ト 脳細胞 及 す 成長促進効果

金沢 大 学十全医 学 会 雑誌 第9 6巻 第3 号 64卜 6 52^ノ く1 98 7J 641

H

d

^{リ 胚}

金 沢 大学 医学 部小 児科 学 講座 く主 任^こ谷^口 昂 教授I

梶 原 荘 平

く昭和^{6 2}年⁵ 月^{2 6}日受付1

He ad a ctiv ato rくH AI ^の中枢 神 経細 胞^に対す る成長 促進 効 果を検 討す る た め^{にニ ワ}ト リ胚 脳細 胞を 用^いてpr e c u r s o r up t^ake，Cy^Clic n u cle otide s の変 化け y^{−a m}in obut yric a cid くG A B Al 濃度， G A B A 結 合 能を in vitr o，in viv oで検 討し た^． 培 養^ニ ワト リ胚脳 細 胞^に おい て H A は 1 0^{−1 O}M で 仁³Hjthymid ine ，

C^3Hju rid in e お よ び亡³Hjle u cin e の取り 込 み を促 進し，中で も仁³Hjthy^mid i^{n e の}取り 込 み は H A 添 加後4 時間よ り増 加し て 8 時 間で添 加 時の 2 0 0％^に達し その促 進 効果は1 4 時 間ま で持 続^{し た． これに}対し B A の 合成ア ナ^ログ で あ る くArg^l，P he⁵トhe ad a ctiv ato r くA H Al は 1 0⁻⁹ M ^で 亡³Hjth_ymi din e の取り 込 み を添 加後6 時 間よ り抑 制し¹4 時間まで持続し た． 同様^の抑制は亡³Hj^{u r}id in e お よ び 亡³Hjle u cin e の取り 込 み にも認め ら れ た． ま たade n o sin e3^，，5^，−m O n Opho sphate くcA M Pl は H A 添 加後4時 間よ り増加し は じ め，

6 時 間で前 借^の 1 7 0％に達し た が，A 王1 A 添 加で は適^に著 明^に低 下し た． 次^にニワ ト リ胚 脳細 胞を用^しYた in vi v oの実験 系^において， 1 0^{−1 0}M のH A を胎 生5 日 な^いし 7 日 に卵 黄 嚢中^に注入 し 1 2 日目に採取し た

脳^にお^いて 亡³Hj^thymi din eの取り 込 み は対照群の 15 0％以 上に増 加し， CA M P ^お よ びg^{u a n o}9^{in e 3}

，

，5^，−

m o n opho sphate くcG M Plも各々対照群^の2 00％以 上， 1 2 0％以 上に増加し た． ま た 1 0^{−1 O}M H A を胎生7 日卵 黄 嚢中^に注入 し 12 日に採 取し た脳^{に お い て，} その シナ プ ト ソ^{ー ム}分 画にお け る G A B A 結合 能は対 照 群の 2 00％以 上に増 加し， さ らに G A B A 含 量も増力ロ傾 向が認め ら れ た． 以上 よ り， H A は 10^{−1 0}M で培 養

ニワト リ胚 脳細 胞^のD N A ， R N A お よ び蛋 白合 成を促 進し， in viv o にお^いて も脳 発 育の初期^に作用 し て D N A 合 成を促 進し， さ らに G A B A ^{ニ ュ ー ロ} ン の成 熟^にも関 与す る可 能性が考え ら れ た^． ま た，CA M P が in vitr o お よ び in viv o において神 経 細胞^の発 育制 禦因子 と し て作用 す る可能 性が 示唆さ れ た．

Key ^{w o r}ds h e ad a ctiv ato r_，く^{A r}g^l， P he⁵1^{−h e ad a ctiv ato r}， p^{r e Cur S Or u}p t^ake_， Cy^Clic n u cle otide s， y^{−a m}in obut y^ric a cid

He ad a ctiv ato r くH Al は 1 9 7 3年Schalle r ら¹りこよ り^ヒド ラ^か ら分 離さjLた 分 子 量 1，124， pG lu⁻Pr o⁻

Pr o⁻G ly^．Gl_y⁻Se r⁻L_ys⁻V al⁻Ile ひLe u⁻P he の ア ミ^ノ酸配 列を有す る ポ リ^ペプ タ イ ド で， その後イ ソ ギンチャ ク や ラット， 牛， ブ タ さ ら^には^ヒトの視床 下 部や腸管に も広く存在して いること が 明 ら^{か に}さ れ た．

2卜⁴Iさ らに

最 近で は^ヒト 血祭 中に2 0 ^へ1 0 0 fm olノml の濃 度で存 在し て^いること が報 告さ れ た^引が， ヒド ラ^{に お い}て は 頭 部発育を促進し問 質細 胞を神経 細胞に分 化誘 導す る 作用 が認め ら れ た^りもの の， 晴 乳動 物では in vitr o で ラ_ット膵臓^からのアミラ ^ー ゼ分泌 を促 進す る作用 が報

告^6Iさ れ て^いる だ けであ り， H A の生理的 役 割， 特^に中 枢 神経 系^{に お} け る作用 は全く解明さ れて いな^い． そこ で著 者は， 中枢 神 経 系^に対す る H A の生理的作用 を研 究す る た めに^ニ ワト リ 胚脳 細 胞を 用^いin vitr o お よ び in vi v oの系^{に お}いてD N A ^．R N A ^．蛋 白合 成， CyClic

n u cle otide sの 経 時 的 変 化， y⁻ア ミ ノ プ チ^ル 酸y⁻

a min obut yric a cid くG A B Al 結 合能お よ び G A B A 含 量^への影 響を検 討し た．

材 料^およ び方法 工．im Yitr o の実 験系

A b br e viatio n s こA H A ，く^Arg^l，P he⁵ト^{he ad a ctiv ato r}三^CA M P，ade n o sin e 3^，，5^，一m O n Opho sp^atei CG M P ，g^{u a n O S}in e 3^，_，5^，．m o n opho sph ate三F C S_，fetal c alfs e r u m 三G A B A， y^{−a m}in obut y^ric a cid_ニ

H A，h_{e a}d a ctiv ato r三M E M ， m Od ified E agl^{e s m ediu m} i P B S，pho sph ate buffer s alin e

1 ^． 培養^{ニ ワ}ト リ胚脳 細 胞の調 整

胎 生1 2 日^ニ ワト リ胚よ り脳を取り出し，ピ^ペ ット を 用^いて脳細 胞を細 分した^．細 胞 分離 後 直ちに1 0％ウシ

胎 児 血 清 くFetal Calf Se r u m ， F C S H G i bc o

Labo r ato rie s，Gr a nd Isla nd， N Yl を含む M odi fied Eagle s Med iu m くM E Ml ほ 水製 薬1 2ml に5 ^Xl O⁵ 細 胞を浮 遊し， 35 m m 径の Falc o n pla stic c ultu r e

d ishくF al c o n P la stic s，Lo s Angels，C Al ^にて培 養を おこなった^． 培 養は 3 r C， 9 5％air ⁻5 ％C O2下で^お こな^い， 培地は培 養3 日目^に交 換し て， 他の 血清 因子 の影 響を最小 限^にす る た めに培 養4 日目^に無 血 清 培 地

に再 交換し， さ ら^に16 時 間 培 養後F C S を含む培 地に

交 換し て H A あるいは その 合 成ア ナ^ロ グ 仏rg^l，

P he⁵l⁻H AくA H Al く北 陸大 学 生 物 薬^品化 学 科橋 本忠 博 士， 佐倉 直 樹 博士 よ り供 与う を添 加して各々の作用 を 検 討し た．な お，細 胞の生存 率は 0^．2％ト リ^{バ ン}プル ^ー

を用^いて検 討し た が， 常 時9 0％以上 の生 存 率を 示 し た^．

2 ^． 亡^3Hコ^thy^mid in e， 亡³Hj^{u r}i din eお よ び 亡³Hコ Ie u cin e の取り 込 み の測定

培 地^に1 0^{−1 2 −}1 0⁻⁹M 王i A あ る^いは 1 0^{−1 2 −}1 0．⁸ M A H A を添加し て経 時 的^に くM ethyl l⁻³Hlthymi din e

く2．O CiJ

I

m m ol， Ne w Engla nd n u cle a r Co rp^．Bo sto n，

M AI， く5⁻³印u ri din eく3 0 C il m m ol， A m e r sha ml Se ale Co rp^．Arling t^{o n} Heigh ^ts，IU ある^いは D L⁻く4，

5⁻³HIle u cin e く3 2 Cilm m ol，Am e r sha mJ^ISe ale Co rp^． Arling^{to n} Heigh ^ts，I Ll を最 終 濃 度が 1 ml あ た り 0^．2 5 あるいは 0^．5_ノ尤i と な る よ うに添 加し た^． 1時 間 培 養 後， 直ち に培 養 細 胞 を水 冷リ ^ン 酸 緩 衝 液 くP ho sphate buffe r s al in e， P B S1 3 mlで3 回洗浄し て培 養皿 よ り 1^ml の P B S 中^に細 胞を浮遊さ せ， 超 音 波^にて細 胞 融 解を お ^こな^った． そのうち 2 0 0直^は

Lo w ry法⁷りこよ る蛋 白 定 量^に使用 し， 残り は 2．4c m

W hatm an G FIC ガ ラス フ ィ ルタ ^ー くポ ア サ イ ズ 1^．2 JLl くWh atm a n Pape rLtd．M ai d^{sto n e}，Engla ndl で吸 引 濾 過し， フ ィ ルタ^ー を脱イ オ^ン水5 ml で 3 回洗 浄 後， シ ンテレ ^一 夕 ^ー くト^{ル エ}ンI L， P O P O P 5 0 mg，

D P O 4 g1 5ml を加え放 射 活 性を 1iq^uid s cintilatio n Spe Ctr Ophoto mete r くBe ckm a n In str u me nts， Palo

A lto， C Al ^にて測 定し た^． 取り 込 み率は ^Cp^ml^mg^． pr otein で表 現し た．

3 ^． 細 胞 内ade n o sin e 3^，，5^，−m O n Opho sph ate

く^cA M Pl ，gu a n O Sin e3^，，5^，．m o n opho sphat_e くcG M Pl

の変 動

1 0^{−1 0}M の H A を添加 あるいは無添 加で培養し， 4，

6 お よび8時 間 日^にお け る細 胞 内cA M P 濃 度の変 化 を検 討し た． さ ら に培 養6時 間 目に 1 0^{．1 0}M の H A あ

る^いは 1 0⁻⁹ M の A H A 添 加^によ る細 胞 内^cA M P お よ びcG M P 濃 度^の変 化を検 討し た． 細 胞は 0．0 2％エ

チ^{レ ン}ジ アミ ン四酢 酸 くE D T Al を含む 0^．1％ト リ プ シ ンで遊 離さ せ，水 冷P B S にて 3 回洗 浄 後，1 mlの水 冷P B S 中^に細 胞を浮 遊さ せ超 音 波 破 搾をお こなっ

た^．そ の う ち 2 0 0声1 を Lo wry 法⁷り^こよ る蛋 白定 量に用

い， 残り は^cA M P あ る^いはcG M P キッ トくヤ^マサ醤 油l ^{にて cA M P あ るいはcG M P の}測 定^に用^いた．

工I^． in YiY O の実験 系 1 ^{． ニ ワ}ト リ 胚脳 細胞^の調 整

図^{1 に}示 す よ う^{に 1}0−^{1 0}M の H A あ る^いは生理的 食 塩 水 く生 食う を胎 生3， 5 ， 7 ， 9 日 の^{ニ ワ}ト リ胚 卵 黄 嚢 中^に注入 し，3 7⁰C の膵 卵 寒 中^に貯 置し て各々胎 生1 0，1 2， 14 日に脳を採 取し， そ れ ぞ れについて亡³机

thymid in e up take と in c o rpo r atio n を検 討し た^． ま た， 1 0^{−1 0}M の H A あるいは生食を胎 生7 日の ^ニワト リ胚 卵 貴 嚢 中^に注入 し， 3 7⁰C の膵 卵 器 中^で膵 置し て 各^々胎 生1 2 日に採取し た脳^{に つ い}て 亡³HjG A B A 結 合 能と G A B A 濃 度を検 討し た^． さ らに1 0^{−1 0}M の

lて岬侶 I 11 くっI t dlI−川1い−1−1 l，

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Fig^．1^． Expe rim e ntal pr oto c ol^．