殆ど影響を与えず、インス
リンとIBMXとDEXを添加して分化させる過程において脂肪滴の生成を抑制
した。
3）Ceramicine Bの作用機序の解析
主成分であり最も活性の強いceramicine Bの脂肪蓄積抑制作用について、
遺伝子発現を指標として解析したところ、脂肪細胞の分化マーカーである GLUT4 PLP， HSDllβの各mRNA発現の抑制を認めた。さらに、 ceramicine Bは分化誘導を担う遺伝子であるPPARγとC／EBPαの2つの転写因子の遺 伝子発現も抑制し、ウエスタンブロット（WB）法によりPPARγタンパクの発 現も抑制されていることが明らかとなった。
PPARγの転写については、リプレッサーであるFoxo1による制御機構が 知られている。Foxo1は通常PPARγプロモーターに結合し、その転写を抑 えている。インスリンシグナルによるFoxo1のリン酸化は、 Foxo1のPPAR γプロモーターからの解離を促す結果、PPARγ対する各種転写促進シグナ ルのスイッチがONにできるようになる。この抑制解除はインスリンのPI3K からAKTを介するシグナルによってもたらされると考えられている。
Foxo1のリン酸化についてWB法で検討した結果、インスリンを含む分化 誘導剤を添加後、2〜6時間で上昇するFoxo1のリン酸化がceramicine Bの 添加によって抑制された。よって、ceramicine Bによる各種の脂肪細胞関連遺 伝子の発現抑制は、Foxo1のリン酸化の抑制によって生じていることが示唆さ
れた。
以上のように、本研究では8種の新規リモノイド、ceramicine E〜Lを発 見し、各ceramicine類の脂肪滴蓄積抑制効果の検討を行った。また、最も活 性の強いceramicine Bの脂肪滴蓄積抑制作用の作用機序を解明したものであ
る。Ceramicine BはAKTからFoxolの周辺で作用し、 Foxo1のリン酸化を 抑制することにより、PPARγの転写促進シグナルを抑制すると考えられた。
その結果、脂肪細胞の分化が抑制されると考えられる。リモノイドの生物活性 についての報告は、そのほとんどが細胞増殖抑制や抗がん作用であり、脂肪細 胞に対する作用は珍しく興味深い。したがって、抗肥満薬の創薬シーズの探索 の面から価値ある優れた研究成果を含んでおり、博士（薬学）論文に値するも のと判断する。
